氨基甲酸乙酯誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞凋亡的分子機(jī)制

劉會(huì)昌，石建新*

氨基甲酸乙酯（ethyl carbamate，EC）又名脲烷，是工業(yè)生產(chǎn)的重要原料，廣泛用于生產(chǎn)農(nóng)藥、熏蒸劑和化妝品，也曾作為安眠和抗腫瘤藥物及止疼藥助溶劑供人們使用。值得注意的是，EC是食品加工過(guò)程中的一種副產(chǎn)物，廣泛存在于發(fā)酵食品中，如白蘭地、黃酒、葡萄酒、面包、醬油和酸奶等，也存在于香煙和空氣污染物中[1]。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，EC具有遺傳毒性、致癌性和免疫毒性，可誘導(dǎo)小鼠、大鼠等嚙齒類動(dòng)物和猴子等靈長(zhǎng)類動(dòng)物的腫瘤發(fā)生[2-4]。因此，EC很可能對(duì)人類也有一定的致癌風(fēng)險(xiǎn)。國(guó)際癌癥研究機(jī)構(gòu)已于2007年將其列為很可能致癌物（2A類）[5]。

之前的EC毒性機(jī)制研究大都是在動(dòng)物中開(kāi)展的，其結(jié)果并不能真實(shí)反映EC對(duì)人體的毒性作用。出于動(dòng)物福利的考慮，人體組織細(xì)胞體外培養(yǎng)技術(shù)越來(lái)越多用于EC對(duì)人類細(xì)胞的毒性研究。目前認(rèn)為，EC對(duì)人體細(xì)胞的毒性主要表現(xiàn)有降低細(xì)胞活性、抑制細(xì)胞增殖、引起細(xì)胞內(nèi)氧化應(yīng)激反應(yīng)、擾亂細(xì)胞周期、誘導(dǎo)線粒體代謝紊亂和細(xì)胞凋亡[6-9]。細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，EC促進(jìn)細(xì)胞內(nèi)活性氧自由基（reactive oxygen species，ROS）積累，對(duì)細(xì)胞內(nèi)生物大分子（蛋白質(zhì)、脂類和核酸等）造成損傷，影響細(xì)胞代謝活動(dòng)[10]。EC能激活細(xì)胞P53代謝通路，激活P21蛋白，抑制細(xì)胞周期蛋白E和Cdk2蛋白的表達(dá)，從而阻礙細(xì)胞從G1期向S期轉(zhuǎn)換，G0期細(xì)胞數(shù)目增多，細(xì)胞由分裂狀態(tài)轉(zhuǎn)向靜息狀態(tài)，從而影響細(xì)胞周期[7]。前期工作發(fā)現(xiàn)，HepG2細(xì)胞可以吸收EC并在體內(nèi)積累，從而導(dǎo)致細(xì)胞凋亡，但EC的毒性機(jī)制并未闡明[6]。本研究在前期研究的基礎(chǔ)上，采用實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（realtime fluorescence quantitative polymerase chain reaction，qPCR）和蛋白免疫印跡技術(shù)檢測(cè)EC（100 mmol/L）處理對(duì)HepG2細(xì)胞凋亡通路基因的影響，進(jìn)一步揭示EC對(duì)人體細(xì)胞的毒性作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

HepG2細(xì)胞（人體肝癌細(xì)胞株），購(gòu)買自中國(guó)科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院細(xì)胞資源中心。

表1 細(xì)胞凋亡相關(guān)基因及其RT-PCR引物序列Table 1 RT-PCR primer sequences for tested apoptosis-related genes

氨基甲酸乙酯 美國(guó)Sigma公司；胎牛血清 法國(guó)Biowest公司；胰酶 上海安普科技有限公司；青霉素-鏈霉素溶液 北京索萊寶生物科技公司；TRIzol Reagent 美國(guó)Invitrogen公司；反轉(zhuǎn)錄試劑盒 寶生物工程（大連）有限公司；Supereal PreMix Plus（SYBR Green）天根生化科技有限公司；NP-40和BCA蛋白質(zhì)量濃度測(cè)定試劑盒 中國(guó)碧云天生物技術(shù)公司；Noxa抗體、IP3R抗體、TNFRSF10D（DcR2）抗體 英國(guó)Abcam公司；IRE1α抗體、Caspase-9抗體、APAF1抗體、Bim抗體、β-Actin抗體 美國(guó)Cell Signaling Technology公司；乙醇、氯仿、異丙醇（均為分析級(jí)） 上海國(guó)藥集團(tuán)有限公司；引物由美國(guó)Life Technology公司合成（表1）。

1.2 儀器與設(shè)備

超凈工作臺(tái) 蘇州施威克環(huán)?？萍加邢薰?；酶標(biāo)儀、高速離心機(jī) 基因有限公司；CO2恒溫培養(yǎng)箱 上海三騰儀器有限公司；LightCycler?480 qPCR儀 瑞士羅氏公司；電泳儀及轉(zhuǎn)膜儀 美國(guó)伯樂(lè)公司。

1.3 方法

1.3.1 細(xì)胞培養(yǎng)與EC處理

采用完全DMEM培養(yǎng)基（含10%胎牛血清和1% 100×青霉素-鏈霉素溶液）培養(yǎng)HepG2細(xì)胞，恒溫培養(yǎng)箱條件設(shè)置為37 ℃、5% CO2。細(xì)胞每周傳代2～3 次。細(xì)胞培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期進(jìn)行藥物處理。將EC溶解在完全培養(yǎng)基（含F(xiàn)BS和雙抗的DMEM培養(yǎng)基）中，EC終濃度為100 mmol/L。對(duì)照組是不加EC的完全培養(yǎng)基。根據(jù)之前研究結(jié)果，藥物處理時(shí)間分別設(shè)置為4 h和12 h。對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組均包含3 個(gè)生物學(xué)重復(fù)，每個(gè)生物學(xué)重復(fù)含3 個(gè)培養(yǎng)孔。

1.3.2 qPCR檢測(cè)細(xì)胞凋亡相關(guān)基因mRNA變化

細(xì)胞處理4 h和12 h后，參照劉瑩等[11]的方法收集細(xì)胞。按照試劑盒說(shuō)明書(shū)用TRIzol法提取細(xì)胞總RNA。采用PrimeScriptTMRT試劑盒反轉(zhuǎn)錄總RNA，反轉(zhuǎn)錄條件為：37 ℃，15 min；85 ℃，5 s。反轉(zhuǎn)錄后的cDNA用于檢測(cè)細(xì)胞凋亡相關(guān)基因的變化，檢測(cè)的凋亡基因名稱及其引物序列見(jiàn)表1。qPCR體系如下（20 μL）：SYBR（2×）10 μL，正、反向引物各0.8 μL，cDNA模板2 μL，ddH2O補(bǔ)足至20 μL。qPCR條件設(shè)置如下：95 ℃10 s，60 ℃ 20 s，72 ℃ 20 s，40 個(gè)循環(huán)。采用相對(duì)定量法2?△△Ct對(duì)基因進(jìn)行相對(duì)定量分析。

1.3.3 蛋白免疫印跡（Western blotting）分析

細(xì)胞處理4 h和12 h后，收集細(xì)胞，用NP-40充分裂解并提取細(xì)胞總蛋白，并用BCA蛋白質(zhì)量濃度測(cè)定試劑盒測(cè)定各個(gè)樣本的蛋白質(zhì)量濃度。將蛋白樣品調(diào)至等質(zhì)量濃度后，每組等量上樣，用含質(zhì)量分?jǐn)?shù)10%十二烷基硫酸鈉的聚丙烯酰胺凝膠進(jìn)行電泳（80 V 40 min；120 V 40 min）分離。采用濕轉(zhuǎn)法將蛋白轉(zhuǎn)至PVDF膜上（轉(zhuǎn)膜條件：300 mA，冰浴0.5～1.5 h，目的蛋白分子質(zhì)量越大時(shí)間越長(zhǎng)）。用含質(zhì)量分?jǐn)?shù)5%脫脂奶粉的TBS-T封閉膜，搖床上室溫1 h。孵育一抗（兔抗1∶1 000）室溫2 h或4 ℃過(guò)夜。洗膜后，孵育二抗（1∶15 000，含熒光的羊抗兔）室溫45 min，TBS-T洗膜后用Odyssey CLx成像系統(tǒng)進(jìn)行拍照。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

Western blotting圖片采用Image J軟件進(jìn)行分析。qPCR和Western blotting結(jié)果采用 ±s表示，并通過(guò)SPSS 22.0軟件進(jìn)行獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)。P＜0.05時(shí)認(rèn)為變化達(dá)到顯著性水平，P＜0.01時(shí)變化達(dá)到極顯著性水平。

2 結(jié)果與分析

2.1 氨基甲酸乙酯對(duì)細(xì)胞凋亡外源通路的影響

圖1 氨基甲酸乙酯對(duì)細(xì)胞凋亡基因mRNA表達(dá)的影響Fig. 1 Effect of EC treatment on mRNA levels of apoptosis-related genes

圖2 氨基甲酸乙酯對(duì)細(xì)胞凋亡蛋白的影響Fig. 2 Effect of EC treatment on protein levels of apoptosis-related genes

死亡受體介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡通路指通過(guò)細(xì)胞表面特定的受體接受胞外信號(hào)誘發(fā)細(xì)胞凋亡的通路。死亡受體以跨膜形式位于細(xì)胞膜表面，胞質(zhì)內(nèi)含有死亡結(jié)構(gòu)域（death domain，DD）。在接受到胞外信號(hào)后聚合成三聚體而活化，與特定的接頭分子結(jié)合，形成死亡誘導(dǎo)信號(hào)復(fù)合體（death-inducing signaling complex，DISC），從而激活下游信號(hào)通路，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡[12]。TNFRSF10D（DcR2）屬于誘騙受體家族，它同樣能夠識(shí)別胞外的死亡信號(hào)，但由于缺乏細(xì)胞質(zhì)DD不能將信號(hào)傳至胞內(nèi)，因而能夠通過(guò)競(jìng)爭(zhēng)配體的方式，抑制死亡受體介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡信號(hào)通路[13-14]。4 h和12 h的EC處理，都能顯著提高HepG2細(xì)胞中TNFRSF10D基因的mRNA和蛋白水平（圖1、2）。因此，推測(cè)EC處理抑制了死亡受體介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡信號(hào)通路。

2.2 氨基甲酸乙酯對(duì)細(xì)胞凋亡內(nèi)源通路的影響

細(xì)胞凋亡的內(nèi)源通路是由線粒體介導(dǎo)的，其中，Bcl-2家族作為細(xì)胞凋亡調(diào)節(jié)因子發(fā)揮了重要作用[15]。在受到外界刺激后，Bcl-2家族成員之間相互作用，誘導(dǎo)線粒體膜去極化，增大線粒體膜通透性，釋放細(xì)胞色素c到細(xì)胞質(zhì)。隨后細(xì)胞色素c與細(xì)胞質(zhì)中的凋亡細(xì)胞蛋白酶激活因子APAF1結(jié)合，形成凋亡復(fù)合體，激活Caspase-9（CASP9），啟動(dòng)Caspase級(jí)聯(lián)反應(yīng)，最終誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[16]。Bim和Noxa屬于Bcl-2家族促凋亡亞家族。有研究報(bào)道它們能夠引發(fā)不同細(xì)胞的凋亡[17]。4 h EC處理后，與對(duì)照組相比，HepG2細(xì)胞中Bim、Noxa、APAF1和CASP9基因mRNA水平和蛋白水平都得到顯著提高（圖1、2），同時(shí)Western blotting結(jié)果顯示活化的Caspase-9片段顯著增加（圖2）。這些結(jié)果表明，4 h EC處理已經(jīng)激活線粒體介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡內(nèi)源通路，盡管此時(shí)細(xì)胞的存活率還沒(méi)有顯著的改變[6]。12 h EC處理后，Bim的mRNA和蛋白水平都得到顯著提高（圖1、2）；Noxa、APAF1和CASP9的mRNA水平得到顯著提高（圖1），但它們的蛋白水平卻得到顯著下調(diào)（圖2）。因此，12 h EC處理后，盡管細(xì)胞凋亡內(nèi)源通路在轉(zhuǎn)錄水平仍處于活化狀態(tài)，但細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞凋亡內(nèi)源通路的蛋白已經(jīng)開(kāi)始發(fā)生降解。綜上所述，EC處理對(duì)細(xì)胞凋亡內(nèi)源通路存在深刻的影響，這可能是EC細(xì)胞毒性的一個(gè)方面。

2.3 氨基甲酸乙酯對(duì)細(xì)胞凋亡內(nèi)質(zhì)網(wǎng)通路的影響

圖3 氨基甲酸乙酯誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞凋亡的可能分子機(jī)制Fig. 3 Potential molecular mechanisms of EC-induced HepG2 cells apoptosis

內(nèi)質(zhì)網(wǎng)引發(fā)細(xì)胞凋亡主要通過(guò)兩個(gè)途徑：一是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)，二是通過(guò)鈣離子介導(dǎo)。IRE1α是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜上的跨膜蛋白，它是UPR近端感受器，能將未折疊蛋白質(zhì)信號(hào)傳入內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜，激活內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)；同時(shí)還能活化細(xì)胞凋亡信號(hào)激酶1（apoptotic-signaling kinase-1，ASK1）促進(jìn)細(xì)胞凋亡[18-19]。肌醇-1,4,5-三磷酸受體（inositol-1,4,5-trisphospate receptor，IP3R）是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中細(xì)胞內(nèi)鈣離子通道家族成員，當(dāng)收到第二信使肌醇-1,4,5-三磷酸的信號(hào)后，調(diào)控內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中鈣離子的釋放。胞質(zhì)中的鈣離子能夠活化鈣依賴性蛋白酶，可直接剪切并激活Caspase-12，引發(fā)細(xì)胞凋亡[19]。4 h EC處理后，HepG2細(xì)胞中IRE1α的mRNA水平顯著提高（圖1），蛋白水平無(wú)顯著變化（圖2）。此外，IP3R的mRNA和蛋白水平均顯著提高（圖1、2）。12 h EC處理后，HepG2細(xì)胞中IRE1α和IP3R的mRNA水平顯著提高，但其蛋白水平顯著下降。這些結(jié)果表明，EC處理可能同時(shí)影響內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)和鈣信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)。因此，EC對(duì)細(xì)胞凋亡的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)通路同樣存在明顯的影響（圖3），這可能是EC細(xì)胞毒性的另一個(gè)方面。

2.4 氨基甲酸乙酯對(duì)細(xì)胞凋亡其他調(diào)控基因的影響

除了上述這些細(xì)胞凋亡通路外，其他一些調(diào)控基因也影響細(xì)胞的凋亡[20-21]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果也發(fā)現(xiàn)，4 h和12 h EC處理后，HepG2細(xì)胞中促存活基因GADD45B、原癌基因Fos和促分裂原活化的蛋白激酶激酶激酶MAP3K14（又稱NIK）的mRNA水平均得到顯著提高（圖1）。因?yàn)檫@些基因能夠調(diào)控細(xì)胞凋亡信號(hào)通路，所以EC處理同樣也可能通過(guò)影響這些基因的表達(dá)來(lái)影響細(xì)胞凋亡（圖3）。

3 討 論

EC對(duì)人體細(xì)胞的毒性及毒性作用機(jī)制至今鮮有報(bào)道。前期研究結(jié)果表明EC的細(xì)胞毒性具有劑量-時(shí)間效應(yīng)[6]。4 h 100 mmol/L EC處理對(duì)HepG2細(xì)胞形態(tài)和細(xì)胞活性均沒(méi)有顯著影響；12 h 100 mmol/L EC處理的HepG2細(xì)胞形態(tài)則出現(xiàn)明顯變化，同時(shí)細(xì)胞活性和死亡率發(fā)生顯著改變[6]。因此，本實(shí)驗(yàn)選取的EC濃度為100 mmol/L，處理時(shí)間為4 h和12 h，意圖通過(guò)檢測(cè)EC處理后細(xì)胞凋亡相關(guān)基因的mRNA和蛋白質(zhì)水平的變化，認(rèn)識(shí)人體細(xì)胞對(duì)EC的早期和晚期生物學(xué)反應(yīng)，并初步探索EC對(duì)HepG2細(xì)胞的毒性機(jī)制。

細(xì)胞凋亡是細(xì)胞在受到內(nèi)外刺激后，為維護(hù)機(jī)體內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定自主發(fā)生的一種程序性死亡。該過(guò)程受到一系列基因的精確調(diào)控。在不同環(huán)境刺激下，通過(guò)激活不同基因的表達(dá)，誘發(fā)不同的信號(hào)通路導(dǎo)致細(xì)胞凋亡[6-7]。目前，外源藥物誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡主要是通過(guò)3條通路來(lái)實(shí)施的：線粒體介導(dǎo)的內(nèi)源通路、死亡受體介導(dǎo)的外源通路和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)信號(hào)通路[16]。本實(shí)驗(yàn)中聚焦上述3個(gè)通路相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄和翻譯水平的變化。

4 h和12 h的EC處理能夠顯著提高誘騙受體TNFRSF10D的mRNA水平和蛋白水平。TNFRSF10D受體通過(guò)與死亡受體競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合胞外死亡配體，從而拮抗死亡受體介導(dǎo)的外源通路，減緩并抑制細(xì)胞凋亡。因此，TNFRSF10D的變化可能是HepG2細(xì)胞對(duì)EC處理的一個(gè)應(yīng)激反應(yīng)。4 h的EC處理顯著提高了線粒體介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡內(nèi)源通路中Bim、Noxa、APAF1和CASP9基因的mRNA水平和蛋白水平，同時(shí)顯著提高了細(xì)胞凋亡內(nèi)質(zhì)網(wǎng)通路中IRE1α和IP3R的mRNA水平及IP3R蛋白水平，表明4 h EC處理已經(jīng)激活細(xì)胞凋亡的內(nèi)源途徑和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)通路，引發(fā)了細(xì)胞凋亡，盡管還沒(méi)有明顯的形態(tài)學(xué)變化。12 h的EC處理同樣顯著提高了這些基因的mRNA水平，并沒(méi)有同樣顯著提高它們的蛋白水平（Bim除外）?？梢?jiàn)，12 h EC處理仍舊通過(guò)激活線粒體通路和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)通路誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。因此，這些細(xì)胞凋亡線粒體通路和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激通路基因可以視作EC處理反應(yīng)的分子標(biāo)志物。細(xì)胞凋亡線粒體通路和細(xì)胞凋亡內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激通路不是孤立的，它們相互影響，相互作用。一方面，Bim作為促細(xì)胞凋亡因子，通過(guò)結(jié)合Bcl-2家族抗凋亡因子，激活線粒體介導(dǎo)的內(nèi)源通路，促進(jìn)細(xì)胞凋亡；另一方面，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激壓力還能夠通過(guò)蛋白磷酸酶2A介導(dǎo)的去磷酸化和CHOP-C/EBPα介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄誘導(dǎo)，激活Bim蛋白引發(fā)細(xì)胞凋亡[22]。此外，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)造成胞質(zhì)鈣離子濃度增高，誘導(dǎo)線粒體膜透性增強(qiáng)，胞質(zhì)內(nèi)細(xì)胞色素c增多，激活線粒體通路促進(jìn)細(xì)胞凋亡[23]；而線粒體內(nèi)Ca2+穩(wěn)態(tài)的失衡又會(huì)引發(fā)線粒體ROS水平上升[24]，反過(guò)來(lái)又加重細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)。EC對(duì)HepG2細(xì)胞的毒性檢測(cè)結(jié)果也證實(shí)線粒體通路和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)通路是相互作用的。

細(xì)胞內(nèi)壓力信號(hào)往往具有雙重作用：一方面，細(xì)胞受到刺激后會(huì)立即激活細(xì)胞內(nèi)生存代謝通路，從而緩沖壓力或修復(fù)損傷；另一方面，當(dāng)細(xì)胞受到的壓力或損傷無(wú)法修復(fù)后，細(xì)胞會(huì)啟動(dòng)一系列的死亡程序，如細(xì)胞凋亡，從而減少細(xì)胞對(duì)機(jī)體的傷害[22]。有研究顯示，高表達(dá)Fos能夠促進(jìn)細(xì)胞凋亡[19]；而GADD45B高表達(dá)能夠通過(guò)抑制MKK4-JNK信號(hào)通路，抑制細(xì)胞凋亡[21]。EC處理一方面通過(guò)促進(jìn)GADD45和誘騙受體DcR2的表達(dá)抑制凋亡的發(fā)生，另一方面又激活細(xì)胞凋亡的內(nèi)源通路和外源通路誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。

值得注意的是，12 h EC處理后HepG2細(xì)胞內(nèi)凋亡相關(guān)基因的蛋白水平除Bim和TNFRSF10D外，其他的都顯著下降（圖2）。據(jù)報(bào)道，細(xì)胞凋亡過(guò)程中Caspase能夠切割翻譯起始因子，從而抑制細(xì)胞蛋白合成[25-26]。在凋亡晚期，細(xì)胞內(nèi)形成凋亡小體，并逐漸降解。因此，細(xì)胞凋亡過(guò)程中蛋白水平不斷下降。有研究表明，Bcl-2家族蛋白是調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡和自噬的中心調(diào)節(jié)因子，僅含BH3域的蛋白（PUMA、Noxa、Nix和Bim等）能夠引發(fā)細(xì)胞自噬或凋亡，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)復(fù)合物（核酸、蛋白質(zhì)等）破壞[27-28]。12 h EC處理后，部分細(xì)胞形態(tài)發(fā)生變化，細(xì)胞存活率低于80%[6]，表明12 h處理的樣品中，20%以上的細(xì)胞已處于凋亡后期，這可能是蛋白水平下降的一個(gè)原因。12 h EC 處理樣品中Bim和TNFRSF10D表達(dá)量沒(méi)有像其他凋亡蛋白一樣顯著下降的真正原因并不清楚。推測(cè)可能有兩個(gè)方面的原因。一方面可能源于它們特殊的作用：Bim和TNFRSF10D都是凋亡調(diào)控蛋白，不同于其他凋亡蛋白；另一方面可能源于它們EC誘導(dǎo)合成速率和降解速率的差異。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)是蛋白質(zhì)合成的場(chǎng)所，EC引起的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)逆境可能導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞蛋白合成受阻。

總之，100 mmol/L EC處理，即使是4 h的短期處理，也能顯著改變HepG2細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞凋亡通路部分基因的mRNA和蛋白水平。細(xì)胞暴露于EC后，一方面會(huì)應(yīng)激，激活細(xì)胞促存活基因和誘騙受體基因，抑制細(xì)胞凋亡，修補(bǔ)損傷；另一方面，當(dāng)EC處理時(shí)間延長(zhǎng)，損傷無(wú)法修復(fù)時(shí)，會(huì)激活細(xì)胞凋亡的內(nèi)外源通路，促進(jìn)細(xì)胞凋亡。人群EC暴露主要來(lái)源于發(fā)酵食品、煙草制品和污染的空氣[1]，但目前尚無(wú)比較全面的人群暴露數(shù)據(jù)。本研究中所用的EC濃度為100 mmol/L[6-7]，遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于實(shí)際生活中人群可能遇到的來(lái)自于發(fā)酵食品的暴露量[29-30]，所以，進(jìn)一步的EC毒性分子機(jī)制研究應(yīng)注意采用結(jié)合更低的EC劑量和更長(zhǎng)的處理時(shí)間。