臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞治療心臟擴(kuò)大伴心力衰竭類心肌病病兒的效果

，3

(青島大學(xué)附屬婦女兒童醫(yī)院，青島市婦女兒童醫(yī)院,山東 青島 266034 1 心臟中心； 2 兒童超聲科； 3 重癥醫(yī)學(xué)中心)

擴(kuò)張型心肌病(DCM)是一種以單心室/雙心室球形擴(kuò)大，并且伴有進(jìn)行性心臟收縮功能減退的疾病[1]。小兒心肌病年發(fā)病率為(1.24～1.31)/10萬，而DCM占其中一半以上，是引起兒童心力衰竭(簡稱心力衰竭)的重要原因之一[2]。約40% DCM病兒后期合并心力衰竭，最終不得不接受心臟移植，或者在診斷后的2年內(nèi)面臨死亡[3]。目前該病主要的治療方法包括藥物治療、心臟起搏器置入以及心室減容成形術(shù)等[4]，但都不能從根本上解決心肌細(xì)胞再生及心肌功能重建等問題[5]。臍帶間充質(zhì)細(xì)胞(UC-MSCs)的治療為DCM伴有心力衰竭的病兒提供了一種嶄新的及有益的嘗試[6]。人UC-MSCs(hUC-MSCs)是成體干細(xì)胞的一種，具有較高自我更新能力[7]，其來源豐富，具有多向分化潛能及移植后不良反應(yīng)少等優(yōu)點(diǎn)[8]，是移植的“種子細(xì)胞”的理想來源。本研究通過對心肌病伴心力衰竭病兒接受hUC-MSCs治療前后臨床、相關(guān)檢查及實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)的觀察，評估hUC-MSCs對心肌病伴心力衰竭病兒的臨床治療效果，旨在為干細(xì)胞的治療提供依據(jù)。

1 對象與方法

1.1 研究對象

納入標(biāo)準(zhǔn)：①確診心臟擴(kuò)大伴有心力衰竭的心肌病，如DCM、心室肌致密化不全、心內(nèi)膜彈力纖維增生癥；②NYHA分級為Ⅱ～Ⅳ級或者具有等同于Ⅱ～Ⅳ級的癥狀；③左心室射血分?jǐn)?shù)>20%；④已給予至少1次大劑量丙種球蛋白治療，效果不佳；⑤治療年齡為1月齡～18周歲；⑥病兒和(或)病兒家屬簽署知情同意書。排除標(biāo)準(zhǔn)：①具有持續(xù)性室性心動過速或顫動病史者；②植入心臟除顫器者；③潛在的心臟除顫器候選者；④其他：有暈厥病史、5年內(nèi)患有腫瘤、活動性感染性疾病以及病毒性疾病實(shí)驗(yàn)陽性者等。本研究在clinicaltrails.gov網(wǎng)站注冊編號為NT01219452，已報(bào)經(jīng)醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)。

符合入選條件的病兒共17例，男9例，女8例。其中診斷為DCM者4例，心肌致密化不全者12例，心內(nèi)膜彈力纖維增生癥者1例。NYHA心功能分級Ⅱ級者10例，Ⅲ級者5例，Ⅳ級者2例。初診年齡為1～144個(gè)月，平均為(44.23±48.32)個(gè)月；hUC-MSCs治療前的病程為3～120個(gè)月，平均為(29.29±27.03)個(gè)月。細(xì)胞治療前存在端坐呼吸者5例，口唇發(fā)紺者2例；心臟聽診聞及奔馬律者4例，肝臟腫大者4例，雙下肢水腫者2例。細(xì)胞治療前心電圖存在多導(dǎo)聯(lián)ST-T改變者17例，其中期前收縮(房性或室性)者4例，傳導(dǎo)阻滯者4例。17例病兒均常規(guī)給予強(qiáng)心、利尿和擴(kuò)血管藥物治療，所用藥物為地高辛、雙氫克尿噻或呋塞米、安體舒通、卡托普利或苯那普利；細(xì)胞治療前，15例(88.2%)心肌病病兒給予β受體阻斷劑(美托洛爾或卡維地洛)治療，其療程為1～120個(gè)月，平均(23.7±13.2)個(gè)月。17例病兒均給予丙種球蛋白治療1～4次，其總劑量為2～6 g/kg；10例(58.8%)病兒給予激素治療，其療程為12～48個(gè)月，平均(25.9±12.2)個(gè)月。所有病兒細(xì)胞治療前常規(guī)給予左卡尼丁口服液、維生素B1、維生素B2及輔酶Q10等治療。

1.2 hUC-MSCs來源

hUC-MSCs由青島奧克生物開發(fā)公司生產(chǎn)并提供，1 U hUC-MSCs含有1×107個(gè)細(xì)胞，流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞表型為CD34(-)、CD45(-)、CD90(+)、CD105(+)、HLA-DR(-)，符合間充質(zhì)干細(xì)胞表型特征；乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒、梅毒螺旋體、支原體、巨細(xì)胞病毒和HIV檢測均陰性；需氧菌培養(yǎng)和真菌培養(yǎng)陰性。

1.3 方法

hUC-MSCs的應(yīng)用方法為肌肉注射，選取雙上肢三角肌和雙下肢股四頭肌各1處為注射點(diǎn)；根據(jù)病兒年齡不同，每次肌肉注射劑量為0.5～1.0 U，每個(gè)月應(yīng)用1次，連續(xù)給予2～3次。細(xì)胞治療期間病兒繼續(xù)應(yīng)用抗心力衰竭等基礎(chǔ)治療藥物，所用藥物有地高辛、雙氫克尿噻或呋塞米、安體舒通、卡托普利或苯那普利、左卡尼丁口服液、維生素B1、維生素B2及輔酶Q10等。

1.4 觀察指標(biāo)

細(xì)胞治療后觀察以下指標(biāo)。①臨床指標(biāo)為臨床癥狀，無癥狀生存時(shí)間、存活和死亡人數(shù)及存活者心功能。存活者心功能評價(jià)標(biāo)準(zhǔn)：NYHA提高2級及以上為明顯好轉(zhuǎn)，NYHA提高1級及以上為好轉(zhuǎn)，NYHA無提高或惡化為無好轉(zhuǎn)。②心臟超聲指標(biāo)為左心室射血分?jǐn)?shù)、左心室短軸縮短率、左心室舒張末期內(nèi)徑和左心室收縮末期內(nèi)徑。③實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)為氨基未端腦鈉肽前體(NT-proBNP)。

1.5 安全性觀察指標(biāo)

觀察病兒細(xì)胞治療后有無體溫波動、惡心、嘔吐、腹瀉、皮疹、感染等；注射局部有無腫脹、鈣化、新生腫物及感染；心電圖或動態(tài)心電圖觀察有無新的心律失常發(fā)生；實(shí)驗(yàn)室檢測血常規(guī)(白細(xì)胞、血紅蛋白、血小板)、尿常規(guī)(尿紅細(xì)胞、尿白細(xì)胞、尿蛋白)和肝腎功能改變(谷丙轉(zhuǎn)氨酶、谷草轉(zhuǎn)氨酶、尿素氮和肌酐)。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié) 果

2.1 病兒治療后NYHA心功能的變化

細(xì)胞治療后，病兒明顯好轉(zhuǎn)者4例(23.5%)，好轉(zhuǎn)者11例(64.7%)，無好轉(zhuǎn)者2例(11.8%)，病兒總體心功能改善(u=-3.637，P<0.05)。NYHA分級由Ⅳ級轉(zhuǎn)為Ⅱ、Ⅲ級者各1例；Ⅲ級轉(zhuǎn)為Ⅰ級者3例，轉(zhuǎn)為Ⅱ級者2例；Ⅱ級轉(zhuǎn)為Ⅰ級者8例； Ⅱ級無改善者和轉(zhuǎn)為Ⅲ級者各1例，此2例病兒均存在難以控制的反復(fù)呼吸道感染。

2.2 病兒治療后生存質(zhì)量情況

至本次隨訪結(jié)束，總隨訪時(shí)間為7～74個(gè)月，平均隨訪時(shí)間為(31.5±30.27)個(gè)月，最長隨訪時(shí)間為74個(gè)月。17例心肌病病兒于細(xì)胞治療后均存活，目前均口服抗心力衰竭基礎(chǔ)藥物；其中13例病兒臨床無任何心力衰竭癥狀，參加同年齡組兒童的日?；顒?，如上學(xué)或進(jìn)幼兒園，其生存時(shí)間為3～28個(gè)月，平均生存時(shí)間為(13.8±10)個(gè)月；4例病兒仍存在心力衰竭癥狀，其中輕度端坐呼吸者1例，肝臟腫大者2例，雙下肢水腫者1例，日?；顒虞p度受限，不能參加同年齡組兒童的日常活動，其生存時(shí)間分別為7、13、32以及74個(gè)月，平均生存時(shí)間為(31.5±33.5)個(gè)月。

2.3 病兒治療前后外周血NT-proBNP水平及心臟超聲的變化

hUC-MSCs治療后14例病兒NT-proBNP水平由治療前(697±693)ng/L下降至治療后(200±141)ng/L，治療前后比較，差異有顯著性(t=2.641，P<0.05)。3例病兒因反復(fù)呼吸道和(或)消化道感染，心功能無明顯好轉(zhuǎn)，NT-proBNP多次復(fù)查處于較高水平，其中1例細(xì)胞治療后較治療前明顯升高，心功能分級惡化；1例病兒細(xì)胞治療前后無明顯變化，心功能分級無改善；1例病兒細(xì)胞治療后較治療前明顯下降，但仍處于較高水平，心功能分級好轉(zhuǎn)。

hUC-MSCs治療后病兒左心室射血分?jǐn)?shù)由治療前(37.2±10.9)%提高到(45.4±13.0)%，治療前后比較，差異具有顯著意義(t=-2.910，P<0.05)，其中12例病兒治療后的左心室射血分?jǐn)?shù)由治療前(35.6±9.8)%提高到(49.6±12.2)%，差異有顯著性(t=-6.196，P<0.05)；5例病兒的左心室射血分?jǐn)?shù)治療后無升高，其中3例較治療前無變化，但其心功能分級有所好轉(zhuǎn)；2例較治療前下降，心功能分級惡化或無改善。

hUC-MSCs治療后病兒左心室短軸縮短率由治療前(19.4±6.2)%升高至(22.6±7.3)%，但治療前后比較，差異無顯著性(P>0.05)；其中11例病兒由治療前(18.0±5.0)%升高至(24.8±7.2)%，治療前后比較，差異有顯著性(t=-5.648，P<0.05)；6例病兒較細(xì)胞治療前無升高，其中2例較治療前下降，心功能分級惡化或無改善；2例稍有下降；2例無變化，但其心功能分級有所好轉(zhuǎn)。

hUC-MSCs治療后病兒左心室舒張末期內(nèi)徑由治療前(51.2±10.4)mm縮小至(48.1±11.8)mm，治療前后比較，差異具有顯著意義(t=2.591，P<0.05)；其中11例由治療前(49.7±10.4)mm縮小至(44.4±10.8)mm，治療前后比較，差異具有顯著性(t=3.689，P<0.05)；6例較治療前無縮小，其中2例較治療前增大，心功能分級惡化或無改善；4例無明顯變化，但其心功能分級有所好轉(zhuǎn)。

細(xì)胞治療后病兒左心室收縮末期內(nèi)徑由治療前(41.3±12.0)mm縮小至(37.1±13.0)mm，治療前后比較，差異具有顯著性(t=2.805,P<0.05)；其中13例病兒治療后由治療前(43.9±12.4)mm縮小至(37.8±14.6)mm，治療前后比較，差異具有顯著性(t=3.718,P<0.05)；4例病兒較治療前無縮小，其中2例較治療前增大，心功能分級惡化或無改善；2例無變化,但其心功能分級有所好轉(zhuǎn)。

2.4 安全性

17例心肌病病兒細(xì)胞治療后的1周內(nèi)，尤其是48 h之內(nèi)出現(xiàn)面頰和口唇紅潤，部分病兒出現(xiàn)多汗，無發(fā)熱、皮疹、惡心、嘔吐、腹瀉等。肌肉注射部位未見紅腫、出血、發(fā)硬及腫脹等異常。1例6歲病兒細(xì)胞治療后右側(cè)腹股溝斜疝自愈。細(xì)胞治療后病兒心電圖明顯改善，表現(xiàn)為ST-T壓低改善，2例室性期前收縮及2例房性期前收縮病兒期前收縮次數(shù)明顯減少，傳導(dǎo)阻滯消失；未合并感染的病兒無新發(fā)心律失常出現(xiàn)；僅1例病兒因合并重癥感染出現(xiàn)陣發(fā)性室上性心動過速、頻發(fā)室性期前收縮，經(jīng)抗感染、抗心律失常治療后心律失常消失，目前心電圖僅見多導(dǎo)聯(lián)ST-T段改變。細(xì)胞治療前后外周血白細(xì)胞計(jì)數(shù)、血紅蛋白、血小板計(jì)數(shù)、谷丙轉(zhuǎn)氨酶、谷草轉(zhuǎn)氨酶、尿素氮及肌酐均未見明顯升高或者降低(P>0.05)。見表1。細(xì)胞治療前1例合并感染病兒白細(xì)胞計(jì)數(shù)偏高，1例合并急性心力衰竭和感染的病兒存在肝腎功能損害，表現(xiàn)為谷丙轉(zhuǎn)氨酶、谷草轉(zhuǎn)氨酶、尿素氮、肌酐值增高，余15例病兒上述指標(biāo)均在正常范圍；細(xì)胞治療后2個(gè)月及隨訪結(jié)束時(shí)上述指標(biāo)均在正常范圍。細(xì)胞治療前后監(jiān)測尿蛋白、尿白細(xì)胞和尿潛血均為陰性。

3 討 論

近年來，有關(guān)干細(xì)胞臨床治療的研究越來越多，而且逐漸傾向于有關(guān)間充質(zhì)干細(xì)胞應(yīng)用研究[9-10]。UC-MSCs是間充質(zhì)干細(xì)胞的一種，其來源于包繞臍帶血管的結(jié)締組織——華爾通膠(WJ)[11]，具有以下優(yōu)點(diǎn)：具有干細(xì)胞的多項(xiàng)分化潛能[7]；取材方便，來源豐富，倫理爭議少；低免疫原性，移植相關(guān)排斥反應(yīng)小，安全性高[12]。這些優(yōu)點(diǎn)使其成為臨床應(yīng)用治療多種系統(tǒng)疾病的很好的選擇[9]。目前多項(xiàng)研究表明，UC-MSCs在心臟修復(fù)及心臟疾病治療中具有較高的安全性及有效性，是移植的“種子細(xì)胞”的理想來源[13-14]。

既往我們已經(jīng)對hUC-MSCs治療DCM進(jìn)行了相關(guān)的實(shí)驗(yàn)研究，研究對象為正常大鼠及DCM大鼠，發(fā)現(xiàn)肌肉注射hUC-MSCs對正常大鼠無影響，主要表現(xiàn)為注射前后心臟結(jié)構(gòu)、功能以及心肌相關(guān)細(xì)胞因子的水平無明顯變化[15-16]，大鼠內(nèi)臟各器官(肺、肝、脾、腦、腎、肌肉)結(jié)構(gòu)無異常，大鼠血常規(guī)、血生化及尿常規(guī)亦無明顯變化，大鼠生活習(xí)性以及生長發(fā)育無明顯的變化[17]；肌肉注射hUC-MSCs對DCM大鼠有一定的影響，表現(xiàn)為增加心肌組織胰島素樣生長因子、肝細(xì)胞生長因子、血管內(nèi)皮生長因子等細(xì)胞因子的表達(dá)，促進(jìn)心肌微血管再生，減輕心肌組織病理損傷，改善心肌組織超微結(jié)構(gòu)，從而使心功能改善，并具有一定的免疫調(diào)節(jié)功能[18-20]。以上動物實(shí)驗(yàn)研究為hUC-MSCs的臨床應(yīng)用提供了有效性及安全性證據(jù)。

表1 病兒治療前后血常規(guī)和肝腎功能指標(biāo)比較

目前UC-MSCs治療心肌病的相關(guān)臨床研究報(bào)道較少,FISHER等[21]將干細(xì)胞應(yīng)用于慢性缺血性心臟病的治療，ISHIGAMI等[22]發(fā)現(xiàn)冠狀動脈內(nèi)注射干細(xì)胞治療單心室改變的心臟病，可以改善心臟功能，PINCOTT等[23]報(bào)道了骨髓來源的干細(xì)胞應(yīng)用于成人DCM的治療；FANG等[24]將hUC-MSCs應(yīng)用于缺血性心臟病患者治療效果的研究。這些研究均顯示干細(xì)胞可應(yīng)用于心臟疾病的治療，可部分改善部分病人的心功能。目前相關(guān)的研究認(rèn)為，hUC-MSCs治療心肌病的可能機(jī)制如下：①替代作用，hUC-MSCs誘導(dǎo)后分化為心肌細(xì)胞，移植至體內(nèi)替代病變心肌[25]；②自分泌或旁分泌功能，分泌血管生成因子、生長因子、細(xì)胞因子等物質(zhì)，從而改善心肌功能[26]；③抗低氧誘導(dǎo)心肌凋亡功能[27]；④免疫調(diào)節(jié)功能[28]；⑤促進(jìn)血管再生功能；⑥激活內(nèi)源性心臟干細(xì)胞，從而促進(jìn)心肌修復(fù)[29]。

本研究結(jié)果顯示，肌注hUC-MSCs可改善部分心肌病伴心力衰竭病兒的臨床癥狀及心功能，表現(xiàn)為活動耐力提高，可實(shí)現(xiàn)無癥狀生存，左心室射血分?jǐn)?shù)提高，左心室舒張末期內(nèi)徑、左心室收縮末期內(nèi)徑減小；肌注hUC-MSCs后無明顯不良反應(yīng)，安全性較好，肌注部位無明顯異常，且未發(fā)現(xiàn)hUC-MSCs移植相關(guān)的血常規(guī)異常、肝腎功能損害、惡性心律失常等。但本研究樣本較少，隨訪時(shí)間較短，尚需要多中心、大樣本、前瞻性的病例對照研究進(jìn)一步明確其有效性和安全性。