乙酰肝素酶介導心肌細胞凋亡的研究

曹洪帥　韓軒茂

[摘要]目的研究硫酸乙酰肝素酶（HPSE）對心肌細胞缺氧/復氧損傷后細胞凋亡的影響作用。方法體外培養(yǎng)H9C2心肌細胞，復制心肌細胞缺氧/復氧模型，模擬心肌缺血/再灌注損傷（MIRI）。實驗分為正常對照組（C組）、缺氧/復氧組（H瓜組）、HPSE抑制劑處理組（OGT2115組）等三組。形態(tài)學觀察細胞狀態(tài)，MTT法檢測H9C2心肌細胞存活率。結果與對照組相比，H/R處理后心肌細胞存活率顯著降低（P<0.05）；與H瓜組比較，OGT2115處理后可提高缺氧/復氧后H9C2心肌細胞存活率（P<0.05）。結論HPSE抑制劑對缺氧/復氧后H9C2心肌細胞凋亡有抑制作用，拓寬HPSE阻滯劑臨床應用范圍，具有重要的基礎及臨床意義。

[關鍵詞]心肌細胞；缺氧復氧損傷；乙酰肝素酶

[中圖分類號]R542.2 [文獻標識碼]B [文章編號]ISSN.2095-6681.2018.05.125.02

硫酸乙酰肝素酶（HPSE）是一種內(nèi)切性β-D-葡萄糖醛酸糖苷酶，是哺乳動物細胞中唯一可以切割細胞表面的硫酸乙酰肝素側鏈的酶，參加細胞外重塑。HPSE涉及多種生理過程如胚胎植入，組織修復和炎癥過程；病理致病過程主要包括腫瘤的進展和腎臟疾病。研究表明，HPSE在多種惡性腫瘤病理發(fā)展過程中呈現(xiàn)高表達、高活性狀態(tài)，有可能成為一個抗腫瘤治療的新靶點。HPSE作為一個新的靶向治療位點正在逐漸被人們所認識。近期發(fā)現(xiàn)，HPSE在大鼠缺血再灌注損傷（I/R）模型中有影響作用，但迄今為止，尚未見缺血過程中心肌細胞自身HPSE表達、調(diào)控及凋亡的研究報告。本實驗通過培養(yǎng)H9C2心肌細胞，復制缺氧/復氧損傷模型，模擬臨床上MIRI，并用HPSE抑制劑進行干預，進而探討HPSE對H9C2心肌細胞缺氧/復氧損傷后的影響作用。

1資料與方法

1.1實驗藥物

OGT2115

1.2細胞

H9C2心肌細胞（武漢普諾賽生命科技有限公司）

1.3試劑

DMEM高糖培養(yǎng)基，胰酶，PBS，胎牛血清，MTT粉末，青霉素鏈霉素混合液，DMSO。

1.4儀器

C02培養(yǎng)箱，熒光倒置顯微鏡，酶標儀。

1.5方法

1.5.1細胞培養(yǎng)

配置培養(yǎng)基：10%胎牛血清（BSA）、1%青霉素鏈霉素混合液的DMEM培養(yǎng)基。培養(yǎng)H9C2心肌細胞，置于常規(guī)培養(yǎng)箱培養(yǎng)，待細胞生長80%滿時，進行細胞傳代，2～3天傳代1次，用于后續(xù)實驗。

1.5.2復制H9C2心肌細胞缺氧/復氧模型

細胞生長80%滿后，將細胞的培養(yǎng)基換成PBS，置于缺氧裝置中孵育4h（缺氧時間超過時，許多調(diào)亡細胞團漂浮于培養(yǎng)基中，易造成極大誤差，因此本實驗細胞缺氧時間定為4h），缺氧處理后更換含10%BSA的DMEM培養(yǎng)基，置于常規(guī)培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3 h，模型建立完成。

1.53形態(tài)學觀察

在高倍顯微鏡下觀察細胞的狀態(tài)，可以通過觀察細胞狀態(tài)大致判斷細胞存活情況。

1.5.4MTT法檢測細胞凋亡

取對數(shù)生長期的H9C2心肌細胞，以5×103/孔的密度接種于96孔板中，細胞貼壁后，試驗組分別加入不同濃度OGT2115（20、40、60、80、100μg/mL）。每組設4個復孔。試驗組和模型組缺氧培養(yǎng)4 h后，換為10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基孵育箱孵育3個小時，對照組不進行缺氧復氧操作。操作完成后，三組細胞每孔加入20μL的MTT液體（避光），放回細胞孵箱，孵育4h，終止培養(yǎng)，小心吸去全部培養(yǎng)液。每孔加入DMS0150 μL，振蕩5～10 min，使結晶物充分溶解。酶聯(lián)免疫檢測儀在490 nm波長檢測每孔吸光度值。實驗重復3次。

2結果

2.1形態(tài)學

正常狀態(tài)下H9C2心肌細胞呈梭形貼壁生長，細胞周邊顏色透亮有光澤。衰老死亡的細胞呈球形且不貼壁懸浮于細胞培養(yǎng)液中，通過細胞形態(tài)學對比可以看出HPSE抑制劑處理后可以明顯降低細胞凋亡率。

2.2 MTT法檢測細胞凋亡

MTT法檢測結果（表1）顯示，正常對照組心肌細胞存活率97.00±2.34%，H/R模型組為42.91±5.33%，H/R實驗組為60.24±7.61，缺氧處理后H9C2細胞的相對增殖率明顯下降（P<0.05）。HPSE抑制劑處理后，H9C2細胞的相對增殖率升高（P<0.05）。

3討論

心肌細胞凋亡與大部分心血管疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關，大量研究表明，在眾多心臟疾病中如心力衰竭、心肌梗死等都存在心肌細胞凋亡形態(tài)學的改變。心肌細胞凋亡在MIRI發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮著重要作用。有資料顯示，I/R是急性腎衰竭和延遲移植功能的重要原因，可通過激活腎小管細胞的上皮至間質(zhì)轉化（EMT）而誘導慢性腎損傷，HPSE在其中可能具有重要的作用。本實驗證實了HPSE抑制劑在缺氧復氧誘導H9C2心肌細胞凋亡過程中起保護作用。我們課題組借助乙酰肝素酶及其相關因子在白血病中表達水平的研究經(jīng)驗，采用多種研究方法，研究患者全身及血小板HPSE與心肌缺血再灌注的相關性；重點研究HPSE對心肌細胞的纖維化和凋亡的影響，探討HPSE在心肌缺血再灌注損傷發(fā)病中的作用，及可能的分子機制，為今后心衰的監(jiān)測、治療及預后評估開辟新方向，拓寬在其他領域中，HPSE阻滯劑臨床應用范圍，具有重要的基礎及臨床意義。

本文編輯：李豆