300例基質(zhì)金屬蛋白酶-91562基因多態(tài)性與急性腦梗死的關(guān)系探討*

李艾帆，張玉超，李永芳，馬西文，曹心慧,賀 穎，鄭 紅，許予明

(1.河南大學(xué)附屬鄭州市第一人民醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，鄭州 450000；2.河南大學(xué)附屬鄭州市第一人民醫(yī)院優(yōu)生遺傳科，鄭州 450000；3.鄭州大學(xué)附屬鄭州市中心醫(yī)院老年病科，鄭州 450001；4.鄭州大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院醫(yī)學(xué)遺傳與細(xì)胞生物學(xué)系，鄭州 450052；5.鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，鄭州 450001)

腦卒中是世界范圍內(nèi)導(dǎo)致殘疾和死亡的重要原因，以其高發(fā)病率、高致殘率和高病死率受到普遍關(guān)注。隨著人類平均壽命的逐漸延長(zhǎng)，其發(fā)病率還在逐年上升。流行病學(xué)研究資料表明,我國(guó)腦卒中發(fā)病率為170.3/10萬(wàn),其中80%為缺血性腦卒中。一些研究顯示腦梗死有明顯的家族聚集傾向，一級(jí)親屬發(fā)病率增高和雙生子女發(fā)病一致性的研究結(jié)果也提示遺傳因素與腦梗死發(fā)病密切相關(guān)。目前從分子遺傳學(xué)水平解釋腦梗死的發(fā)病本質(zhì)和遺傳規(guī)律是國(guó)內(nèi)外腦血管病研究的熱門(mén)課題[1-4]。本課題通過(guò)檢測(cè)中國(guó)河南漢族人基質(zhì)金屬蛋白酶9(matrix metalloproteinase，MMP-9)-1562C/T位點(diǎn)的基因多態(tài)性，探索MMP-9基因多態(tài)性與急性缺血性腦卒中的關(guān)系，為精準(zhǔn)預(yù)防和個(gè)體化干預(yù)提供理論依據(jù)。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取2015年4月到2016年7月在鄭州市第一人民醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科住院的急性腦梗死(acute cerebral infarction，ACI)患者300例，男 163例，女 137例，平均年齡(59.69±12.55)歲；對(duì)照組為同期門(mén)診體檢的健康者300例，男145 例，女 155例，平均年齡(58.69±11.71)歲，其性別、年齡與病例組相比差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，具有可比性。病例組的納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)發(fā)病2周內(nèi)的急性腦梗死患者，ACI的診斷符合《2014年中國(guó)急性缺血性腦卒中診斷標(biāo)準(zhǔn)》，經(jīng)臨床檢查(體征、病史、CT/MRI)確診。(2)mRS評(píng)分0～1分患者；(3)患者簽署知情同意書(shū)。本研究獲得醫(yī)院倫理委員會(huì)的批準(zhǔn)。ACI根據(jù)TOAST分型，分為如下3個(gè)亞組：大動(dòng)脈粥樣硬化型(LAA)、小動(dòng)脈閉塞型(SAO)及其他原因型(SUE，包括心源性栓塞、煙霧病及無(wú)明確原因型)。其中大動(dòng)脈粥樣硬化型腦梗死117例，小動(dòng)脈閉塞性腦梗死168例，其他原因型15例，包括心源性栓塞8例，煙霧病2例，不明原因型5例；均為無(wú)血緣關(guān)系的河南地區(qū)漢族人群，無(wú)腦卒中家族史。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)出血性腦梗死、陳舊性或無(wú)癥狀性腦梗死患者；(2)合并其他精神疾病無(wú)法合作或不能合作者；(3)以上兩組均排除嚴(yán)重感染、癲癇、惡性腫瘤、血液或其他系統(tǒng)嚴(yán)重或進(jìn)行性疾病及肝腎功能不全者。

1.2方法

1.2.1引物 引物設(shè)計(jì)參照文獻(xiàn)[5]，上游引物：5′-GCC TGG CAC ATA GTA GGC CC-3′;下游引物：5′-CTT CCT AGC CAG CCG GCA TC-3′。

1.2.2基因組DNA提取 采集所有患者外周靜脈血2 mL,采用EDTA抗凝及酚、氯仿法提取人基因組DNA，無(wú)水乙醇沉淀后，加60 mL ddH2O溶解。

1.2.3基因型分析 以多聚酶鏈反應(yīng)限制性內(nèi)切酶長(zhǎng)度多態(tài)性(PCR-RFLP)分析MMP-9 1562基因型

1.2.3.1MMP-9 1562基因特定片段PCR擴(kuò)增 PCR反應(yīng)體系為50 μL:STR Buffer(包含Mg2+,dNTP,10×Buffer)2.5 μL,上、下游引物各1.0 μL,Taq酶0.3 μL,模板DNA 2 μL,ddH2O 37.7 μL。PCR擴(kuò)增條件：(1) 95 ℃預(yù)變性5 min；(2)30個(gè)循環(huán)擴(kuò)增94 ℃ 1 min,63 ℃ 1 min,72 ℃ 1 min；(3)72 ℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳，溴乙錠(EB)染色檢驗(yàn)擴(kuò)增結(jié)果。

1.2.3.2限制性內(nèi)切酶酶切PCR擴(kuò)增產(chǎn)物 酶切反應(yīng)體系為20 μL，包括PCR擴(kuò)增產(chǎn)物6 μL，Sph I 1 μL,10×Buffer R 2.0 μL,ddH2O 11 μL。酶切產(chǎn)物在37 ℃水浴鍋中溫浴4 h。

1.2.3.3電泳檢測(cè) 酶切產(chǎn)物經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳分析，取6 μL擴(kuò)增產(chǎn)物加入2%瓊脂糖凝膠負(fù)極端的加樣孔，以溴酚藍(lán)為指示劑，EB為染色劑，在100 V電壓下電泳30 min，在凝膠成像儀下觀察帶型并照相。

1.2.3.4準(zhǔn)確性 為檢驗(yàn)基因分型結(jié)果的準(zhǔn)確性，本試驗(yàn)隨機(jī)抽取已分型的3種基因型的部分樣本進(jìn)行基因測(cè)序。

2 結(jié) 果

2.1病例組和對(duì)照組的一般臨床資料 傳統(tǒng)的危險(xiǎn)因素如糖尿病、高血壓等在病例組的比例均高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，見(jiàn)表1。

表1 病例組和對(duì)照組臨床特征的比較

2.2MMP-9-1562位點(diǎn)的凝膠電泳圖 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物大小為435 bp的片段，1562C/T突變后被Sph I識(shí)別，野生型CC基因型只有435 bp一個(gè)片段。雜合子產(chǎn)生3個(gè)片段：435、247、188 bp，純合子突變TT基因型產(chǎn)生247 bp和188 bp兩個(gè)片段，電泳圖見(jiàn)圖1。

圖1 MMP-9 -1562 C/T突變電泳圖譜

2.3MMP-9-1562位點(diǎn)測(cè)序結(jié)果 實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，基因分型結(jié)果與測(cè)序結(jié)果完全一致，圖2為該位點(diǎn)的3種基因型測(cè)序圖。

圖2 3種基因型測(cè)序圖

2.4MMP-9-1562位點(diǎn)多態(tài)性分型結(jié)果 運(yùn)用SHEsis軟件檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，MMP-9基因位點(diǎn)-1562多態(tài)性基因型分布在病例組和對(duì)照組中處于Hardy-Weinberg平衡，具有群體代表性。病例組MMP-9-1562的基因型和等位基因頻率分布結(jié)果見(jiàn)表2，結(jié)果顯示病例組中的CT、TT基因型頻率與對(duì)照組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，病例組T等位基因分布與對(duì)照組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。在顯性和隱性模式中，病例組中的CT+TT基因型和TT基因型頻率與對(duì)照組相比，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

表2 基因型頻率與等位基因頻率在兩組間的比較[n(%)]

2.5MMP-9-1562位點(diǎn)多態(tài)性與ACI亞型的相關(guān)性 ACI亞型中MMP-9-1562基因型頻率及T等位基因頻率差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),見(jiàn)表3。

表3 病例組各亞型基因型頻率與等位基因頻率比較

表4 腦梗死危險(xiǎn)因素的多元逐步Logistic回歸分析

2.6MMP-9-C1562T位點(diǎn)多態(tài)性基因型與腦梗死的關(guān)系 采用Logistic回歸模型進(jìn)行多因素分析，腦梗死是否發(fā)生作為因變量，將MMP-9-C1562T多態(tài)性、Hcy水平、高血壓、糖尿病、高脂血癥作為自變量，結(jié)果顯示高脂血癥、高血壓、糖尿病、Hcy水平可以增加腦梗死的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)，而MMP-9-C1562T基因多態(tài)性不增加腦梗死的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)，見(jiàn)表4。

3 討 論

動(dòng)脈粥樣硬化是心腦血管疾病的病理學(xué)基礎(chǔ)。動(dòng)脈粥樣硬化是由多因素導(dǎo)致的慢性炎癥，動(dòng)脈粥樣斑塊破裂可以導(dǎo)致急性心肌梗死或急性腦梗死的發(fā)生。易損斑塊很薄、炎性且含有高水平的膠原纖維帽，而這些纖維帽的形成與基質(zhì)金屬蛋白酶 (MMPs)的濃度有關(guān)[5]。MMPs通過(guò)對(duì)細(xì)胞外機(jī)制的降解和重塑，從而促使單核細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞遷移，最終導(dǎo)致斑塊纖維帽的降解和斑塊的破裂[6-8]。研究表明：基質(zhì)金屬蛋白酶的水平和它的活性與心腦血管疾病密切相關(guān)，其中MMP-2和MMP-9(分別為明膠酶A和明膠酶B)在缺血時(shí)變化更明顯[9]，因此,推測(cè)遺傳基因多態(tài)性存在，編碼MMPs的基因可能會(huì)影響其循環(huán)水平，使患者更易于罹患心腦血管疾病。

MMP-9又稱明膠酶B是MMP家族中最重要的成分，參與了血管的再生、炎癥反應(yīng)等病理過(guò)程，在動(dòng)脈粥樣硬化、腦缺血及再灌注損傷時(shí)MMPs 表達(dá)增加[9]，導(dǎo)致大量細(xì)胞外基質(zhì)降解，削弱了斑塊纖維帽，促進(jìn)了斑塊的形成，也加速了動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生與發(fā)展[10-12]。

MMP-9 C1562T是MMP9基因轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)子上游 1562位點(diǎn)處存在的一個(gè)重要調(diào)控元件。國(guó)外有研究報(bào)道，當(dāng)此位點(diǎn) C→T 后，可從轉(zhuǎn)錄水平影響基因表達(dá)調(diào)控酶蛋白合成的數(shù)量，最終引起啟動(dòng)子活性相對(duì)增強(qiáng)，蛋白質(zhì)表達(dá)數(shù)量相對(duì)增加。

周軍等[13]研究發(fā)現(xiàn)MMP-9 C1562T CT基因型頻率和T等位基因頻率高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，并且攜帶CT/TT基因型者血漿MMP-9水平較高，顯示中國(guó)人中MMP-9 C1562T CT等位基因與腦梗死發(fā)病相關(guān)。劉筱潔等[14]通過(guò)對(duì)107例動(dòng)脈粥樣硬化性腦梗死患者與98例健康對(duì)照者檢測(cè)基因型發(fā)現(xiàn)，腦梗死組CT+TT基因型頻率為28.04%，對(duì)照組CT+TT基因型頻率為29.27%，T等位基因頻率在兩組中分別為14.00%和6.63%,兩組差異顯著,提示MMP-9 C1562T基因多態(tài)性與動(dòng)脈粥樣硬化性腦梗死相關(guān),T等位基因是動(dòng)脈粥樣硬化性腦梗死的易感基因。然而，有研究表明MMP-9 C1562T基因多態(tài)性與心肌梗死、缺血性腦卒中不存在相關(guān)性[15]。本研究應(yīng)用PCR-RFLP技術(shù)對(duì)300例急性缺血性腦卒中患者和300例對(duì)照組分別進(jìn)行了MMP-9-1562位點(diǎn)基因型分析。發(fā)現(xiàn)CT+TT基因型頻率及T等位基因頻率在兩組之間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。根據(jù)TOAST分型，將ACI組分為L(zhǎng)AA組、SAO組、SOE組，分別研究MMP-9-1562位點(diǎn)多態(tài)性與不同腦梗死亞型的相關(guān)性。結(jié)果發(fā)現(xiàn)在腦梗死亞型中MMP-9-1562基因型頻率及T等位基因頻率差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。在調(diào)整傳統(tǒng)危險(xiǎn)因素后，Logistic回歸分析顯示，高血壓、糖尿病、Hcy水平可以增加腦梗死的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)，而MMP-9-C1562T基因多態(tài)性不增加腦梗死的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)。提示MMP-9-C1562T位點(diǎn)基因突變與急性缺血性腦卒中無(wú)明顯相關(guān),MMP-9-C1562T位點(diǎn)突變可能不足以構(gòu)成腦梗死發(fā)病中的一個(gè)獨(dú)立遺傳性危險(xiǎn)因子。與既往研究報(bào)道相一致[15]。

腦梗死發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，環(huán)境因素和遺傳因素共同參與腦梗死的發(fā)生、發(fā)展。僅僅控制傳統(tǒng)危險(xiǎn)因素還不能很好地減少腦梗死的新發(fā)或復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)，因?yàn)橐恍┻z傳性危險(xiǎn)因素可能會(huì)改變其他已知危險(xiǎn)因素，從而在腦梗死的發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮重要的作用。因此，需要擴(kuò)大樣本量，同時(shí)檢測(cè)基質(zhì)金屬蛋白酶的水平，進(jìn)一步探索MMP9基因多態(tài)性與腦梗死的關(guān)系，明確MMP9基因多態(tài)性在腦梗死發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中確切的分子遺傳機(jī)制。