赤霉素拉穗處理對(duì)西拉葡萄果實(shí)酚類物質(zhì)的影響

劉迪迪，劉美迎，王 珍，謝 沙，梁 攀，張振文,2,*

酚類物質(zhì)是苯環(huán)上連有一個(gè)或多個(gè)羥基的小分子有機(jī)物，廣泛分布于植物體的各個(gè)器官中。葡萄果實(shí)中酚類物質(zhì)主要集中在葡萄果皮和葡萄籽中，分為花色苷和非花色苷兩類，其中花色苷類物質(zhì)包括花青素、花翠素、甲基花青素、甲基花翠素、二甲花翠素及其衍生物等，而非花色苷類物質(zhì)是指除花色苷以外的酚類，主要包括酚酸類（苯甲酸類、肉桂酸類）、黃酮類（黃烷酮類、黃酮醇類）、黃烷-3-醇類以及一些特殊的酚類物質(zhì)如白藜蘆醇等[1-4]。葡萄中酚類物質(zhì)通過浸漬作用進(jìn)入到葡萄酒中，是葡萄酒的重要組成成分，其含量和比例對(duì)葡萄酒的感官品質(zhì)，尤其是對(duì)葡萄酒的顏色、收斂性[5-7]、澄清度和穩(wěn)定性等有著重要的作用[8-9]。此外，酚類物質(zhì)是葡萄酒發(fā)揮保健功效的重要成分，葡萄酒中的多酚物質(zhì)能夠消除人體內(nèi)自由基，降低心腦血管疾病的發(fā)生率，具有抗氧化、抗衰老的功效[10-13]。

影響葡萄果實(shí)酚類物質(zhì)合成的因素可以分為內(nèi)部因素和外部因素，內(nèi)部因素包括品種、成熟度、樹齡、內(nèi)源激素等[14-15]，外部因素則包括光照、溫度、土壤、栽培技術(shù)、外源激素等[16-17]；其中外源激素中的赤霉素作為植物生長發(fā)育的重要激素之一，能調(diào)控植物的生長發(fā)育過程，能夠打破種子休眠，促進(jìn)莖的伸展、葉片生長、芽的萌發(fā)、果實(shí)發(fā)育，防止落花落果，進(jìn)行果粒膨大等[18-19]。研究發(fā)現(xiàn)，通過一定濃度的赤霉素蘸穗處理可以拉長果穗長度、疏松果穗[20]。山西臨汾地區(qū)西拉葡萄果穗過于緊密，果穗內(nèi)部果粒顏色較淺或青綠，酚類物質(zhì)含量低，而赤霉素拉穗處理能有效改善葡萄果穗過于緊密的缺陷。由于國內(nèi)外關(guān)于赤霉素處理對(duì)葡萄果實(shí)酚類物質(zhì)影響的報(bào)道并不多見，本實(shí)驗(yàn)在不同時(shí)期，以不同質(zhì)量濃度的赤霉素蘸穗處理葡萄果實(shí)，研究赤霉素拉穗處理對(duì)釀酒葡萄酚類物質(zhì)組分和含量的影響，以期總結(jié)提升葡萄果實(shí)酚類物質(zhì)含量的適宜赤霉素處理方法，從而為提高釀酒葡萄果實(shí)品質(zhì)提供理論依據(jù)，也對(duì)赤霉素處理在釀酒葡萄上的應(yīng)用可行性進(jìn)行驗(yàn)證。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

本實(shí)驗(yàn)在山西省臨汾市堯京酒莊進(jìn)行，選用歐亞種釀酒葡萄西拉（Vitis vinifera L. cv. Syrah）。2012年定植，東西行向，斜拉“廠”字型單籬架，株行距1 m×3 m，嫁接砧木為5BB，半機(jī)械化管理。

花色苷、非花色苷單體酚類物質(zhì)（簡(jiǎn)稱單體酚）標(biāo)準(zhǔn)品（均為色譜純） 美國Sigma公司；乙腈、甲醇（均為色譜純） 上海陸忠化學(xué)試劑廠。

1.2 儀器與設(shè)備

1200系列液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀、1100 KC/MSD離子阱高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀、Zorbax SB C18色譜柱美國Agilent公司；FD5-2.5冷凍干燥機(jī) 美國GOLD-SIM公司；CentriVap 78100-40離心濃縮系統(tǒng) 美國LABCONCO公司；5804R低溫冷凍離心機(jī) 德國Eppendorf公司。

1.3 方法

1.3.1 赤霉素處理

實(shí)驗(yàn)于2015、2016年分別進(jìn)行，兩年處理方式一致，分別設(shè)置6 個(gè)處理組，1 個(gè)對(duì)照（CK）組。處理組即于當(dāng)年葡萄開花期（2015年葡萄開花期為5月15日，2016年葡萄開花期為5月18日）前20 d和前15 d分別進(jìn)行赤霉素蘸穗處理，赤霉素質(zhì)量濃度分別為3、5、7 mg/L，處理編號(hào)分別為15CK、15LS203、15LS205、15LS207、15LS153、15LS155、15LS157和16CK、16LS203、16LS205、16LS207、16LS153、16LS155、16LS157。以編號(hào)15LS203為例：15表示為2015年，LS表示拉穗處理，20為開花前20 d，3為赤霉素質(zhì)量濃度為3 mg/L，即編號(hào)為15LS203的處理組表示2015年葡萄開花前20 d用3 mg/L的赤霉素處理葡萄果穗；CK組未用赤霉素處理葡萄果穗。

處理時(shí)將葡萄花序迅速全部浸入赤霉素溶液中，計(jì)時(shí)2 s快速拿出，每個(gè)處理組150 穗（設(shè)3 個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)50 穗），共計(jì)900 穗，葡萄成熟后每個(gè)處理組隨機(jī)采樣30 穗，迅速用冰盒帶回實(shí)驗(yàn)室，－80 ℃冰箱保存。

1.3.2 不同指標(biāo)測(cè)定

1.3.2.1 果穗長度

果穗長度采用刻度尺測(cè)量，葡萄平放于白紙上，拉直后記錄果穗最上端和最下端距離作為葡萄果穗長度，每個(gè)處理組包含3 個(gè)平行，每個(gè)平行測(cè)10 穗果穗長度。

1.3.2.2 葡萄果實(shí)還原糖、總酸質(zhì)量濃度的測(cè)定

葡萄果實(shí)擠破揉碎后，取上清液測(cè)還原糖和總酸的質(zhì)量濃度。還原糖質(zhì)量濃度的測(cè)定采用菲林A、B滴定法?？偹豳|(zhì)量濃度的測(cè)定采用酸堿滴定法，以酒石酸計(jì)[21]。葡萄成熟度為還原糖和總酸質(zhì)量濃度的比值。

1.3.2.3 葡萄果皮花色苷單體酚類物質(zhì)的測(cè)定

葡萄果皮干粉制備：隨機(jī)選取200 粒葡萄，冷凍狀態(tài)下迅速將果皮與果肉分離，葡萄果皮液氮冷凍打粉，置于冷凍干燥機(jī)凍干24 h后備用。葡萄果皮干粉稱樣0.5 g，放于離心管中，加入10 mL甲酸-甲醇（甲酸體積分?jǐn)?shù)2%）溶液，超聲提取10 min（溫度30 ℃、功率40 Hz），25 ℃下?lián)u床（150 r/min）避光提取30 min，然后以8 000 r/min低溫離心10 min，收集上清液于50 mL離心管，重復(fù)以上提取操作3 次，于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀中蒸干（30 ℃），再用流動(dòng)相（A相為V（水）∶V（甲酸）∶V（乙腈）＝92∶2∶6，B相為V（水）∶V（甲酸）∶V（乙腈）＝44∶2∶54）按A、B相體積比9∶1定容至10 mL，－80 ℃下保存待測(cè)。

采用配有二極管陣列檢測(cè)器的液相色譜離子阱質(zhì)譜聯(lián)用儀進(jìn)行花色苷含量的檢測(cè)，配備電噴霧離子源和離子阱質(zhì)譜檢測(cè)器，所有部件均由Agilent v.5.2化學(xué)工作站控制。色譜條件如下：色譜柱采用Zorbax Eclipse SB C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）柱。洗脫程序：0～18 min，10%～25% B；18～20 min，25% B；20～30 min，25%～40% B；30～35 min，40%～70% B；35～40 min，70%～100% B；流速1.0 mL/min，柱溫50 ℃，檢測(cè)波長525 nm，波長掃描范圍200～900 nm，進(jìn)樣量30 μL。質(zhì)譜采用電噴霧離子源，正離子模式，離子掃描范圍m/z 100～1 500，霧化器壓力0.24 MPa，干燥氣流速10 L/min，干燥氣溫度350 ℃。對(duì)照標(biāo)準(zhǔn)品保留時(shí)間進(jìn)行定性，外標(biāo)法定量。

1.3.2.4 葡萄皮單體酚含量測(cè)定

稱取1.3.2.3節(jié)制得的葡萄干粉2 g，加入5 mL蒸餾水和45 mL乙酸乙酯于錐形瓶中，25 ℃下?lián)u床（150 r/min）避光提取30 min，轉(zhuǎn)移上清液于250 mL圓底燒瓶，重復(fù)4 次，離心、蒸干（溫度33 ℃），用甲醇定容至2 mL，－80 ℃下保存待測(cè)。

采用高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀分析標(biāo)準(zhǔn)品和葡萄皮提取物中的單體酚。色譜條件：色譜柱為Zorbax SB C18（50 mm×3 mm，5 μm）柱；柱溫25 ℃；進(jìn)樣量10 μL，檢測(cè)波長280 nm。流動(dòng)相A：1.0%（體積分?jǐn)?shù)，下同）的醋酸-水溶液；流動(dòng)相B：1.0%醋酸-甲醇溶液，流速1.0 mL/min。梯度洗脫：0～15 min，l0%～26% B；30～50 min，40%～65% B；50～60 min，65%～95% B；60～63 min，95%～10% B；63～66 min，10% B。電噴霧離子源，負(fù)離子模式；霧化器壓力0.21 MPa；干燥氣流速為10 mL/min；干燥氣溫度325 ℃；離子掃描范圍為m/z 100～1 500；誘導(dǎo)碰撞電壓1.0 V。通過對(duì)照標(biāo)準(zhǔn)品離子碎片、保留時(shí)間進(jìn)行定性，采用外標(biāo)法定量。

1.4 數(shù)據(jù)處理分析

利用Excel 2016軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行整理；數(shù)據(jù)處理采用SPSS 20.0軟件，利用獨(dú)立樣本T檢驗(yàn)在P＜0.05水平下，采用Duncan新復(fù)極差法進(jìn)行顯著性分析；利用Origin 2016軟件進(jìn)行圖表繪制。

2 結(jié)果與分析

2.1 赤霉素處理對(duì)葡萄果穗長度的影響

果穗拉長可疏松葡萄果穗，增加果穗內(nèi)部果粒的光照，有利于葡萄著色和酚類物質(zhì)的生成[22-23]。如圖1所示，赤霉素蘸穗對(duì)葡萄果穗的伸長具有顯著的促進(jìn)作用。2015年葡萄果穗長度平均增加8.57%，其中15LS207與對(duì)照組相比果穗長度增加16.09%，拉長效果為當(dāng)年最好；2016年葡萄果穗長度平均增加達(dá)6.63%，其中16LS157果穗拉長效果最好，與對(duì)照組相比果穗長度增加14.20%。

圖1 不同赤霉素處理葡萄果穗長度的變化Fig. 1 Change in grape cluster length in different gibberellin treatments

2.2 赤霉素處理對(duì)葡萄還原糖、總酸質(zhì)量濃度的影響

圖2 不同赤霉素處理對(duì)葡萄還原糖、總酸質(zhì)量濃度的影響Fig. 2 Effects of different gibberellin treatments on reducing sugar and total acid contents in grapes

如圖2所示，赤霉素拉穗處理可提升葡萄果實(shí)還原糖質(zhì)量濃度、降低總酸質(zhì)量濃度，葡萄成熟度都有提升。2015年和2016年赤霉素處理組的平均還原糖質(zhì)量濃度分別為225.90 g/L和236.95 g/L，與對(duì)照組相比分別提升了5.63%、11.27%，其中還原糖質(zhì)量濃度最高的處理組分別為2015年的15LS155（231.84 g/L）、2016年的16LS157（244.14 g/L），分別較當(dāng)年對(duì)照組提高了8.39%和14.62%。赤霉素處理能降低葡萄果實(shí)的總酸質(zhì)量濃度，兩年赤霉素處理組平均總酸質(zhì)量濃度分別為5.96 g/L和5.46 g/L，與對(duì)照組相比總酸質(zhì)量濃度分別降低了8.45%、14.55%，兩年總酸質(zhì)量濃度最低的處理組分別為2015年的15LS155（5.69 g/L）、2016年的16LS157（5.21 g/L），分別較當(dāng)年對(duì)照組降低了12.60%和18.46%。

2.3 赤霉素處理對(duì)葡萄皮單體花色苷含量的影響

表1 2015年不同赤霉素處理對(duì)葡萄皮單體花色苷含量的影響Table 1 Effects of different gibberellin treatments on anthocyanin contents in grapes grown in 2015 μg/g

表2 2016年不同赤霉素處理對(duì)葡萄皮單體花色苷含量的影響Table 2 Effects of different gibberellin treatments on anthocyanin contents in grapes grown in 2016 μg/g

如表1、2所示，共檢測(cè)到9 種單體花色苷，包括5 種基本花色苷（非?；ㄉ眨┖? 種?；ㄉ?，其中二甲花翠素-3-葡萄糖苷及其乙酰化合物、二甲花翠素-3-香豆?；?葡萄糖苷占比較大。兩年數(shù)據(jù)顯示赤霉素處理對(duì)葡萄皮單體花色苷總量有較大的提升作用。2015年和2016年赤霉素處理組葡萄皮單體花色苷平均總量分別提高了23.44%和41.28%，兩年均為LS207處理組的效果最明顯，分別提升38.39%和66.29%。此外，兩年中均以LS207、LS205、LS157 3 個(gè)處理組對(duì)葡萄皮二甲花翠素類花色苷含量的提高效果顯著。綜合來看，赤霉素處理能夠提高葡萄皮的花色苷含量，質(zhì)量濃度在3～7 mg/L的范圍內(nèi)隨著赤霉素使用量的增加花色苷的含量也隨之增大，且開花前20 d處理組單體花色苷提升量較開花前15 d處理組提升量高。

圖3為赤霉素處理對(duì)葡萄皮單體花色苷含量和比例的影響。2015年數(shù)據(jù)顯示葡萄皮基本花色苷含量增加幅度較大，?；ㄉ蘸坑行》忍嵘?，赤霉素處理組酰化花色苷比例有較大幅度降低。2016年各處理組之間差異較顯著：開花前15 d處理組酰化花色苷含量有所提升，但所占比例有所降低；開花前20 d處理組?；ㄉ蘸刻嵘容^大，?；ㄉ毡壤采杂刑嵘?。

圖3 不同赤霉素處理對(duì)葡萄皮單體花色苷含量及組分比例的影響Fig. 3 Effects of different gibberellin treatments on the contents and composition of anthocyanins in grapes

2.4 赤霉素處理對(duì)葡萄皮單體酚含量的影響

表3 2015年不同赤霉素處理對(duì)葡萄皮單體酚含量的影響Table 3 Effects of different gibberellin treatments on the contents of phenols in grapes grown in 2015 μg/g

續(xù)表3

表4 2016年不同赤霉素處理對(duì)葡萄皮單體酚含量的影響Table 4 Effects of different gibberellin treatments on the contents of phenols in grapes grown in 2016 μg/g

如表3、4所示，2015年共檢測(cè)到25 種單體酚，其中黃烷-3-醇類6 種、羥基苯甲酸類3 種、黃酮醇類16 種。數(shù)據(jù)結(jié)果顯示：?jiǎn)误w酚總量隨著赤霉素質(zhì)量濃度的增加而增加，開花前20 d赤霉素處理效果好于開花前15 d處理組；所有單體酚中，楊梅酮-葡萄糖苷、槲皮素-葡萄糖苷、鼠李素-3-O-葡萄糖苷含量較多，均在100 μg/g以上，15LS207、15LS205兩個(gè)處理組中以上物質(zhì)含量均具有較大提升，15LS157中槲皮素-葡萄糖苷、鼠李素-3-O-葡萄糖苷含量也有較大提升。2016年檢測(cè)到25 種單體酚，其中黃烷-3-醇類7 種、羥基苯甲酸類2 種、黃酮醇類16 種，較2015年多檢測(cè)到了表兒茶素、二氫槲皮素，未檢測(cè)到香草酸、丁香亭-3-O-葡萄糖苷。2016年葡萄皮單體酚總量較2015年有較大程度提升，且不同赤霉素處理組單體酚總量均高于對(duì)照組；其中槲皮素-葡萄糖苷、鼠李素-3-O-葡萄糖苷含量較多，與2015年一致；16LS153、16LS155、16LS203中以上物質(zhì)含量均具有較大提升，其余處理組以上單體酚含量提升較小。單體酚總量隨著赤霉素質(zhì)量濃度的增加而降低，這與2015年結(jié)果不一致，造成實(shí)驗(yàn)差距的原因可能是葡萄成熟度存在差異。

圖4 不同赤霉素處理對(duì)葡萄單體酚含量及組分比例的影響Fig. 4 Effects of different gibberellin treatments on the contents and composition of phenols in grapes

如圖4所示，黃烷-3-醇類物質(zhì)含量占單體酚總量的2%～10%左右，羥基苯甲酸類所占比例不超過0.3%，黃酮醇類所占比例在90%以上。2015年15LS207、15LS205、15LS157和15LS155中葡萄皮黃酮醇類含量提升較大，其組分所占比例也較高；15LS153、15LS203、15LS205黃烷-3-醇含量提升較大，其組分所占比例也顯著提高；羥基苯甲酸類物質(zhì)含量較低，處理組間效果差異不顯著。2016年開花前15 d 3 個(gè)赤霉素處理組黃烷-3-醇類含量較2015年有較大提升，但較對(duì)照組明顯降低；開花前20 d赤霉素處理組黃烷-3-醇類含量隨著赤霉素質(zhì)量濃度的增加而降低，但與對(duì)照組相比差異不大；黃酮醇類含量較2015年提升明顯，其中16LS153、16LS155處理組黃酮醇類含量較高。

3 討 論

還原糖、總酸質(zhì)量濃度對(duì)葡萄成熟和葡萄酒釀造有較大影響。成熟度一般表示為還原糖與總酸質(zhì)量濃度的比值，釀造優(yōu)質(zhì)葡萄酒要求成熟度控制在35～45之間[24]，本實(shí)驗(yàn)中對(duì)照組葡萄成熟度均在35以下，赤霉素處理組中除2016年16LS157成熟度大于45外，其余處理組均在35～45之間，赤霉素處理提升了葡萄的成熟度。

花色苷是花色素的糖苷結(jié)合形式，是葡萄酒重要的保健成分之一[25-26]，對(duì)葡萄酒口感和貯存都有較大影響[27]。赤霉素拉穗處理拉長了果穗長度、提升了葡萄成熟度，對(duì)花色苷含量有較大的提升作用，這與Oren-Shamir等[28]的研究結(jié)果一致，他認(rèn)為葡萄花色苷含量的增加可能是因?yàn)楣雰?nèi)部果?；ㄉ沾罅吭黾右?。Alonso等[29]認(rèn)為適當(dāng)增強(qiáng)光照能提升葡萄花色素含量，本實(shí)驗(yàn)中赤霉素處理疏松了果穗，增加了內(nèi)部果粒的見光量，使葡萄內(nèi)部果?；ㄉ蘸坑休^大提升。甲基化花色苷含量越多，葡萄的紅色色調(diào)越明顯[30]，二甲花翠素類花色苷含有兩個(gè)甲基，同時(shí)在花色苷中占比較大，對(duì)葡萄和葡萄酒顏色影響也較大；?；ㄉ漳苎泳徠咸丫祁伾南耍黾宇伾€(wěn)定性[31]。兩年赤霉素處理組均提升了二甲花翠素類花色苷和?；ㄉ盏暮浚貏e是2016年提升量較大，因此赤霉素處理可以提升葡萄與葡萄酒顏色的深度和穩(wěn)定性，更利于葡萄酒的長期貯存。

單體酚類物質(zhì)是葡萄酒中主要的營養(yǎng)成分，決定著葡萄酒的苦味和澀味，影響著葡萄酒的色澤和穩(wěn)定性[32]。紅色葡萄酒口感平衡，追求乙醇體積分?jǐn)?shù)、澀度和酸度的平衡，本實(shí)驗(yàn)中兩年數(shù)據(jù)都顯示赤霉素處理同時(shí)提升了葡萄的還原糖質(zhì)量濃度和單體酚總量，與Fan Shutian[33]的結(jié)果一致。不同之處在于2016年赤霉素處理組葡萄皮單體酚總量存在隨赤霉素質(zhì)量濃度的增加而降低的趨勢(shì)。相關(guān)研究證明葡萄酚類物質(zhì)含量在成熟過程中并非一直增加，而是不斷波動(dòng)的[34]，葡萄成熟后酚類物質(zhì)含量出現(xiàn)先增加后降低的趨勢(shì)[15]，因此2016年單體酚含量出現(xiàn)的降低現(xiàn)象可能是因?yàn)槠咸堰^度成熟而造成酚類物質(zhì)減少。

赤霉素拉穗處理能有效拉長葡萄果穗，并且能夠提高葡萄果實(shí)的還原糖質(zhì)量濃度、降低總酸質(zhì)量濃度，對(duì)葡萄皮的酚類物含量有顯著提升作用，其中高質(zhì)量濃度處理組（5、7 mg/L）效果總體優(yōu)于低質(zhì)量濃度處理組（3 mg/L），開花前20 d處理組優(yōu)于開花前15 d處理組。所有處理組中以16LS207酚類物質(zhì)含量提升量最高，該處理組能提高大部分單體花色苷和單體酚的含量，并顯著促進(jìn)葡萄酰基化花色苷和黃酮醇類物質(zhì)的形成，有利于增加葡萄酒顏色的深度和穩(wěn)定性，提高葡萄酒的結(jié)構(gòu)層次感，利于葡萄酒的貯存。