移動(dòng)元件ISEcp1介導(dǎo)blaCTX-M轉(zhuǎn)座機(jī)制的分析研究*

劉 東，張 倩，王倩薇，毛英格，王 麗

(河南大學(xué)第一附屬醫(yī)院檢驗(yàn)科，河南開(kāi)封 475001)

近年來(lái)，臨床細(xì)菌耐藥問(wèn)題已嚴(yán)重危及公眾健康，給臨床治療帶來(lái)巨大挑戰(zhàn)。2016年9月5日在中國(guó)杭州舉辦了全世界矚目的G20峰會(huì)，會(huì)中明確提出抗生素耐藥性嚴(yán)重威脅公共健康、經(jīng)濟(jì)增長(zhǎng)和全球經(jīng)濟(jì)穩(wěn)定。而產(chǎn)超廣譜β-內(nèi)酰胺酶(ESBLs)是臨床細(xì)菌耐藥的重要原因之一，且CTX-M為主要型別。根據(jù)氨基酸序列的異質(zhì)性，可將其分為6個(gè)亞群，即Group 1、Group 2、Group 8、Group 9、Group 25和KLUC Group[1]，其中Group 1和Group 9是包含CTX-M型ESBLs變種較多的亞群，也是全世界范圍內(nèi)最主要的流行群。不同亞群間氨基酸變異率大于或等于10%，同一亞群內(nèi)氨基酸變異率小于或等于5%。

表1 GenBank中典型ISEcp1轉(zhuǎn)座單元

-：無(wú)數(shù)據(jù)

遺傳證據(jù)顯示，blaCTX-M的初始來(lái)源是環(huán)境菌株克呂沃爾菌的染色體，具有豐富的環(huán)境資源，進(jìn)而傳遞給臨床菌株[1]。blaCTX-M通常位于ISEcp1下游，形成ISEcp1轉(zhuǎn)座單元，或與ISCR1關(guān)聯(lián)位于1型整合子中[2]，也有報(bào)道顯示blaCTX-M的轉(zhuǎn)移與噬菌體有關(guān)[3]。與blaCTX-M相關(guān)的轉(zhuǎn)座單元或其他元件通常位于質(zhì)粒上，同一菌株可含有1種以上的blaCTX-M，分別位于不同質(zhì)粒上或同一質(zhì)粒的不同位點(diǎn)。ISEcp1屬于IS1380家族，左端重復(fù)序列(inverted repeat left，IRL)和右端重復(fù)序列(inverted repeat right，IRR)長(zhǎng)度均為14 bp，二者有兩個(gè)堿基差異，編碼420個(gè)氨基酸的轉(zhuǎn)座酶(transposase，tnpA)。ISEcp1轉(zhuǎn)座單元的完整結(jié)構(gòu)為：IRL、tnpA、IRR-1和IRR-2。IRR-2與IRL和IRR-1的序列同源性略低，IR的兩端通常會(huì)有5 bp正向重復(fù)序列(direct repeat；target site duplication signals for transposition，DR)[4]。ISEcp1可借助IRL和IRR-2轉(zhuǎn)移其臨近的DNA序列，且該DNA序列往往包含耐藥基因[5]，blaCTX-M就是其中較為常見(jiàn)的一種[6]。該轉(zhuǎn)座方式大大促進(jìn)了blaCTX-M的水平轉(zhuǎn)移，進(jìn)一步促進(jìn)了其在全球范圍內(nèi)的播散。產(chǎn)ESBLs革蘭陰性菌引發(fā)的耐藥現(xiàn)象已嚴(yán)重危及公眾健康，且CTM-M為主要類型，因此開(kāi)展CTX-M型ESBLs相關(guān)的分子耐藥機(jī)制方面的研究，具有很大的必要性。本文主要從ISEcp1轉(zhuǎn)座單元的類型及其轉(zhuǎn)座機(jī)制兩個(gè)方面進(jìn)行研究，以期為臨床防控和治療提供分子依據(jù)。

1 材料與方法

1.1分析工具 NCBI網(wǎng)站BLASTN/BLASTP，ResFinder，ISfinder，Inkscape 0.48.1等生物信息學(xué)工具或數(shù)據(jù)庫(kù)。

1.2方法 截取ISEcp1和blaCTX-M的序列(二者均有亞型，亞型間同源性較高，選取質(zhì)粒p112298-KPC[7]中相應(yīng)的ISEcp1和blaCTX-M序列)，在NCBI網(wǎng)站BLAST入口提交檢索與該序列相似的序列，篩選不同種類的側(cè)翼序列。通過(guò)ResFinder(https://cge.cbs.dtu.dk/services/ResFinder/)預(yù)測(cè)耐藥基因，BLASTN/BLASTP等對(duì)ORF和假基因進(jìn)行核實(shí)與信息完善，并利用ISfinder(https://www-is.biotoul.fr/)對(duì)移動(dòng)元件進(jìn)行精細(xì)注釋，最后運(yùn)用Inkscape 0.48.1(https://inkscape.org/en/)繪圖。

2 結(jié) 果

2.1GenBank中典型ISEcp1轉(zhuǎn)座單元匯總 GenBank中典型ISEcp1轉(zhuǎn)座單元的相關(guān)信息，見(jiàn)表1。ISEcp1轉(zhuǎn)座單元主要可分為6類，即ISEcp1-blaCTX-M-Δorf477轉(zhuǎn)座單元(常見(jiàn)于blaCTX-M-1G、blaCTX-M-25G和雜合體)、ISEcp1-blaCTX-M-IS903-ΔiroN轉(zhuǎn)座單元(常見(jiàn)于blaCTX-M-1G和blaCTX-M-9G)、ISEcp1-blaCTX-M轉(zhuǎn)座單元(常見(jiàn)于blaCTX-M-1G)、ISEcp1-blaCTX-M-orf3轉(zhuǎn)座單元(常見(jiàn)于blaCTX-M-9G)、ISEcp1-blaCTX-M-orfX轉(zhuǎn)座單元(常見(jiàn)于blaCTX-M-25G)和ISEcp1-blaCTX-M-ΔIS26-orf222轉(zhuǎn)座單元(常見(jiàn)于blaCTX-M-9G)。

箭頭：基因；基因、移動(dòng)元件和其他特征根據(jù)功能分類進(jìn)行著色；序列兩端的黑色長(zhǎng)條：檢索到的序列不完整；陰影：同源性區(qū)域(>95%核苷酸一致性)

圖1 GenBank中典型ISEcp1轉(zhuǎn)座單元繪圖及比對(duì)

2.2GenBank中典型ISEcp1轉(zhuǎn)座單元繪圖及比對(duì) 通過(guò)對(duì)6類ISEcp1轉(zhuǎn)座單元進(jìn)行精細(xì)結(jié)構(gòu)分析及繪制圖譜，分別得到了相應(yīng)的結(jié)構(gòu)圖，見(jiàn)圖1。完整的ISEcp1轉(zhuǎn)座單元包含IRL、IRR-1和IRR-2，且在IRL和IRR-2的兩端通常會(huì)有DR。以ISEcp1-blaCTX-M-Δorf477轉(zhuǎn)座單元為例(圖1a)，其轉(zhuǎn)座單元的線性結(jié)構(gòu)為DR-IRL-tnpA-IRR-1-blaCTX-M-Δorf477-IRR-2-DR，其中上游tnpA為轉(zhuǎn)座酶編碼基因，下游為截短的orf477(編碼一種功能未知的蛋白)。另5種轉(zhuǎn)座單元的結(jié)構(gòu)的5′端均與ISEcp1-blaCTX-M-Δorf477轉(zhuǎn)座單元相同，彼此間的差異僅在于blaCTX-M下游，ISEcp1捕獲了不同的基因，形成了不同的結(jié)構(gòu)。

2.3ISEcp1-blaCTX-M-Δorf477轉(zhuǎn)座單元間距示意圖 ISEcp1-blaCTX-M-Δorf477轉(zhuǎn)座單元中ISEcp1與blaCTX-M間距主要有以下8種類型，分別是37、45、47、48、49、79、80和127 bp，見(jiàn)圖2。

圖2 ISEcp1-blaCTX-M-Δorf477轉(zhuǎn)座單元中ISEcp1與blaCTX-M間距(spacer)示意圖

3 討 論

自β-內(nèi)酰胺類抗生素廣泛應(yīng)用于臨床以來(lái)，β-內(nèi)酰胺酶陸續(xù)被報(bào)道，且其種類逐年增加。其中ESBLs主要是由革蘭陰性桿菌在超廣譜β-內(nèi)酰胺類抗生素的選擇壓力下產(chǎn)生的一種β-內(nèi)酰胺鈍化酶，具有廣泛的水解酶活性[8]。目前ESBLs已廣泛存在于大腸桿菌、肺炎克雷伯菌、奇異變形桿菌、腸道沙門菌及其他腸桿菌科菌中[9]。ESBLs種類很多，20世紀(jì)60年代，發(fā)現(xiàn)質(zhì)粒介導(dǎo)的ESBLs，即TEM-1[10]；另一個(gè)較為常見(jiàn)的質(zhì)粒介導(dǎo)的ESBLs是SHV-1，自此TEM-1、SHV-1及其變種開(kāi)始在全世界范圍內(nèi)廣泛傳播。1989年德國(guó)首次報(bào)道了CTX-M-1[11]，之后CTX-M型ESBLs迅速在全球范圍內(nèi)傳播，成為目前ESBLs流行中最常見(jiàn)且傳播最廣的類型。

ISEcp1轉(zhuǎn)座單元是blaCTX-M傳播的重要載體，本研究顯示，ISEcp1轉(zhuǎn)座單元結(jié)構(gòu)主要可分為6類，即：ISEcp1-blaCTX-M-Δorf477、ISEcp1-blaCTX-M-IS903-ΔiroN、ISEcp1-blaCTX-M、ISEcp1-blaCTX-M-orf3、ISEcp1-blaCTX-M-orfX和ISEcp1-blaCTX-M-ΔIS26-orf222。最常見(jiàn)的ISEcp1-blaCTX-M-orf477轉(zhuǎn)座單元在blaCTX-M的下游是截短的orf477(編碼一種功能未知的蛋白)[12-14]。另一種較為常見(jiàn)的轉(zhuǎn)座單元是ISEcp1-blaCTX-M-IS903-ΔiroN轉(zhuǎn)座單元，即在blaCTX-M的下游為IS903和iroN(編碼鐵外膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白)[7，15]。ISEcp1-blaCTX-M轉(zhuǎn)座單元在blaCTX-M-2的下游有一段256 bp的序列，該序列和抗壞血酸克呂沃爾菌中kluA-1下游堿基一致[16]。ISEcp1-blaCTX-M-16-orf3轉(zhuǎn)座單元，在blaCTX-M-16的下游為orf3(編碼一種功能未知的蛋白)[17]。ISEcp1-blaCTX-M-26-orfX轉(zhuǎn)座單元在blaCTX-M-26的下游是orfX(289 bp，該序列不完整)[18]。ISEcp1-blaCTX-M-14b-ΔIS26-orf222轉(zhuǎn)座單元在blaCTX-M-14b的下游有108 bp的IS26殘留和orf222(編碼一種功能未知的蛋白)[19]。

完整的轉(zhuǎn)座單元通常會(huì)在IRL和IRR-2的兩端形成5 bp DR，如TACTA、TAATA、AATAC等，是轉(zhuǎn)座事件發(fā)生的標(biāo)志。該轉(zhuǎn)座方式促進(jìn)了blaCTX-M的高水平表達(dá)和跨種屬、跨物種和跨地區(qū)傳播。細(xì)菌中基因的表達(dá)調(diào)控主要發(fā)生在轉(zhuǎn)錄水平上，啟動(dòng)子在該過(guò)程中居于關(guān)鍵地位，決定相應(yīng)蛋白的表達(dá)水平。ISEcp1轉(zhuǎn)座單元中blaCTX-M的高水平表達(dá)與ISEcp1中的啟動(dòng)子(P1)密切相關(guān)，此外還和ISEcp1與blaCTX-M的間距(spacer)有關(guān)[20-21]。本研究顯示，ISEcp1-blaCTX-M-Δorf477轉(zhuǎn)座單元中ISEcp1與blaCTX-M間距主要有以下8種類型，分別是37、45、47、48、49、79、80和127 bp。研究表明，不同間距包含的啟動(dòng)子類型和效應(yīng)是不同的[20-21]。以ISEcp1-blaCTX-M-Δorf477轉(zhuǎn)座單元為例，ISEcp1與blaCTX-M的間距為37～127 bp。不同間距的轉(zhuǎn)座單元均包含P1，有完整的-35區(qū)、-10區(qū)、-35區(qū)和-10區(qū)之間的間隔序列和轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)，促進(jìn)下游blaCTX-M的表達(dá)。但僅79、80和127 bp間距的轉(zhuǎn)座單元具有P2活性，其他間距的轉(zhuǎn)座單元中由于不同長(zhǎng)度的堿基缺失，導(dǎo)致P2中-35區(qū)的缺失，進(jìn)而影響P2活性[22]。與P2相比，P1活性較強(qiáng)，為強(qiáng)啟動(dòng)子，在促進(jìn)下游基因的表達(dá)中占據(jù)主導(dǎo)地位[23]。綜合來(lái)說(shuō)，P1活性和短間距是促進(jìn)下游blaCTX-M高水平表達(dá)的關(guān)鍵因素。

blaCTX-M的表達(dá)存在“基因沉默”現(xiàn)象，當(dāng)僅有blaCTX-M存在時(shí)，該基因不表達(dá)或表達(dá)水平較低。在外界藥物的壓力下，ISEcp1轉(zhuǎn)座插入到blaCTX-M上游，為其提供強(qiáng)啟動(dòng)子區(qū)，可促進(jìn)blaCTX-M的高水平表達(dá)，進(jìn)而使得菌株獲得相應(yīng)耐藥表型[24]。且一旦ISEcp1轉(zhuǎn)座插入到blaCTX-M上游形成完整的轉(zhuǎn)座單元，便可在不同的遺傳物質(zhì)間傳播，從染色體到質(zhì)粒，質(zhì)粒與質(zhì)粒之間，進(jìn)而在同種或不同種細(xì)菌間快速傳播，導(dǎo)致耐藥性播散。