大豆蛋白與大豆低聚肽對(duì)負(fù)氮平衡老年小鼠表皮創(chuàng)傷感染下的免疫調(diào)節(jié)作用

張 健，李雯暉，趙博雅，李 赫，劉新旗,*，肖 林

大豆蛋白主要由大豆球蛋白和β-伴大豆球蛋白組成，其氨基酸構(gòu)成相對(duì)平衡。大豆低聚肽是指大豆分離蛋白經(jīng)蛋白酶作用或微生物技術(shù)處理后，再經(jīng)過(guò)分離和精制等工藝處理得到的低聚肽混合物，通常含有3～6 個(gè)氨基酸，分子質(zhì)量低于1 000 Da，其中還包括少量游離氨基酸、糖類、水分和灰分等[1-2]。大豆低聚肽的氨基酸組成與大豆蛋白基本相同，具有良好的必需氨基酸平衡性，其氨基酸吸收、轉(zhuǎn)運(yùn)速度均高于含等量氨基酸的蛋白質(zhì)和游離氨基酸[3-6]。大豆低聚肽具有調(diào)節(jié)免疫功能、降血壓、降低膽固醇、改善脂質(zhì)代謝、抗疲勞等功能特性[7-10]，是目前大豆蛋白研究中的一個(gè)熱點(diǎn)。

我國(guó)已經(jīng)步入老齡化社會(huì)，隨著年齡增長(zhǎng)，人體的基礎(chǔ)代謝和消化能力下降，特別是蛋白酶活力下降尤為明顯，蛋白質(zhì)的消化吸收減少引起老年人體內(nèi)“負(fù)氮平衡”[11-12]，最終導(dǎo)致免疫力下降、肌肉萎縮、睡眠障礙等各種老年人常見(jiàn)的健康問(wèn)題。營(yíng)養(yǎng)支持不僅為人體提供熱量、蛋白質(zhì)等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，還直接參與機(jī)體代謝，是人體免疫功能的物質(zhì)基礎(chǔ)[13-14]。免疫營(yíng)養(yǎng)不僅能防止?fàn)I養(yǎng)缺乏，且能通過(guò)特定方式刺激免疫細(xì)胞，增強(qiáng)機(jī)體免疫應(yīng)答，通過(guò)調(diào)控細(xì)胞因子的產(chǎn)生和釋放減輕過(guò)度的炎癥反應(yīng)[15]。

大豆蛋白與大豆低聚肽作為重要的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)影響著動(dòng)物的免疫功能，是維持和調(diào)控動(dòng)物免疫功能的直接參與者。與大豆蛋白相比，大豆低聚肽因?yàn)槠湮湛?、利用率高、氨基酸平衡好等特點(diǎn)，可更好地發(fā)揮免疫營(yíng)養(yǎng)支持作用，更適合解決老年人負(fù)氮平衡以及由此引發(fā)的健康問(wèn)題。目前很少有大豆蛋白與大豆低聚肽對(duì)負(fù)氮平衡狀況下體內(nèi)免疫功能調(diào)節(jié)的報(bào)道，本實(shí)驗(yàn)通過(guò)研究大豆蛋白與大豆低聚肽對(duì)負(fù)氮平衡老年小鼠在金黃色葡萄球菌感染情況下免疫功能的調(diào)節(jié)作用，分析小鼠體液免疫、血清炎癥因子、趨化因子的變化，以及大豆蛋白與大豆低聚肽的作用差異，旨在探索改善負(fù)氮平衡下免疫應(yīng)答的營(yíng)養(yǎng)干預(yù)方法。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物、材料與試劑

SPF級(jí)雄性ICR小鼠（48 只，8 月齡，體質(zhì)量40～50 g）購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，合格證號(hào)：SCXK（京）2012-0001；低蛋白飼料（蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)1.5%）購(gòu)自北京華阜康生物科技股份有限公司，許可證號(hào)：SCXK（京）2014-0008；金黃色葡萄球菌金黃亞種（編號(hào)1.801）購(gòu)自中國(guó)普通微生物菌種保藏管理中心。

大豆蛋白 山東御馨生物科技有限公司；中性蛋白酶、堿性蛋白酶 上海源葉生物科技有限公司；Gel Filtration Calibration kit 美國(guó)GE公司；小鼠免疫球蛋白（immunoglobulin，Ig）M、IgG、IgA試劑盒 北京方程佰金科技有限公司；小鼠白細(xì)胞介素（interleukin，IL）-1β、IL-6、腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）、巨噬細(xì)胞炎性蛋白-2（macrophage inflammatory protein-2，MIP-2）、正常T細(xì)胞表達(dá)與分泌調(diào)節(jié)活化因子（regulated upon activation normal T cell expressed and secreted，RANTES）luminex試劑盒美國(guó)默克公司。

1.2 儀器與設(shè)備

EX623ZH千分之一天平、NVL5100B電子天平上海奧豪斯儀器有限公司；0.2 μm陶瓷微濾膜、超濾膜（截留相對(duì)分子質(zhì)量2×103） 江蘇久吾高科技股份有限公司；LRH-250F生化培養(yǎng)箱 上海一恒科學(xué)儀器有限公司；YXQ-LS-75SII高壓滅菌器、SW-CJ-2FD超凈工作臺(tái) 上海博迅實(shí)業(yè)有限公司；X-30R臺(tái)式高速冷凍離心機(jī) 美國(guó)Beckman公司；AKTA Pure蛋白質(zhì)層析純化系統(tǒng) 美國(guó)GE公司；BIO-PLEX3D新型液相芯片檢測(cè)儀北京雅聯(lián)百得科貿(mào)有限公司；Infinite 200 Pro Nanoquant酶標(biāo)儀 瑞士Tecan公司。

1.3 方法

1.3.1 大豆低聚肽的制備

將大豆蛋白溶于蒸餾水中，使其充分溶解，配制成質(zhì)量分?jǐn)?shù)8%的蛋白溶液，調(diào)pH值至7.0，各加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.1%的1 000 U/g中性蛋白酶和堿性蛋白酶，50 ℃水浴，水解4 h。水解結(jié)束后立即85 ℃滅活15 min，得到低聚肽酶解液。冷卻后40 ℃、0.6 bar通過(guò)復(fù)合膜（陶瓷微濾膜與超濾膜）過(guò)濾提純[16]，得到大豆低聚肽及膜分離副產(chǎn)物。通過(guò)0.12 mbar、－42 ℃真空冷凍干燥30 h得到凍干大豆低聚肽粉末。

1.3.2 大豆蛋白及大豆低聚肽的SDS-PAGE分析

質(zhì)量分?jǐn)?shù)12%分離膠、質(zhì)量分?jǐn)?shù)5%濃縮膠，樣品質(zhì)量濃度約1 μg/μL，上樣量10 μL/孔，電壓80 V條件下進(jìn)行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE），以三色預(yù)染蛋白（分子質(zhì)量為10～180 kDa）為標(biāo)準(zhǔn)蛋白。電泳結(jié)束后，經(jīng)考馬斯亮藍(lán)染色、脫色后分析。

1.3.3 大豆低聚肽的分子質(zhì)量分布

取大豆低聚肽凍干粉制成大豆肽溶液，過(guò)0.22 μm微濾膜。在蛋白質(zhì)層析純化系統(tǒng)中過(guò)Superdex peptide 10/300GL柱，用10 mmol/L Tris-HCl緩沖液，控制恒定流速0.5 mL/min，220 nm波長(zhǎng)處檢測(cè)。

1.3.4 負(fù)氮平衡老年小鼠模型制備

選取8 月齡清潔級(jí)雄性ICR小鼠，單籠飼養(yǎng)，適應(yīng)性飼養(yǎng)一周后，分成普通飼料組（12 只）與低蛋白飼料組（36 只）。普通飼料組飼喂蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)為20%的普通飼料，低蛋白飼料組飼喂蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1.5%的低蛋白飼料，自由采食飲水，飼喂2 周，構(gòu)建負(fù)氮平衡老年小鼠模型。每3 d記錄體質(zhì)量一次，在飼喂2 周后，每組各取5 只小鼠放入代謝籠中飼養(yǎng)，收集小鼠24 h的糞便和尿液樣品，同時(shí)記錄攝食量，測(cè)定糞便和尿液中氮的質(zhì)量以及氮攝入量，同時(shí)對(duì)小鼠進(jìn)行尾尖采血，收集血清樣本，測(cè)定血清中血清總蛋白（total protein，TP）與血清白蛋白（serum albumin，ALB）的質(zhì)量濃度。分別按式（1）、（2）計(jì)算每只小鼠的氮平衡量和蛋白質(zhì)表觀消化率[17-18]。

1.3.5 金黃色葡萄球菌培養(yǎng)

將金黃色葡萄球菌劃線接種于營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基上，37 ℃培養(yǎng)過(guò)夜，挑取單個(gè)菌落，接種至新鮮營(yíng)養(yǎng)肉湯中，37 ℃恒溫?fù)u床100 r/min培養(yǎng)20 h后，平板計(jì)數(shù)法計(jì)算菌液濃度，用營(yíng)養(yǎng)肉湯系列稀釋至菌液濃度約1×108CFU/mL，離心收集菌體，以生理鹽水洗滌懸浮，備用[19]。

1.3.6 小鼠的分組及處理

將48 只小鼠分為4 組，每組12 只，單籠飼養(yǎng)，自由采食飲水，室溫保持（25±1）℃。分別為空白組（飼喂普通飼料的正氮平衡小鼠，灌胃生理鹽水）、模型組（飼喂低蛋白飼料的負(fù)氮平衡小鼠，灌胃生理鹽水）、蛋白組（飼喂低蛋白飼料的負(fù)氮平衡小鼠，灌胃大豆蛋白）、低聚肽組（飼喂低蛋白飼料的負(fù)氮平衡小鼠，灌胃大豆低聚肽），各組灌胃量為0.4 mL，蛋白組與低聚肽組灌胃液體總含氮量相等，以體質(zhì)量計(jì)為650 mg/kg。

將所有小鼠以1%戊巴比妥鈉（80 mg/kg）麻醉后，于小鼠背部手術(shù)區(qū)剪毛，在小鼠背部脊柱兩側(cè)，切除1 cm×1 cm的全層皮膚及皮下組織，破壞肌膜，取金黃色葡萄球菌菌液0.1 mL，均勻涂抹于整個(gè)創(chuàng)面，觀察小鼠創(chuàng)面感染情況[19]。創(chuàng)傷涂抹金黃色葡萄球菌后每日對(duì)小鼠灌胃，每組于連續(xù)灌胃第3天與第7天分別處死6 只小鼠。

1.3.7 小鼠的處死及血清的制備

于灌胃的第3天和第7天小鼠眼球取血后處死，血液置于4 ℃靜置過(guò)夜，3 000 r/min離心15 min，分離上清液得到血清收集于滅菌離心管中，于－70 ℃保存。

1.3.8 小鼠血清免疫因子的測(cè)定

取保存的血清，以酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定法測(cè)定負(fù)氮平衡老年小鼠血清IgM、IgG、IgA質(zhì)量濃度，按照l(shuí)uminex試劑盒要求以流式熒光技術(shù)測(cè)定免疫炎癥因子（IL-1β、IL-6、TNF-α）及趨化因子（MIP-2、RANTES）質(zhì)量濃度。

1.3.9 小鼠股直肌濕質(zhì)量與體質(zhì)量比的測(cè)定

剝離小鼠右腿股直肌肌肉組織，稱其濕質(zhì)量，按式（3）計(jì)算股直肌濕質(zhì)量與體質(zhì)量比。

1.4 數(shù)據(jù)處理

所有數(shù)據(jù)均以 ±s表示。采用SPSS Statistics 22軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。多組均數(shù)進(jìn)行方差齊性檢驗(yàn)和單因素方差分析（ANOVA）和多重比較（Duncan’s法），P＜0.05為差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 大豆低聚肽的SDS-PAGE分析

圖1 大豆蛋白與大豆低聚肽的SDS-PAGE圖譜Fig. 1 SDS-PAGE pattern of soybean protein and soybean oligopeptides

由圖1可知，大豆蛋白經(jīng)復(fù)合酶水解后，酶解產(chǎn)物分子質(zhì)量遠(yuǎn)低于大豆蛋白，酶解產(chǎn)物中主要肽段分子質(zhì)量低于10 kDa，表明大豆蛋白大部分已被酶解為小分子低聚肽。本實(shí)驗(yàn)選用Marker分子質(zhì)量范圍是10～180 kDa，同時(shí)SDS-PAGE凝膠電泳不容易分離分子質(zhì)量在4 kDa以下的小肽，所以酶解液中低于10 kDa的肽段沒(méi)有得到明顯的分離。酶解產(chǎn)物經(jīng)過(guò)復(fù)合膜組合的方式進(jìn)行分離提純，減少大分子肽和未酶解蛋白的混入，得到純度更高的低聚肽。

表1 大豆低聚肽的分子質(zhì)量分布Table 1 Molecular mass distribution of soybean oligopeptides

由表1可知，經(jīng)過(guò)蛋白層析純化系統(tǒng)分析，有85.59%大豆低聚肽分子質(zhì)量分布在150～1 000 Da之間。

2.2 負(fù)氮平衡制備期老年小鼠體質(zhì)量的變化

圖2 負(fù)氮平衡制備期小鼠體質(zhì)量的變化Fig. 2 Change in body mass of mice during negative nitrogen balance

小鼠體質(zhì)量的下降是負(fù)氮平衡的重要生理指標(biāo)之一。實(shí)驗(yàn)期間，兩組小鼠的飼料攝入總量無(wú)顯著差異（P＞0.05），由圖2可知，低蛋白飼料組小鼠的體質(zhì)量明顯下降，從第7天開(kāi)始，低蛋白飼料組小鼠體質(zhì)量顯著低于普通飼料組，且隨時(shí)間延長(zhǎng)差異逐漸增大。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，低蛋白飼料飼喂小鼠可影響其正常的生長(zhǎng)發(fā)育，造成體質(zhì)量降低。研究發(fā)現(xiàn)，給大鼠飼喂低蛋白飼料，會(huì)使低蛋白組大鼠體質(zhì)量顯著低于正常飼料組[20-21]。

2.3 負(fù)氮平衡制備期小鼠氮代謝相關(guān)指標(biāo)的測(cè)定結(jié)果

機(jī)體攝入食物中的含氮營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)經(jīng)消化、吸收與代謝，一部分沉積在體內(nèi)或被利用，合成機(jī)體內(nèi)的蛋白物質(zhì)，另一部分代謝為廢物隨尿等排出，構(gòu)成機(jī)體的氮代謝[22]。氮平衡是評(píng)估蛋白質(zhì)代謝狀況最常用和最有效的指標(biāo)[23]。

表2 第14天小鼠氮代謝相關(guān)指標(biāo)的變化Table 2 Changes in nitrogen metabolism indexes of mice on day 14

由表2可知，在負(fù)氮平衡制備期第14天，普通飼料組小鼠氮代謝呈正氮平衡，而低蛋白飼料組呈負(fù)氮平衡。普通飼料組小鼠蛋白質(zhì)表觀消化率為（81.31±7.00）%，低蛋白飼料組小鼠蛋白質(zhì)表觀消化率為（54.35±4.35）%。兩組小鼠氮平衡與蛋白質(zhì)表觀消化率均有顯著性差異（P＜0.05）。低蛋白飼料組小鼠氮排泄量多于氮攝入量，表明體蛋白合成率相對(duì)減少或降解率相對(duì)增加，體內(nèi)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)、肌肉被過(guò)度消耗，造成體內(nèi)氮平衡處于負(fù)值，并造成體質(zhì)量降低。由于低蛋白飼料組小鼠氮攝入量很少，使得無(wú)氮膳食期的糞代謝氮對(duì)表觀消化率的影響變大，故低蛋白飼料組的蛋白質(zhì)表觀消化率顯著降低。

2.4 負(fù)氮平衡制備期小鼠血清蛋白質(zhì)量濃度的測(cè)定結(jié)果

TP反映機(jī)體的蛋白質(zhì)營(yíng)養(yǎng)狀況及肝臟合成功能等情況。ALB是TP的主要蛋白質(zhì)成分，由肝臟合成。TP、ALB可代表體內(nèi)蛋白質(zhì)代謝及營(yíng)養(yǎng)狀況[24]。ALB半衰期長(zhǎng)，約20 d，且其影響因素較多，可能對(duì)蛋白質(zhì)代謝和營(yíng)養(yǎng)狀況的短期變化不敏感[25]。

表3 第14天小鼠血清蛋白質(zhì)量濃度的變化Table 3 Change in serum proteins of mice on day 14

由表3可知，在負(fù)氮平衡制備期第14天，低蛋白飼料組小鼠TP顯著低于普通飼料組（P＜0.05），且其ALB質(zhì)量濃度低于普通飼料組但差異不顯著（P＞0.05）。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明低蛋白飼料飼養(yǎng)的小鼠體內(nèi)氮代謝發(fā)生改變，由于含氮營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)攝入不足，導(dǎo)致蛋白質(zhì)合成率降低，使體內(nèi)TP質(zhì)量濃度降低。本研究通過(guò)對(duì)老年小鼠飼喂低蛋白飼料制備負(fù)氮平衡老年小鼠模型，通過(guò)2 周低蛋白飼料飼養(yǎng)，對(duì)兩組小鼠的體質(zhì)量、體內(nèi)氮代謝及血清蛋白質(zhì)量濃度進(jìn)行分析，可判斷負(fù)氮平衡老年小鼠模型建立成功。

2.5 大豆蛋白與大豆低聚肽對(duì)小鼠血清免疫球蛋白的影響

血清免疫球蛋白在體液免疫中發(fā)揮重要作用，是介導(dǎo)體液免疫的主要抗體，在一定程度上反映了體液免疫水平[26]。IgM約占抗體總量的5%～10%，因其分子質(zhì)量極大，故僅限在血管內(nèi)運(yùn)行，是初次體液免疫應(yīng)答早期階段產(chǎn)生的主要抗體，具有較強(qiáng)的抗感染作用。IgG是機(jī)體再次體液免疫應(yīng)答產(chǎn)生的主要抗體，是血液中含量最高的一種抗體，在機(jī)體防御機(jī)制中發(fā)揮抗感染作用，約占抗體總量的80%～85%。IgA的含量?jī)H次于IgG，約占抗體總量的10%，是少數(shù)在消化道中不被消化的蛋白質(zhì)之一。IgA在保護(hù)腸道、呼吸道、泌尿生殖道、乳腺和眼睛抵抗微生物入侵方面起關(guān)鍵作用，能凝集顆粒性抗原和中和病毒[27]。

表4 大豆蛋白與大豆低聚肽對(duì)小鼠血清免疫球蛋白的影響（n=6）Table 4 Effect of soybean protein and soybean oligopeptides on serum Ig levels in mice (n= 6)

通常IgM、IgG、IgA這3 類免疫球蛋白水平就可以代表血清免疫球蛋白的總體水平[28]。由表4可知，蛋白組、低聚肽組與模型組相比較，可顯著提高IgM與IgG的質(zhì)量濃度（P＜0.05）；蛋白組、低聚肽組與空白組相比較，可顯著提高IgG的質(zhì)量濃度（P＜0.05），說(shuō)明大豆蛋白和大豆低聚肽的蛋白營(yíng)養(yǎng)補(bǔ)充支持作用可顯著提高負(fù)氮平衡老年小鼠感染后體液免疫功能。在感染第7天，低聚肽組IgG水平顯著高于蛋白組（P＜0.05），低聚肽組IgM與IgA水平高于蛋白組但差異不顯著（P＞0.05），說(shuō)明大豆低聚肽的營(yíng)養(yǎng)補(bǔ)充作用對(duì)負(fù)氮平衡老年小鼠感染后體液免疫的提高優(yōu)于大豆蛋白。張為鵬等[29]在豬飼料中分別補(bǔ)充血漿蛋白粉和植物活性肽，顯著提高了血清中IgG抗體的水平（P＜0.05）。B細(xì)胞在抗原刺激下可分化為漿細(xì)胞，合成和分泌免疫球蛋白，血清免疫球蛋白的變化能及時(shí)反應(yīng)B細(xì)胞的數(shù)量及活性。楊小軍[30]在實(shí)驗(yàn)中對(duì)大鼠灌胃植物源面筋蛋白酶解活性肽，提高了大鼠IgA的水平，顯著提高了血凝抑制效價(jià)，促進(jìn)了大鼠的體液免疫，推測(cè)肽作為B細(xì)胞刺激因子或活化輔助受體而起作用。B細(xì)胞表面有很多受體，肽可能刺激B細(xì)胞，發(fā)生增殖、分化，進(jìn)入激活狀態(tài)，轉(zhuǎn)化為漿細(xì)胞，產(chǎn)生抗體[31]。本研究中大豆蛋白與大豆低聚肽也可能通過(guò)作用于B細(xì)胞膜表面受體，調(diào)節(jié)細(xì)胞活性，從而提高小鼠體液免疫水平。

2.6 大豆蛋白與大豆低聚肽對(duì)小鼠血清炎癥因子的影響

微生物感染的炎癥反應(yīng)的一個(gè)主要特征就是細(xì)胞因子的釋放，這些因子在宿主對(duì)抗感染和炎癥的免疫應(yīng)答中起著重要的作用。在炎癥反應(yīng)過(guò)程中，IL-1β、IL-6和TNF-α的水平會(huì)迅速增加[32]。IL-1β、IL-6和TNF-α的表達(dá)對(duì)免疫系統(tǒng)是必不可少的，但是過(guò)多的分泌會(huì)導(dǎo)致全身的炎癥[33]。

IL-1β對(duì)宿主免疫系統(tǒng)抵抗金黃色葡萄球菌感染時(shí)有顯著的調(diào)節(jié)作用。IL-6在感染過(guò)程中是一種重要的促炎細(xì)胞因子，它與炎癥反應(yīng)中的多種生物效應(yīng)有關(guān)。TNF-α被認(rèn)為是炎癥指標(biāo)中的一個(gè)主要細(xì)胞因子[34]。

表5 大豆蛋白與大豆低聚肽對(duì)小鼠血清炎癥因子的影響Table 5 Effect of soybean protein and soybean oligopeptides on serum inflammation factors in mice

由表5可知，模型組與空白組比較，IL-1β、IL-6和TNF-α 3 種炎癥因子質(zhì)量濃度有不同程度的升高，但差異不顯著（P＞0.05），說(shuō)明模型組小鼠炎癥水平有一定升高；蛋白組、低聚肽組與模型組相比較，3 種炎癥因子質(zhì)量濃度有所降低，但是差異不顯著（P＞0.05），IL-6質(zhì)量濃度降低最為顯著，接近空白組質(zhì)量濃度。對(duì)胃癌術(shù)后患者進(jìn)行腸內(nèi)免疫營(yíng)養(yǎng)干預(yù)，可有效降低炎癥指標(biāo)（IL-1β、IL-6和TNF-α）水平[35]。對(duì)脂代謝紊亂大鼠給予含大豆蛋白飼料，顯著降低了大鼠血清IL-6與TNF-α質(zhì)量濃度[36]。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明灌胃大豆蛋白與大豆低聚肽對(duì)炎癥水平的抑制有積極作用，對(duì)IL-6的抑制作用較為強(qiáng)烈。

2.7 大豆蛋白與大豆低聚肽對(duì)小鼠血清趨化因子的影響

MIP-2是炎癥早期的促炎性細(xì)胞因子，其在炎癥早期的短期急劇釋放可能趨化和激活多種炎癥細(xì)胞，當(dāng)機(jī)體局部有炎癥時(shí)能夠趨化單核細(xì)胞向炎癥部位聚集[37]。RANTES具有遷移細(xì)胞的作用，對(duì)活化T淋巴細(xì)胞、粒細(xì)胞、單核細(xì)胞、自然殺傷細(xì)胞具有趨化和刺激作用，誘導(dǎo)其向炎癥部位浸潤(rùn)，發(fā)揮殺傷作用[38]。

表6 大豆蛋白與大豆低聚肽對(duì)小鼠血清趨化因子的影響Table 6 Effect of soybean protein and soybean oligopeptides on serum chemokines in mice

由表6可知，與空白組比較，低聚肽組MIP-2質(zhì)量濃度顯著降低31.7%（P＜0.05），而蛋白組降低水平不顯著，說(shuō)明大豆低聚肽較大豆蛋白吸收轉(zhuǎn)化速率快，可對(duì)炎癥早期起作用的MIP-2起到良好的抑制作用；蛋白組、低聚肽組與空白組、模型組相比，可顯著降低RANTES水平（P＜0.05），說(shuō)明大豆蛋白與大豆低聚肽的營(yíng)養(yǎng)補(bǔ)充支持作用可有效抑制炎癥趨化因子的生成，降低炎癥水平。蔣莉婭等[39]發(fā)現(xiàn)大鼠降低MIP-2以及MIP-2 mRNA生成水平，可緩解機(jī)體炎癥，保護(hù)大鼠急性胰腺炎早期肺損傷。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明大豆蛋白與大豆低聚肽的營(yíng)養(yǎng)補(bǔ)充作用可顯著抑制MIP-2與RANTES的質(zhì)量濃度，防止過(guò)度的分泌造成組織損傷與過(guò)度炎癥，大豆低聚肽由于吸收速度快，轉(zhuǎn)運(yùn)耗能少，其營(yíng)養(yǎng)補(bǔ)充可在炎癥早期有效抑制過(guò)度的炎癥反應(yīng)。

2.8 大豆蛋白與大豆低聚肽對(duì)小鼠股直肌質(zhì)量的影響

圖3 小鼠股直肌濕質(zhì)量與體質(zhì)量比Fig. 3 Ratio of rectus femoris and body mass in mice

由圖3可知，蛋白組、低聚肽組小鼠的股直肌濕質(zhì)量與體質(zhì)量比均高于模型組與空白組；在感染第3天，蛋白組、低聚肽組股直肌濕質(zhì)量與體質(zhì)量比均顯著高于模型組（P＜0.05），蛋白組與低聚肽組無(wú)顯著差異（P＞0.05）；在感染第7天，低聚肽組股直肌濕質(zhì)量與體質(zhì)量比為3.93，顯著高于蛋白組（2.91）（P＜0.05）。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明大豆蛋白與大豆低聚肽的營(yíng)養(yǎng)補(bǔ)充，可顯著提高股直肌濕質(zhì)量與體質(zhì)量比，改善老年小鼠因負(fù)氮平衡引起的肌肉萎縮狀況，大豆低聚肽由于吸收速度快，利用率高，作用優(yōu)于大豆蛋白。負(fù)氮平衡和炎癥情況會(huì)使骨骼肌中蛋白質(zhì)降解增加，氨基酸進(jìn)入血漿中合成免疫細(xì)胞因子，參與免疫系統(tǒng)的調(diào)節(jié)，機(jī)體將本用于生長(zhǎng)和骨骼肌沉積的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)用于維持體內(nèi)激活的免疫系統(tǒng)，導(dǎo)致骨骼肌分解加速，蛋白質(zhì)合成速度減慢[40]。與大豆蛋白相比，大豆低聚肽因?yàn)樵谀c黏膜上的轉(zhuǎn)運(yùn)載體不易飽和，轉(zhuǎn)運(yùn)能耗低，轉(zhuǎn)運(yùn)速度快[41]，可增強(qiáng)機(jī)體氨基酸吸收代謝，使體蛋白分解代謝減少，增加體氮沉積，緩解肌肉萎縮狀況。

3 結(jié) 論

本研究采用低蛋白飼料飼喂小鼠從而引起小鼠體內(nèi)負(fù)氮平衡狀態(tài)，通過(guò)小鼠體質(zhì)量、體內(nèi)氮平衡、血清蛋白等結(jié)果驗(yàn)證負(fù)氮平衡老年小鼠模型造模成功。對(duì)負(fù)氮平衡老年小鼠進(jìn)行背部創(chuàng)傷感染金黃色葡萄球菌，通過(guò)灌胃大豆蛋白與大豆低聚肽，顯著提高了小鼠血清IgM、IgG、IgA質(zhì)量濃度，降低了血清炎癥因子IL-1β、IL-6、TNF-α的質(zhì)量濃度，降低了血清RANTES、MIP-2質(zhì)量濃度，顯著提高了股直肌質(zhì)量，表明大豆蛋白與大豆低聚肽能提高金黃色葡萄球菌感染下負(fù)氮平衡老年小鼠體液免疫水平，降低其炎癥水平，緩解并恢復(fù)肌肉萎縮狀況，大豆低聚肽較大豆蛋白能更有效地提高體液免疫水平，并在炎癥早期顯著抑制炎癥反應(yīng)，提高短期應(yīng)激能力。