干燥工藝對枇杷花茶感官品質(zhì)的影響及其毒理學(xué)評價

鄭美瑜，李建軍，馮健君，陸勝民,*

枇杷（Eriobotrya japonica Lindl.）系薔薇科植物，是一種具有藥用價值的小型亞熱帶常綠果樹，在我國已經(jīng)有2 200多年的種植歷史，產(chǎn)區(qū)主要分布在浙江、福建、安徽、四川等省區(qū)。枇杷花為枇杷的花蕾及花序，性溫、味淡、清香、帶有甜味，據(jù)《本草綱目》記載，枇杷花“止渴下氣，利肺氣，止吐逆，清上焦熱，潤五臟”[1]。據(jù)報道枇杷花含有黃酮[2]、多酚[3-4]和三萜皂苷[5-6]等活性成分，具有化痰、止咳和清肺等功效[7-8]，有較高的藥用和保健價值[9-10]。枇杷花每個花序上會有80～100 朵花，在枇杷的栽培過程中，為了提高果實的品質(zhì)和產(chǎn)量，要對果樹進(jìn)行疏花，每株會有60%～80%的新鮮花蕾被疏掉[11]，使留下的花所結(jié)的果實有更充分的養(yǎng)分。因此，枇杷花資源來源豐富。枇杷花目前已成為研究熱點，但研究大多集中于對枇杷花中黃酮和三萜酸等功能活性成分的提取方面[12-17]。筆者前期已分析了枇杷花不同花期和不同組織中主要有效成分的含量，以及不同干燥方法對有效成分含量的影響[18]。

目前干燥方法對枇杷花茶感官品質(zhì)影響的研究還較少，蘆艷[19]的研究對比了干炒殺青、微波殺青和蒸汽殺青對枇杷花感官品質(zhì)的影響，但后續(xù)的干燥方法未做研究。本研究通過茶葉感官評審方法對比了在不同干燥方法預(yù)處理下枇杷花茶的固形物形態(tài)、湯色、香氣、滋味等感官品質(zhì)。植物原料中含有的多酚氧化酶（polyphenol oxidase，PPO）和過氧化物酶（peroxidase，POD）會引起干燥過程的酶促褐變[20-21]，影響感官品質(zhì)，為此，在干燥前要進(jìn)行滅酶處理[22-24]。本實驗研究了微波和熱蒸汽兩種處理對枇杷花中兩種酶活力的影響。為了研究枇杷花茶食用安全性，本實驗還對枇杷花進(jìn)行了毒理學(xué)檢驗，以期為枇杷花的加工利用提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

枇杷花購自杭州市余杭區(qū)塘棲西太洋枇杷花研究所。枇杷花的采摘時間為2015年11月8日上午9：00～11：00，采取整個花序，采摘后立即運往浙江省果蔬保鮮與加工技術(shù)研究重點實驗室，并把花序上盛花期的花蕾摘下，用于測定酶活力和進(jìn)行不同的干燥處理。干燥花蕾的水提濃縮液作為毒理學(xué)檢驗樣品，每毫升濃縮液由2.5 g枇杷花茶中提取得到。

實驗動物ICR小鼠（清潔級）由浙江省實驗動物中心提供，實驗動物生產(chǎn)許可證號為SCXK（浙）2014-0001，實驗動物使用許可證為SYXK（浙）2011-0166。

疊氮鈉（NaN3）、敵克松（Dexon）、2-乙酰氨基芴（2-acetamidofluorene，2-AAF）、1,8-二羥基蒽醌（1,8-dihydroxyanthraquinone，1,8-HAQ） 美國Sigma-Aldrich公司。

1.2 儀器與設(shè)備

FD 5308真空冷凍干燥機 韓國SIM公司；DZF-6050型真空干燥箱、DHG-9070A型電熱鼓風(fēng)干燥箱、DK-8D型恒溫水槽 上海精宏儀器設(shè)備有限公司；AL104-1C型電子天平 瑞士Mettler Toledo公司；Color Quest XE色差計 美國Hunter Lab公司。

1.3 方法

1.3.1 枇杷花的預(yù)處理

取枇杷花盛花期的新鮮花蕾，分別在蒸鍋和微波爐（420 W）中進(jìn)行滅酶熱處理75 s，每隔15 s取出，立即測定枇杷花PPO和POD的活力。

1.3.2 粗酶液的提取

準(zhǔn)確稱取盛花期新鮮花蕾或經(jīng)預(yù)處理的花蕾2 g，放入預(yù)冷的研缽中，加入pH 7.0磷酸鹽緩沖液20 mL和少許石英砂低溫研磨，4 ℃、7 000 r/min離心20 min，收集上清液即為粗酶液。

1.3.3 POD活力的測定

根據(jù)卓成龍等[22]的方法并適當(dāng)改進(jìn)，在石英比色皿中依次加入2 mL pH 6.0磷酸鹽緩沖液、1 mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.25%愈創(chuàng)木酚、0.2 mL粗酶液、0.1 mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.75%過氧化氫溶液，迅速混勻，以緩沖液代替粗酶液作為空白，計時3 min，檢測460 nm波長處吸光度的變化，由式（1）計算POD活力。

式中：ΔA460nm為吸光度變化；m為鮮質(zhì)量/g；t為反應(yīng)時間/min；V1為提取粗酶液總體積/mL；Vs為測定時取用酶液體積/mL。

1.3.4 PPO活力的測定

根據(jù)張立彥等[24]的方法并適當(dāng)改進(jìn)，在石英比色皿中加入2 mL pH 5.4的醋酸緩沖液、1 mL 10 mmol/L鄰苯二酚、0.1 mL粗酶液，迅速混勻，以醋酸緩沖液取代粗酶液作為空白管，計時3 min，檢測420 nm波長處的吸光度變化，由式（2）計算PPO活力。

式中：ΔA420nm為吸光度的變化；m為鮮質(zhì)量/g；t為反應(yīng)時間/min；V1為提取粗酶液總體積/mL；Vs為測定時取用酶液體積/mL。

1.3.5 枇杷花的干燥

新鮮的枇杷花經(jīng)滅酶處理后，分別通過冷凍干燥、微波干燥（140、280、420、560、700 W）、真空干燥（40、50、60 ℃）、熱風(fēng)干燥（40、60、80、100 ℃）即得枇杷花茶。冷凍干燥在冷凍干燥機里進(jìn)行。微波干燥過程中每隔1 min，取出揮發(fā)水分和冷卻30 s，再放回直至干燥。真空干燥在真空干燥箱里進(jìn)行，熱風(fēng)干燥過程每隔30 min翻動一次。干燥后的枇杷花茶隨機取適量，用于感官評定和活性成分含量的測定。

1.3.6 枇杷花茶感官評定

根據(jù)GB/T 23776—2009《茶葉感官評審方法》[25]和施兆鵬等[26]的花茶評審方法制定枇杷花茶的感官評分表（表1），隨機挑選10 名非專業(yè)人員作為評審者。將樣品混合均勻，由評審者各取10 g左右枇杷花茶置于白色A4紙上輕微晃動，觀察外形。然后由評審者各取樣品3 g，置于干凈透明玻璃杯中，用150 mL沸水沖泡，靜置5 min，將茶水倒出，觀察湯色，嗅杯中的香氣，品嘗滋味，并依據(jù)表1進(jìn)行打分，以評分的平均分作為統(tǒng)計結(jié)果。

表1 枇杷花茶感官質(zhì)量評分表Table 1 Criteria for sensory evaluation of loquat flowers tea

1.3.7 枇杷花茶湯色澤測定

以上述評審者進(jìn)行感官評定的茶湯測定色澤，L用色差計測定茶湯的L*值（明度值）、a*值（正值表示偏紅，負(fù)值表示偏綠）、b*值（正值表示偏黃，負(fù)值表示偏綠），以蒸餾水作為對照調(diào)零。

1.3.8 枇杷花毒理學(xué)檢驗

1.3.8.1 急性毒性實驗

選用健康、成熟、體質(zhì)量為18～22 g的ICR小鼠20 只，雌雄各半。小鼠灌胃前禁食（不禁水）16 h，按0.2 mL/10 g mb灌胃給予受試液，灌胃1 次，灌胃2 h后自由進(jìn)食。灌胃后連續(xù)觀察7 d，期間觀察并記錄小鼠的一般狀況、中毒表現(xiàn)和死亡情況，記錄實驗期初及期末體質(zhì)量。

1.3.8.2 Ames實驗

選用4 株組氨酸營養(yǎng)缺陷型鼠傷寒沙門氏菌（TA97a、TA98、TA100、TA102），采用平板摻入法，通過多氯聯(lián)苯誘導(dǎo)的大鼠肝勻漿經(jīng)9 000×g離心后取上清液，加NADP及葡萄糖-6-磷酸等輔助因子作為體外代謝活性系統(tǒng)（即S9）。實驗設(shè)20、100、500、2 500、12 500 μg/皿 5 個劑量組，外加空白對照、溶劑對照和陽性對照組（NaN3、Dexon、2-AAF、1,8-HAQ），每種菌株每個測試劑量設(shè)3 皿平行，在添加S9（+S9）和不添加S9（－S9）條件下分別進(jìn)行實驗。重復(fù)實驗一次。

直接計數(shù)培養(yǎng)基上各菌株的回變菌落數(shù)。以計數(shù)培養(yǎng)基上各菌株的回變菌落數(shù)的多少而定，如在背景生長良好條件下，受試物組回變菌落數(shù)增加一倍以上，并有劑量反應(yīng)關(guān)系或至少某一測試點有可重復(fù)的并有統(tǒng)計學(xué)意義的陽性反應(yīng)，即認(rèn)為受試物Ames實驗結(jié)果陽性。

1.3.8.3 小鼠骨髓細(xì)胞微核實驗

小鼠按體質(zhì)量隨機分成5 組，每組10 只，雌雄各半。枇杷花設(shè)2.5、5.0、10.0 g/kg 3 個劑量組，陰性對照組為蒸餾水，陽性對照組為環(huán)磷酰胺（40 mg/kg mb）。小鼠按20 mL/kg mb灌胃，間隔24 h灌胃2 次，于第2次灌胃后6 h脫臼處死。取胸骨骨髓制成骨髓片，甲醇固定，Giemsa染色。鏡檢時每只動物計數(shù)1 000 個嗜多染紅細(xì)胞，計算微核率及嗜多染紅細(xì)胞/成熟紅細(xì)胞（PCE/NCE）個數(shù)比值。

1.3.8.4 小鼠精子畸形實驗

雄性小鼠25 只，隨機分成5 組，每組5 只。枇杷花設(shè)2.5、5.0、10.0 g/kg mb3 個劑量組，陰性對照組為蒸餾水，陽性對照組為絲裂霉素C（1.5 mg/kg mb）。小鼠按20 mL/kg灌胃，連續(xù)5 d，每天一次。于首次灌胃后第35天脫臼處死，取兩側(cè)附睪，制成吸濾液直接涂片，自然干燥，甲醇固定，用1%伊紅染色。高倍鏡下觀察精子形態(tài)并計數(shù)，每只小鼠計數(shù)完整精子1 000 條，計算精子畸形發(fā)生率。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

實驗數(shù)據(jù)以 ±s表示，組間的顯著性分析用單因素方差分析，兩兩比較采用最小顯著差數(shù)法（SNK法），顯著水平為P＜0.05。統(tǒng)計分析通過SPSS Statistics 17.0軟件進(jìn)行。

2 結(jié)果與分析

2.1 枇杷花中POD和PPO活力及熱處理對其的影響

2.1.1 枇杷花不同組織中POD和PPO活力

枇杷花中的POD和PPO會促使枇杷花發(fā)生酶促褐變和氧化，影響外觀顏色和有效成分含量等。由圖1可知，在枇杷花的不同組織中，POD和PPO活力大小順序均為花瓣＞花蕊＞花萼，且彼此間存在顯著差異（P＜0.05），而花瓣中的總酚含量最高[18]，據(jù)研究報道，總酚含量、POD和PPO活力與褐變具有顯著相關(guān)性[20]，因此花瓣最易發(fā)生褐變，這與實際情況是相符的，枇杷花貯藏過程中，花瓣部分非常容易變色，因此，干燥前需對枇杷花進(jìn)行滅酶預(yù)處理。

圖1 枇杷花不同組織中POD（A）和PPO（B）的活力（n＝ 3）Fig. 1 POD (A) and PPO (B) activities in different tissues of loquat flower (n = 3)

2.1.2 熱蒸汽和微波處理對枇杷花POD和PPO活力的影響

圖2 處理時間對枇杷花POD（A）和PPO（B）活力的影響Fig. 2 Effect of treatment time on POD (A) and PPO (B) activities

由圖2可以看出，蒸汽處理和微波處理都可以有效地抑制枇杷花中POD和PPO的活力。在處理時間短于45 s時，POD和PPO活力下降較快，在45～75 s內(nèi)活力降低較為緩慢。分別用兩種方式處理75 s后，POD和PPO活力均降低到原始酶活力5%以下。卓成龍等[22]研究表明，700 W微波處理毛豆仁85 s可以使POD活力降低到5%以下，比傳統(tǒng)的熱水處理效率高，且VC、葉綠素等成分損失率小。

2.2 不同干燥處理對枇杷花茶感官品質(zhì)的影響

表2 不同干燥處理的枇杷花茶感官品質(zhì)評分（n＝10）Table 2 Sensory quality scores of loquat flower tea produced by different drying treatments (n= 10)

10 名評審者根據(jù)表1評分標(biāo)準(zhǔn)對不同干燥條件得到的枇杷花茶進(jìn)行了評分，將平均分乘以權(quán)重因子，結(jié)果如表2所示。在形態(tài)上，真空冷凍的枇杷花形態(tài)最好，花瓣基本無皺縮，顏色保持了枇杷花的白色；微波干燥和真空干燥在功率或溫度較低時，形態(tài)較好，當(dāng)功率或溫度較高時，枇杷花皺縮嚴(yán)重，有局部焦糊現(xiàn)象，使花瓣變色色澤變黃；而熱風(fēng)干燥時，溫度較高時形態(tài)較好，可能因為溫度較高時，干燥時間較短，因而形態(tài)保持較好。

在湯色方面，幾種干燥方法得到的枇杷花茶湯都呈淡黃色，且亮度較高，因此獲得的評分都較高。

在香氣上，微波280 W和420 W干燥制得的樣品茶湯香氣最好，香氣濃郁、純正，可能是因為微波干燥時間短，而且微波使枇杷花中部分氨基酸發(fā)生美拉德反應(yīng)，但功率較高時會產(chǎn)生焦糊味，香氣不純正；真空冷凍干燥基本保持了枇杷花的天然香氣，但氣味偏淡，其他兩種干燥方法由于干燥時間長，香氣物質(zhì)損失較多。

在滋味上，枇杷花茶湯中酚類物質(zhì)呈澀味，氨基酸呈鮮味，咖啡堿呈苦味，3 類物質(zhì)共同構(gòu)成茶湯的滋味，所以幾種干燥方法中，冷凍干燥、微波280、420 W和真空干燥50 ℃條件下制得的樣品茶湯醇和、鮮爽，獲得較高的評分，可能與干燥方法對這3 種物質(zhì)的影響有關(guān)。

在綜合得分上，以真空冷凍的最高，其他3種干燥方法都以處于中間的干燥條件最高，如微波420 W、真空50 ℃和熱風(fēng)80 ℃時為最高。

綜上所述，幾種干燥方法對枇杷花感官品質(zhì)的影響不同，冷凍干燥的感官品質(zhì)最高，微波干燥次之，在實際生產(chǎn)中，可以根據(jù)需要和生產(chǎn)條件來選擇干燥方法。董娟娥等[27]研究了不同干燥方法對杜仲雄花茶品質(zhì)的影響，結(jié)果表明，炒制干燥所得的雄花茶感官指標(biāo)得分較低，熱風(fēng)干燥和微波干燥的得分均較高。高溫?zé)犸L(fēng)和微波420 W處理4 min、560 W處理3 min得分顯著高于其他處理，這與本實驗結(jié)果是基本相符的。

2.3 不同干燥處理對枇杷花茶湯色澤的影響

表3 不同干燥處理對枇杷花茶湯色澤的影響（n＝10）Table 3 Effect of drying treatment on color difference of loquat flower tea infusion (n= 10)

由表3可知，表中真空冷凍干燥的L*值最大，表明亮度最高，而真空和熱風(fēng)干燥由于干燥過程中發(fā)生褐變和美拉德反應(yīng)，致使茶湯L*值較低。a*值為負(fù)表示茶湯顏色偏綠絕對值越大顏色越深。b*值為正表明顏色偏黃，值越大表明黃度值越大。茶湯b*值的差異可能是因為干燥方法對黃酮的影響不同。各干燥方法對茶湯色澤的影響基本與它們對活性成分含量的影響一致[18]。

2.4 枇杷花毒理學(xué)評價

2.4.1 急性毒性實驗結(jié)果

表4 枇杷花急性毒性實驗小鼠死亡情況Table 4 Acute oral toxicity of loquat flower tea in mice

灌胃給予受試物后，雌雄小鼠均未見明顯的中毒癥狀，14 d內(nèi)動物無死亡（表4）。枇杷花對雌雄小鼠經(jīng)口急性毒性半致死濃度（median lethal dose，LD50）均大于20.0 g/kg mb。根據(jù)急性毒性劑量分級表分級，枇杷花屬于無毒類。

2.4.2 Ames實驗結(jié)果

表5 枇杷花Ames實驗結(jié)果（n＝3）Table 5 Ames test of loquat flower tea (n= 3)

表6 枇杷花Ames實驗重復(fù)實驗結(jié)果（n＝3）Table 6 Results of replicate Ames test of loquat flower (n= 3)

由表5、6可知，不同濃度受試物在加和不加S9條件下的回變菌落與空白對照組、溶劑對照組相近似，而陽性對照回變菌落數(shù)均高于空白對照組、溶劑對照組和受試物組的回變菌落數(shù)2 倍以上。表明在該實驗條件下枇杷花沒有致突變作用。

2.4.3 小鼠骨髓細(xì)胞微核實驗結(jié)果

表7 枇杷花對小鼠骨髓細(xì)胞微核率的影響（n＝10）Table 7 Effect of loquat flower tea on mouse micronuclei frequency (n= 10)

由表7可知，雌雄各劑量組PCE/NCE比值不低于對照組的20%，符合技術(shù)規(guī)范要求。由方差分析結(jié)果可知，枇杷花各劑量組與陰性對照組相比，微核率均無顯著差異，而陽性對照組微核率則極顯著高于陰性對照組（P＜0.01）。表明枇杷花對小鼠骨髓嗜多染紅細(xì)胞微核率未見明顯影響，檢測結(jié)果為陰性。

2.4.4 小鼠精子畸形實驗結(jié)果

表8 枇杷花對小鼠精子畸形發(fā)生率的影響（n＝5）Table 8 Effect of loquat flower tea on sperm malformation rate in mice (n= 5)

由表8可知，各劑量組與陰性對照組比較，小鼠精子畸形發(fā)生率均無顯著性差異，而陽性對照組則極顯著高于陰性對照組（P＜0.01），檢測結(jié)果為陰性，表明枇杷花對小鼠精子畸形發(fā)生率未產(chǎn)生明顯影響。

3 結(jié) 論

由研究結(jié)果可知，蒸汽和微波處理可以殺滅枇杷花中的PPO和POD兩種酶，從而減少了后續(xù)干燥過程中的酶促褐變和氧化。幾種干燥工藝中，冷凍干燥的枇杷花感官品質(zhì)最好，微波干燥次之，其中微波在420 W功率下干燥的品質(zhì)最好，真空干燥和熱風(fēng)干燥的感官品質(zhì)差別不大，熱風(fēng)干燥在80 ℃時干燥品質(zhì)較好。在生產(chǎn)中可以根據(jù)設(shè)備條件選擇干燥方法。

毒理學(xué)檢驗表明，急毒實驗表明枇杷花屬無毒類，小鼠經(jīng)口最大耐受劑量大于20.0 g/kg mb；小鼠遺傳毒性實驗（Ames實驗、骨髓嗜多染紅細(xì)胞微核實驗、精子畸形實驗）結(jié)果均為陰性。本研究結(jié)果為今后枇杷花茶的加工和保健功能的開發(fā)研制提供了科學(xué)依據(jù)。

近年來，對枇杷花的應(yīng)用逐漸升溫，并向食品方面發(fā)展，如枇杷花飲料[28-29]、枇杷花茶[30-31]等。本實驗在毒理學(xué)上證明枇杷花屬無毒類的原料，可以為其提供安全性的佐證。今后，隨著枇杷花中活性成分的明晰、功能活性的明確，以及安全性的保證，其將會在食品和保健品中進(jìn)一步得到應(yīng)用。