藍靛果花色苷對高脂血癥大鼠肝臟內(nèi)與膽固醇代謝相關基因的作用

于 偉，張桂芳，甄井龍，宋雪建，遲曉星，王振宇*

藍靛果（Lonicera caerulea）屬忍冬科忍冬屬，是一種多年生灌木，多生長于東北、華北、西北等地區(qū)，不同地區(qū)別名也不同（如黑瞎子果（黑龍江）、狗奶子或羊奶子（黑龍江大興安嶺）、山茄子（黑龍江省七臺河市勃利縣）等），是一種適應性較好的灌木[1-3]。藍靛果富含礦物質(zhì)、氨基酸、多酚及VC等多種對機體有利的活性物質(zhì)；具有抗氧化、抗病毒、抗疲勞、抗炎、抗輻射及改善肝功能等效果，具有極高的藥用價值[1-5]。其果皮富含大量紅色素，可以替代人工合成色素，更加安全健康；其果實多漿汁，種子極小，出汁率高，是制作飲料的極好原料[6-7]。藍靛果在其他方面也有用途，如使用酵母發(fā)酵可使果酒的酸度下降13.2%，因此可以應用于高酸果酒的發(fā)酵[8]。其在模擬體外消化后，總酚含量提高48.2%，花色苷含量下降67.6%，單體花色苷種類減少，氧自由基吸收能力和總抗氧化能力分別降低80.0%和55.6%[9]?；ㄉ盏姆恿u基結構對活性氧等自由基有很強的捕捉能力[10-13]?；ㄉ疹惢衔锿ㄟ^清除自由基，能對自由基誘發(fā)的生物大分子損傷起到保護作用，維持細胞膜的流動性和蛋白質(zhì)的構型構象，具有明顯抑制高血脂、預防心血管病的效果[14-16]。從葡萄中提取的花色苷可以有效地降低膽固醇和低密度脂蛋白水平，預防血栓形成，有助于預防心腦血管疾病的發(fā)生[17]。研究發(fā)現(xiàn)花色苷可使人體總膽固醇含量降低13%～26%，使低密度脂蛋白膽固醇含量降低21%～33%[18]，還可降低肝臟中甘油三酯含量[19]。綜上，藍靛果具有相當廣闊的經(jīng)濟效益，值得開發(fā)利用。

本課題組在前期實驗中發(fā)現(xiàn)藍靛果花色苷可使肝臟丙二醛含量顯著降低，有效減少肝臟過氧化損傷，預防動脈硬化的發(fā)生[2]。目前，在藍靛果花色苷降低高脂血方面的研究雖然較多，但主要集中在血清脂肪酶、肝脂酶、脂代謝酶、超氧化物歧化酶和谷胱甘肽過氧化物酶與肝X受體（liver X receptor α，LXRα）、膽固醇調(diào)節(jié)元件結合蛋白2及三磷酸腺苷結合盒轉運蛋白（ATP-binding cassette transporter，ABC）G5等方面。劉素穩(wěn)[20]證明，藍靛果花色苷能激活過氧化物酶體增殖物激活受體（peroxisome proliferator-activated receptor γ，PPARγ）-LXRa-ABCA1/膽固醇7α-羥化酶（cholesterol 7α-hydroxylase，CYP7a1）信號通路，促進膽固醇流出，加速膽固醇膽汁酸代謝，降低肝臟中的膽固醇含量，減少大鼠體內(nèi)的脂質(zhì)積累，而B族I型清道夫受體（scavenger receptor class B, type I，SR-BI）是介導膽固醇逆轉運的關鍵受體。為研究藍靛果花色苷降低血脂水平及預防動脈硬化的主要途徑及其作用機理，本實驗利用超聲輔助提取等方法從藍靛果中提取藍靛果花色苷，通過體內(nèi)實驗，利用實時熒光定量聚合酶鏈式反應（quantitative real-time polymerase chain reactionm，qPCR）測定藍靛果花色苷對高脂血癥大鼠肝臟組織中LXRα、SB-BI、ABCG5、PPARγ及CYP7a1基因表達的影響，從基因表達水平上闡明藍靛果花色苷對膽固醇代謝相關基因的影響，并闡明藍靛果花色苷對與PPARγ-LXRa-ABCAl/CYP7al信號通路相關基因的作用。

1 材料與方法

1.1 動物、材料與試劑

藍靛果花色苷由黑龍江八一農(nóng)墾大學國家雜糧工程技術研究中心實驗室自制。

2 月齡清潔級雄性Wistar大鼠60 只（許可證編號：SYXK（黑）2011-007） 哈爾濱醫(yī)科大學實驗動物學部；組織RNA提取試劑盒 美國OMEGA公司；焦碳酸二乙酯 上海信帆生物科技有限公司；SYBR Green qPCR試劑盒、逆轉錄試劑盒、培養(yǎng)基、血清、雙抗、胰酶 美國Thermo Scientific公司；異丙醇、無水乙醇、氯仿 國藥集團藥業(yè)股份有限公司；小鼠巨噬細胞RAW264.7 上海北諾生物科技有限公司。

1.2 儀器與設備

7300型qPCR儀 美國ABI公司；TG-16M低溫冷凍離心機 上海盧湘儀離心機儀器有限公司；P2、P10、P20、P100、P200、P1000型移液槍 吉爾森P型移液器公司；K30漩渦振蕩器 上海青浦滬西儀器廠；PRO200電動勻漿機 德國弗魯克公司。

1.3 方法

1.3.1 動物模型及分組

選擇2 月齡，清潔級雄性Wistar大鼠60 只，按體質(zhì)量隨機分成6 組，每組10 只。其中10 只為基礎飼料對照組，給予普通飼料；其余50 只給予高脂飼料（78.8%（質(zhì)量分數(shù)，下同）普通飼料、10.0%豬油、10.0%蛋黃粉、0.2%膽酸鈉、1.0%膽固醇）[21-22]，同時每籠每天添加輔食油渣50 g（約占每只雄鼠飼料攝入量的8%～10%），自由飲食飲水，每10 d稱一次體質(zhì)量。30 d后斷尾取血，測血清總膽固醇（total cholesterol，TC）、甘油三酯（triglyceride，TG）濃度。30 d造模后，實驗性高脂血癥大鼠平均TG濃度（（3.48±1.37）mmol/L）極顯著高于基礎飼料對照組（（1.94±0.53）mmol/L）（P＜0.01）；實驗性高脂血癥大鼠平均TC濃度（（2.42±0.28）mmol/L）顯著高于基礎飼料對照組（（1.70±0.48）mmol/L）（P＜0.05），表明高脂飼料喂養(yǎng)的50 只大鼠均造模成功。將高脂血癥大鼠隨機分為5 組，分別為高脂血癥模型對照組（HFD，灌胃1.2 g/（kg·d）生理鹽水）、陽性對照組（PC，灌胃10 mg/（kg·d）辛伐他汀片）和藍靛果花色苷低（HFD+L）、中（HFD+M）、高（HFD+H）劑量組（分別灌胃4.0、40.0、120.0 mg/（kg·d）藍靛果花色苷），并設置基礎飼料正常對照組（ND，1.2 g/（kg·d）生理鹽水灌胃）[2]。大鼠灌胃5 周后，乙醚麻醉，解剖摘出臟器（心、肝、脾、腎），用手術剪去除結締組織后稱質(zhì)量，以臟器質(zhì)量與體質(zhì)量的百分比為臟器指數(shù)。

1.3.2 qPCR檢測肝臟SR-BI、LXRα、ABCG5、PPARγ及CYP7a1基因表達水平

稱取30 mg肝臟組織，常規(guī)Trizol試劑提取總RNA進行反轉錄，程序為：37 ℃、60 min；85 ℃、5 min；4 ℃、5 min；產(chǎn)物置于－20 ℃保存。將制備好的cDNA進行qPCR擴增，程序為：95 ℃、10 min；95 ℃、15 s；60 ℃、45 s，40 個循環(huán)；95 ℃、15 s；60 ℃、1 min；95 ℃、15 s；60 ℃、15 s。

使用NCBI引物設計工具設計qPCR擴增引物，由上海生工生物技術有限公司合成，具體見表1。

表1 qPCR引物Table 1 Primers of qPCR

1.4 統(tǒng)計學分析

采用SPSS 19.0軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析，實驗數(shù)據(jù)均以 ±s表示，T檢驗進行顯著性分析，以P＜0.05表示差異顯著，以P＜0.01表示差異極顯著。

2 結果與分析

2.1 藍靛果花色苷對高脂血癥大鼠臟器質(zhì)量的影響

表2 大鼠臟器指數(shù)Table 2 The ratio of viscera and body weights of rats%

由表2可以看出，在給予藍靛果花色苷干預后，與ND組相比：藍靛果花色苷各干預組心臟指數(shù)極顯著升高（P＜0.01）；HFD+H組肝臟指數(shù)顯著升高（P＜0.05）；各組大鼠脾臟指數(shù)無明顯變化（P＞0.05）；HFD+H組腎臟指數(shù)顯著升高（P＜0.05）。與HFD組相比：藍靛果花色苷干預各組大鼠脾臟指數(shù)無顯著差異（P＞0.05）；HFD+M組肝臟指數(shù)極顯著降低（P＜0.01），腎臟指數(shù)、心臟指數(shù)顯著降低（P＜0.05）。綜上，與HFD組比，除HFD+M組對高脂血癥大鼠的肝臟指數(shù)、心臟指數(shù)和腎臟指數(shù)有影響外，藍靛果花色苷各干預組對其他臟器指數(shù)幾乎沒有明顯影響。

2.2 藍靛果花色苷對于高脂血癥大鼠肝臟SR-BI、LXRα、ABCG5、PPARγ及CYP7a1 mRNA表達的影響

圖1 藍靛果花色苷對大鼠肝臟組織中SR-BI mRNA表達水平的影響Fig. 1 Effect of L. caerulea anthocyanin on mRNA expression of SR-BI in liver tissues of rats

如圖1所示，經(jīng)藍靛果花色苷干預后，高脂血癥大鼠肝臟中SR-BI mRNA表達水平幾乎不受影響（P＞0.05）。

圖2 藍靛果花色苷對大鼠肝臟組織中LXRα mRNA表達水平的影響Fig. 2 Effect of L. caerulea anthocyanin on mRNA expression of LXRα in liver tissues of rats

如圖2所示，經(jīng)藍靛果花色苷干預后，LXRα mRNA表達水平有所提高，HFD+M組（3.35±1.27）、HFD+H組（3.26±1.34）與ND及HFD組LXRα mRNA表達水平均存在極顯著差異（P＜0.01）；HFD+L組（1.62±0.52）僅與HFD組存在顯著差異（P＜0.05）。綜上，中、高劑量藍靛果花色苷對LXRα mRNA表達水平有明顯提高作用。

如圖3所示，藍靛果花色苷干預對高脂血癥大鼠ABCG5 mRNA表達水平無顯著影響（P＞0.05）。

如圖4所示，藍靛果花色苷干預后，高脂血癥大鼠PPARγ mRNA表達水平明顯降低，HFD+L（0.60±0.20）、HFD+M（0.45±0.32）、HFD+H（0.55±0.52）組與HFD組相比差異極顯著（P＜0.01）。表明藍靛果花色苷各干預組可以極顯著降低高脂血癥大鼠PPARγ mRNA表達水平（P＜0.01）。綜上，藍靛果花色苷對高脂血癥大鼠體內(nèi)與胰島素抵抗（insulin resistance，IR）、2型糖尿病及動脈硬化癥等相關的基因PPARγ的mRNA表達有抑制效果。

圖3 藍靛果花色苷對大鼠肝臟組織中ABCG5 mRNA表達水平的影響Fig. 3 Effect of L. caerulea anthocyanin on mRNA expression of ABCG5 in liver tissues of rats

圖4 藍靛果花色苷對大鼠肝臟組織中PPARγ mRNA表達水平的影響Fig. 4 Effect of L. caerulea anthocyanin on mRNA expression of PPARγ in liver tissues of rats

圖5 藍靛果花色苷對大鼠肝臟組織中CYP7a1 mRNA表達水平的影響Fig. 5 Effect of L. caerulea anthocyanin on mRNA expression of CYP7a1 liver tissues of rats

如圖5所示，在經(jīng)過藍靛果花色苷干預后，高脂血癥大鼠肝臟中CYP7a1 mRNA表達水平顯著增高，與ND組、HFD組相比，HFD+M和HFD+H組均具有極顯著差異（P＜0.01），而HFD+L組差異不顯著（P＞0.05）。表明中、高劑量藍靛果花色苷可以極顯著提升高血脂癥大鼠肝臟中CYP7a1 mRNA表達水平，并且中劑量藍靛果花色苷的提升作用最為明顯。

3 討 論

體內(nèi)核受體（nuclear receptor superfamily，NRs）可以調(diào)節(jié)內(nèi)分泌系統(tǒng)，通過內(nèi)源性和外源性配體物質(zhì)激活調(diào)控靶基因的轉錄，從而達到對繁殖、發(fā)育、代謝和免疫應答的穩(wěn)態(tài)控制[23]。LXRs屬于NRs超家族成員，有LXRα和LXRβ兩種同源亞型，其中LXRα分布廣泛，在肝臟、脂肪和巨噬細胞中表達較多，在大腦內(nèi)也有表達[24-25]。LXRs可以通過調(diào)控ABCG1來調(diào)控膜膽固醇在體內(nèi)的水平[24]，而LXRs的激活可以提高ABCG5及ABCG8的表達，將膽固醇轉移至回腸腔[25]。Hu Yanwei等[26]發(fā)現(xiàn)，LXRα siRNA可以阻止二氫辣椒堿（dihydrocapsaicin，DHC）誘導的ABCA1、ABCG1、ABCG5、SR-B1、LDLR、載脂蛋白A和載脂蛋白E表達提高，但對DHC誘導的PPARγ表達無影響；而PPARγ siRNA使DHC誘導的LXRα表達上調(diào)明顯下降，對PPARγ/LXRα通路的抑制會降低動脈粥樣硬化的發(fā)病率。劉偉治等[27]的研究表明，人LXRα受到LXRα、PPARγ基因的調(diào)節(jié)，人巨噬細胞中的LXRα會發(fā)生自我催化現(xiàn)象，但是鼠中未發(fā)現(xiàn)此類現(xiàn)象。

CYP7a1是膽固醇合成膽汁的限速酶，CYP7a1也是LXRs的靶基因之一，LXRα可以調(diào)節(jié)CYP7a1的表達，影響膽固醇向膽汁酸的轉變[28-29]，CYP7a1的表達升高可以降低血漿膽固醇的含量[30-31]。脂肪分解相關基因CYP7a1能夠將肝臟中的TC以膽汁酸的形式排出體外，從而降低肝臟中TC含量，提高ABCA1的表達[25,32]。LXRα通過調(diào)節(jié)尼曼匹克C1樣蛋白（niemann-pick C1 like 1，NPC1L1）和ABCG5及ABCG8異二聚體的表達，調(diào)節(jié)腸膽固醇吸收[25,32]，肝臟ABCG5及ABCG8水平過高會導致膽汁膽固醇水平升高，甚至達到過飽和[33-36]。申婷婷等[37]的研究發(fā)現(xiàn)，通過對小腸膽固醇吸收、轉化等基因表達的抑制，上調(diào)腸道中促進膽固醇向外排泄基因ABCG5/8表達水平，可以調(diào)節(jié)膽固醇代謝。小腸中ABCG5/8可以調(diào)控膽固醇的吸收，促進膽固醇排向回腸[38-40]。雖然ABCG5和ABCG8可以抑制小腸膽固醇的吸收從而降低血清膽固醇水平，但本實驗中藍靛果花色苷并未對ABCG5基因表達產(chǎn)生影響。

PPARs是一種新型甾體類激素受體，也是配體激活轉錄因子，有PPARα、PPARβ、PPARγ 3 種亞型，PPARs可不同程度地被脂肪酸與其衍生物激活，參加脂質(zhì)代謝調(diào)節(jié)，其中PPARα和PPARγ在脂肪肝和IR的發(fā)生、發(fā)展中存在重要影響[41]。PPARγ mRNA的表達水平與IR呈正相關，而IR是2型糖尿病、肥胖癥、非酒精性脂肪肝炎（non-alcoholic steatohepatitis，NASH）及動脈硬化癥等疾病發(fā)生的病理基礎[42-43]。本實驗結果顯示，藍靛果花色苷可以降低PPARγ mRNA的表達，而劉素穩(wěn)[20]的研究顯示，花色苷提取物可以提高肝臟內(nèi)PPARγ mRNA的表達。Yamauchi等[44]發(fā)現(xiàn)，可通過適度地抑制非酒精性脂肪肝?。╪onalcoholic fatty liver disease，NAFLD）/NASH及IR中PPARγ的活性，抑制前脂肪細胞的分化，減少白色脂肪組織、骨骼肌及肝臟中TG的含量，并增強脂肪酸的氧化程度，改善IR，使肝內(nèi)脂肪變性程度減輕。

SR-BI是介導膽固醇逆轉運的關鍵受體，能夠引起膽固醇的雙向轉運。一方面，SR-BI可以介導外周細胞內(nèi)過剩的游離膽固醇流出，防止游離膽固醇過多堆積造成動脈粥樣硬化；另一方面，SR-BI可以與高密度脂蛋白（high density lipoprotein，HDL）結合，促進肝細胞攝取HDL中的膽固醇，使過剩的膽固醇回到肝臟進行進一步代謝。提高SR-BI基因的表達可以促進膽固醇外流，降低血漿膽固醇水平[45]。綜合來看，PPARγ、LXRα、CYP7a1等基因在膽固醇轉化過程中均起到非常重要的作用。

高脂血癥能夠導致脂肪肝、肝硬化、膽石癥、胰腺炎及動脈粥樣硬化等疾病的發(fā)生，而藍靛果花色苷可以降低TC、TG、低密度脂蛋白膽固醇在血清中的含量，升高高密度脂蛋白膽固醇含量，有效降低肝臟過氧化損傷，預防動脈粥樣硬化的發(fā)生[2]。本實驗結果顯示，藍靛果花色苷對SR-BI及ABCG5 mRNA表達無影響，其通過降低PPARγ mRNA表達水平、提高LXRα及CYP7a1 mRNA表達水平來調(diào)節(jié)高脂血癥大鼠的血脂水平，預防動脈粥樣硬化的發(fā)生。