沉默HIF-1α基因逆轉(zhuǎn)結(jié)腸癌MDR的研究*

楊光磊,胡巖芳,張 叢,許書清,彭林濤,葛國慶,胡延偉,王 釗,張仕東

(邢臺(tái)市人民醫(yī)院:1.普外科；2.神經(jīng)內(nèi)科，河北邢臺(tái) 054031)

表1 HT-29 MCS的水平下各組目的蛋白表達(dá)的抑制情況對(duì)比

a：P<0.05，與B組對(duì)比；b：P<0.05，與D組對(duì)比；c：P<0.05，與E組對(duì)比；d：P<0.05，與C組對(duì)比

結(jié)腸癌為臨床上較為常見惡性腫瘤，化療對(duì)患者的療效有重要影響，但患者不同化療的方式間的敏感性有非常大的差異，患者的治療效果不是很理想，而患者體內(nèi)腫瘤細(xì)胞的多藥耐藥(multidrug resistance,MDR)是其化療失敗的重要因素[1]。腫瘤細(xì)胞不僅對(duì)服用過的藥物產(chǎn)生耐藥性，還會(huì)對(duì)和原藥物作用機(jī)制、結(jié)構(gòu)完全不一樣藥物也發(fā)生較差的耐藥性。相關(guān)研究顯示，造成惡性的腫瘤患者死亡中有近95%都是和腫瘤的耐藥有關(guān)聯(lián)。在結(jié)腸癌患者機(jī)體內(nèi)，腫瘤細(xì)胞的缺氧為正常的狀況，在缺氧所導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞的生物學(xué)特征變化中，缺氧的誘導(dǎo)因子-1(hypoxia inducible factor-1，HIF-1)在這個(gè)過程中有這重要影響。HIF-1α一般在腫瘤細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行過度表達(dá)，和腫瘤患者預(yù)后也有密切聯(lián)系，在缺氧的情況下還會(huì)使腫瘤細(xì)胞對(duì)抗腫瘤藥物的抵抗性加大[2-3]。本文通過探討沉默HIF-1α基因?qū)Y(jié)腸癌MDR逆轉(zhuǎn)的影響，為臨床患者的治療提供一些新的思路。

1 材料與方法

1.1材料與試劑、儀器 (1)材料：人結(jié)直腸腺癌細(xì)胞HT-29細(xì)胞(通派上海生物科技有限公司)。(2)試劑：瓊脂糖粉(美國Sigma公司)、胰酶(美國Hyclone公司)、長春新堿(VCR，浙江海正藥業(yè)股份有限公司)、胎牛血清(FBS，民海生物公司)、二甲亞砜(DMSO，美國Sigma公司)、鹽酸阿霉素(ADR，海正藥業(yè)公司)、伊立替康(CPT-11，山東羅欣藥業(yè)集團(tuán)股份有限公司)、miR的重組慢病毒(美國Invitrogen公司)、5-氟尿嘧啶(5-Fu，上海旭東海普藥業(yè)有限公司)。(3)儀器：CO2的培養(yǎng)箱(美國Thermo Forma公司)、酶標(biāo)儀(型號(hào)：Bio-RAD Model 550，美國Biol-Tiok公司)、流式的細(xì)胞儀(美國Becton Dickinson公司)。

1.2方法

1.2.1培養(yǎng)細(xì)胞 (1)常氧的培養(yǎng)：使用DMEM的高糖培養(yǎng)基對(duì)HT-29細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)，內(nèi)含100 U/mL的鏈霉素、10%的FBS和100 U/mL的青霉素，使用0.3%的胰酶進(jìn)行消化傳代；(2)低氧的培養(yǎng)：向密封的容器內(nèi)充進(jìn)混合的氣體(4% CO2、96% N2)，速度為10 L/min，連續(xù)10 min；(3)使用liquid overlay的技術(shù)對(duì)HT-29細(xì)胞進(jìn)行三維的培養(yǎng)。

1.2.2Western blot法檢查 使用Western blot法檢查HT-29 MCS內(nèi)HIF-1α的miR的重組慢病毒的干擾情況[4]：將HT-29 MCS的實(shí)驗(yàn)細(xì)胞分成5組，Neg-miR感染組(A組)、親本HT-29 MCS未處理(常氧)組(B組)、MDR1 miR感染組(C組)、親本HT-29 MCS未處理(低氧)組(D組)和HIF-1α miR感染組(E組)；分別進(jìn)行3次實(shí)驗(yàn)，取其平均值當(dāng)做最終的結(jié)果。

1.2.3檢查細(xì)胞周期 檢查低氧與常氧情況下HT-29 MCS的細(xì)胞周期[5]：把未處理親本HT-29 的細(xì)胞分成低氧組與常氧組(即D組和B組)，待HT-29 MCS產(chǎn)生中等大小以后，加入無酶的消化液(每孔28 μL)，使MCS的細(xì)胞逐漸分散；使用PBS進(jìn)行2次洗滌，使用流式的細(xì)胞儀進(jìn)行檢測(cè)。

1.2.4檢查化療的敏感性[6]將MDR1或HIF-1α miR的慢病毒感染HT-29細(xì)胞和親本的HT-29細(xì)胞進(jìn)行三維的培養(yǎng)建立HT-29 MCS，采用CPT-11、ADR、5-Fu和VCR檢測(cè)其在低氧和常氧情況下的化療的敏感性。

1.2.5各組HT-29 MCS的細(xì)胞死亡[7]使用流式的細(xì)胞檢測(cè)儀對(duì)CPT-11、ADR、5-Fu和VCR影響后各組細(xì)胞的死亡情況。

2 結(jié) 果

2.1HT-29 MCS的水平下各組目的蛋白表達(dá)的抑制情況 HT-29 MCS的水平下各組目的蛋白表達(dá)的抑制差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見表1。

2.2HT-29 MCS的細(xì)胞周期情況 D組、E組和C組與B組對(duì)比差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，E組與D組對(duì)比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，C組與E組對(duì)比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見表2。

表2 HT-29 MCS的細(xì)胞周期情況對(duì)比

a：P<0.05，與B組對(duì)比；b：P<0.05，與親D組對(duì)比；c：P<0.05，與E組對(duì)比

2.3各組化療的敏感性情況 D組(VCR、ADR、5-Fu)、C組(5-Fu)、E組(5-Fu)與B組對(duì)比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，E組(VCR、ADR、5-Fu)、C組(ADR、VCR)與D組對(duì)比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，C組(5-Fu)與E組對(duì)比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見表3。

2.4各組HT-29 MCS細(xì)胞的死亡情況 D組(VCR、ADR、5-Fu)、C組(5-Fu)、E組(5-Fu)與B組對(duì)比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，E組(VCR、ADR、5-Fu)、C組(ADR、VCR)與D組對(duì)比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，C組(5-Fu)與E組對(duì)比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見表4。

表3 不同藥物影響下各組IC50情況對(duì)比

a：P<0.05，與B組對(duì)比；b：P<0.05，與D組對(duì)比；c：P<0.05，與E組對(duì)比

表4 在藥物的作用下HT-29 MCS細(xì)胞的死亡情況對(duì)比

a：P<0.05，與B組對(duì)比；b：P<0.05，與D組對(duì)比；c：P<0.05，與E組對(duì)比

3 討 論

很多實(shí)體的瘤內(nèi)的缺氧情況很常見，結(jié)腸癌患者的組織缺氧狀況更加明顯。腫瘤的細(xì)胞發(fā)生缺氧以后會(huì)產(chǎn)生代謝與遺傳的變化，不但使細(xì)胞本身繼續(xù)生存增殖，還會(huì)對(duì)很多化療的藥物產(chǎn)生耐受性，致使患者的療效降低[8-10]。HIF-1在腫瘤細(xì)胞的缺氧反應(yīng)中有重要作用，這使它成為扭轉(zhuǎn)缺氧的腫瘤細(xì)胞療效的新靶點(diǎn)。

本文中選取CPT-11、ADR、5-Fu及VCR當(dāng)作沉默靶基因和低氧處理的前后檢查化療的敏感性藥物，這幾種藥物都是臨床上比較常見的，而且他們間的耐藥影響和作用的機(jī)制各不相同。MDR1與HIF-1α的兩套miR的重組慢病毒的干擾體系可以跟隨細(xì)胞進(jìn)行傳代，不但在單層的HT-29的水平上對(duì)目的基因的表達(dá)進(jìn)行沉默，還能夠顯著地對(duì)靶基因蛋白的表達(dá)產(chǎn)生抑制作用。本文研究中對(duì)各組細(xì)胞死亡狀況，使用的Annexin V-APC/PI的檢查系統(tǒng)，工作機(jī)理為在一般的細(xì)胞內(nèi)，磷酯酰絲氨酸(PS)在細(xì)胞膜的脂質(zhì)內(nèi)側(cè)有分布，但在前期細(xì)胞發(fā)生死亡時(shí)，細(xì)胞膜內(nèi)PS會(huì)從內(nèi)側(cè)向外側(cè)進(jìn)行翻轉(zhuǎn)。Annexin V為磷脂結(jié)合的蛋白，它和PS的親和力比較強(qiáng)，可以與前期的細(xì)胞外側(cè)PS進(jìn)行結(jié)合[11-13]。本文研究發(fā)現(xiàn)，低氧能夠使結(jié)腸癌患者的HT-29 MCS細(xì)胞對(duì)5-Fu、VCR和ADR發(fā)生顯著耐藥性，而且細(xì)胞的死亡率比正常情況下的要低。此后經(jīng)過MDR1或者HIF-1α基因驗(yàn)證了HIF-1α受到了明顯的抑制，HT-29 MCS細(xì)胞對(duì)5-Fu、VCR和ADR敏感性明顯加強(qiáng)，藥物的扭轉(zhuǎn)率得到提升，藥物引導(dǎo)下細(xì)胞的死亡率也顯著提升，說明HIF-1α miR的干擾體系結(jié)合藥物能夠使耐藥的細(xì)胞死亡，患者治療效果提高。MDR1基因也受到了明顯地抑制，HT-29 MCS細(xì)胞對(duì)VCR與ADR敏感性顯著加強(qiáng)，藥物的扭轉(zhuǎn)率得到提升，藥物引導(dǎo)下細(xì)胞的死亡率也顯著提升，但對(duì)5-Fu沒有明顯的作用[14-15]。

綜上所述，低氧能夠使結(jié)腸癌的親本HT-29 MCS出現(xiàn)MDR的表型，成為耐藥的模型，沉默HIF-1α能夠顯著逆轉(zhuǎn)HT-29 MCS細(xì)胞對(duì)5-Fu、VCR和ADR的耐藥性。