雞源彎曲菌Ⅰ型整合子-耐藥基因盒結(jié)構(gòu)分析及接合消除研究

周 倩，唐夢(mèng)君，張小燕，張 靜，唐修君，陸俊賢，高玉時(shí)

(江蘇省家禽科學(xué)研究所，江蘇 揚(yáng)州 225125)

彎曲菌(Campylobacter)是重要的人獸共患腸道病原菌，其中空腸彎曲菌(Campylobacter jejuni)和結(jié)腸彎曲菌(Campylobacter coli)最為常見，它們廣泛存在于溫血?jiǎng)游矬w內(nèi)，如家禽、豬、牛和野生鳥類腸道，其中禽類帶菌率最高[1]。彎曲菌具有活而不可培養(yǎng)狀態(tài)(Viable but nonculturable，VNC)，通過(guò)食物鏈傳播，在食品中的分布和傳播情況不穩(wěn)定，加熱和徹底煮熟食物能夠殺死該菌。在預(yù)防和控制家禽疾病的過(guò)程中，大量抗生素使用導(dǎo)致了多重耐藥彎曲菌的產(chǎn)生[2-4]。當(dāng)人類感染了具有抗性的彎曲菌時(shí)，將嚴(yán)重影響自身健康。

整合子是一種可移動(dòng)元件，通常存在于質(zhì)粒和轉(zhuǎn)座子中，因其能夠捕獲、整合和表達(dá)耐藥基因而被廣泛重視。整合子由 3 個(gè)部分組成，包括 5' 和3'保守末端以及兩者之間的可變區(qū)，一個(gè)整合子能夠捕獲多種耐藥基因，基因盒的移動(dòng)是細(xì)菌實(shí)現(xiàn)自我進(jìn)化的重要方式[5]。整合子- 耐藥基因盒不僅可以垂直傳播耐藥基因，而且可以借助結(jié)合性質(zhì)粒、轉(zhuǎn)座子、噬菌體等可移動(dòng)基因元件，在同種和不同種屬細(xì)菌間水平傳播耐藥基因，誘導(dǎo)新的耐藥菌株出現(xiàn)[6]。已發(fā)現(xiàn)的100 多種基因盒大都與耐藥基因相關(guān)[7]。

本研究以2016年～2017年收集的彎曲菌為研究對(duì)象，檢測(cè)其Ⅰ型整合子流行情況和耐藥基因盒結(jié)構(gòu)；采用自然轉(zhuǎn)化法和化學(xué)消除法探究整合子的移動(dòng)穩(wěn)定性，以便深入了解Ⅰ型整合子介導(dǎo)的彎曲菌耐藥性的產(chǎn)生和傳播途徑，為控制耐藥性細(xì)菌的產(chǎn)生和傳播提供科學(xué)參考。

1 材料與方法

1.1 主要實(shí)驗(yàn)材料 2016年5月～2017年8月，從江蘇徐州、南通和揚(yáng)州等7 個(gè)縣市農(nóng)貿(mào)市場(chǎng)、超市和養(yǎng)殖場(chǎng)參照文獻(xiàn)[8-9]分離鑒定得到228 株空腸彎曲菌和84 株結(jié)腸彎曲菌，共計(jì)312 株。彎曲菌標(biāo)準(zhǔn)菌株NCTC11168 和大腸埃希氏菌ACTC25922 由本實(shí)驗(yàn)室保存。CCDA 培養(yǎng)基、MH 培養(yǎng)基、BHI培養(yǎng)基、瓊脂、酵母提取物、胰蛋白胨和27 種藥敏紙片購(gòu)自英國(guó)OXOID 公司。SpeedSTARTMHS DNA Polymerase、MiniBEST DNA Fragment Purification Kit Ver.4.0、pMD20-T載體和E.coliDH5α Competent Cells 購(gòu)自寶生物工程(大連)有限公司；細(xì)菌基因組DNA 提取試劑盒購(gòu)自天根生化科技(北京)有限公司。

1.2 彎曲菌的藥敏試驗(yàn) 采用WHO 推薦的Kirby-Bauer (K-B)法，利用購(gòu)買的 10 類 27 種抗生素藥敏紙片，根據(jù)美國(guó)臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化協(xié)會(huì)(The Clinical and Laboratory Standards Institute，CLSI，2015)標(biāo)準(zhǔn)方法進(jìn)行藥敏試驗(yàn)并判定。

1.3 彎曲菌Ⅰ型整合子- 耐藥基因盒的檢測(cè) 根據(jù)Ⅰ型整合子(DQ149925.1) 5' 保守末端(整合酶int1)和 3' 保守末端(qacEdelta1-Sul1)基因序列，利用 Premier5 設(shè)計(jì)兩對(duì)特異性引物(表1)。引物均由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。

利用試劑盒提取312 株彎曲菌基因組DNA 為模板，采用 PCR 分別擴(kuò)增int1和qacEdelta1-Sul1基因，PCR 擴(kuò)增條件為：95 ℃ 1 min；95 ℃ 30 s、55 ℃30 s、72 ℃ 1 min，共30個(gè)循環(huán)；72 ℃ 10 min。PCR 產(chǎn)物經(jīng)1 %瓊脂糖凝膠電泳后隨機(jī)選取PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司測(cè)序。

根據(jù)int1和qacEdelta1-Sul1基因測(cè)序結(jié)果設(shè)計(jì)Ⅰ型整合子- 耐藥基因盒引物(表1)，以 I 型整合子陽(yáng)性彎曲菌基因組DNA 為模板進(jìn)行PCR 擴(kuò)增整合子 - 耐藥基因盒，PCR 反應(yīng)條件為：95 ℃ 1 min；95 ℃ 30 s、58 ℃ 30 s、72 ℃ 4 min，共 35 個(gè)循環(huán)；72 ℃ 10 min。PCR 產(chǎn)物純化后克隆至 pMD20-T 載體后轉(zhuǎn)化至E.coliDH5α 感受態(tài)細(xì)胞，37 ℃培養(yǎng)后于含氨芐青霉素(Amp)的LB 平板上，篩選陽(yáng)性菌落由上海生工生物工程有限公司測(cè)序。

表1 靶基因引物序列及片段長(zhǎng)度Table 1 Primer sequence and gene length

1.4 彎曲菌自然轉(zhuǎn)化試驗(yàn) 參照文獻(xiàn)[11]采用自然轉(zhuǎn)化法，將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的彎曲菌標(biāo)準(zhǔn)菌株NCTC11168 菌液稀釋至 0.5 麥?zhǔn)蠞舛龋?100 μL 菌液均勻涂布于 2 個(gè) MH 血平板內(nèi)徑 2 cm 的區(qū)域，微需氧 42 ℃培養(yǎng) 6 h～8 h 后取 20 μL 經(jīng)檢測(cè)為耐藥基因盒陽(yáng)性的菌株基因組 DNA 滴加于NCTC11168 菌苔的內(nèi)部區(qū)域，陰性對(duì)照滴加20 μL無(wú)菌PBS，每次試驗(yàn)設(shè)一個(gè)空白對(duì)照(僅接種菌液但不滴加任何溶液)。微需氧培養(yǎng)后根據(jù)1.2 和1.3 進(jìn)行藥敏試驗(yàn)及整合子- 耐藥基因盒檢測(cè)。

1.5 彎曲菌化學(xué)消除試驗(yàn) 將整合子- 耐藥基因盒陽(yáng)性彎曲菌復(fù)蘇于CCDA 平板和MH 血平板，挑取適量MH 血平板菌落加入含0.1 % SDS MH 肉湯培養(yǎng)基(含 5 %無(wú)菌馬血清)，取 50 μL 肉湯培養(yǎng)菌液涂布于MH 血平板，空白對(duì)照為陽(yáng)性菌株接種于不含SDS MH 肉湯培養(yǎng)基(含5%無(wú)菌馬血清)，質(zhì)控對(duì)照為接種彎曲菌NCTC11168。微需氧培養(yǎng)36 h 后根據(jù)1.2 和1.3 進(jìn)行藥敏試驗(yàn)及整合子- 耐藥基因盒檢測(cè)。若整合子未能消除，重復(fù)上述化學(xué)消除步驟。

1.6 數(shù)據(jù)處理 分析int1、qacEdelta1-Sul1和耐藥基因盒測(cè)序結(jié)果，利用BioEdit 和SeqMan 軟件對(duì)序列拼接后進(jìn)行BLAST 比對(duì)分析；耐藥率變化數(shù)據(jù)采用SAS 9.2 進(jìn)行卡方檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1 Ⅰ型整合子- 耐藥基因盒流行特征

2.1.1 Ⅰ型整合子在雞源彎曲菌中的流行情況 通過(guò)PCR 方法擴(kuò)增312 株雞源彎曲菌中的Ⅰ型整合子的int1基因和qacEdelta1-Sul1基因。PCR 及測(cè)序結(jié)果顯示128 株彎曲菌攜帶int1基因，陽(yáng)性率為41%。在128 株int1基因陽(yáng)性彎曲菌中，僅有58 株彎曲菌攜帶Ⅰ型整合子qacEdelta1-Sul1，陽(yáng)性率為18.6 %。表明312 株彎曲菌中，攜帶int1基因的菌株不一定攜帶Ⅰ型整合子qacEdelta1-Sul1，但是攜帶Ⅰ型整合子qacEdelta1-Sul1的菌株一定攜帶int1基因。部分彎曲菌int1基因和qacEdelta1-Sul1基因 PCR 擴(kuò)增結(jié)果見圖1。

2.1.2 Ⅰ型整合子- 耐藥基因盒檢測(cè)結(jié)果及其結(jié)構(gòu)58 株含完整Ⅰ型整合子彎曲菌株中，經(jīng)PCR 擴(kuò)增測(cè)序，結(jié)果顯示15 株菌株(5 株結(jié)腸彎曲菌和10 株空腸彎曲菌)可變區(qū)均檢出耐藥基因aadA1，其余菌株的整合子可變區(qū)未檢測(cè)到耐藥基因盒(圖2)。aadA1耐藥基因編碼對(duì)氨基糖苷類抗生素耐藥。本研究中整合子- 耐藥基因盒結(jié)構(gòu)圖譜見圖3，5' 和 3'保守末端分別為int1基因和qacEdelta1-Sul 1基因，外源耐藥基因aadA1通過(guò)識(shí)別整合子重組位點(diǎn)attI插入到整合子可變區(qū)中，從而使該菌株表現(xiàn)出對(duì)氨基糖苷類抗生素的耐藥性。

圖1 彎曲菌I型整合子的PCR擴(kuò)增Fig.1 The identification of the class I integron in Campylobacter by PCR

圖2 彎曲菌整合子-耐藥基因盒的PCR擴(kuò)增Fig.2 The amplification of gene cassette in the variable region by PCR

圖3 彎曲菌Ⅰ型整合子攜帶aadA1 基因模式圖Fig.3 The schematic diagram of the class 1 integron carrying the aadA1 gene

2.2 彎曲菌的自然轉(zhuǎn)化試驗(yàn)結(jié)果及分析 以15 株aadA1陽(yáng)性彎曲菌基因組為供體，以遺傳背景清晰的敏感菌株空腸彎曲菌NCTC11168 為受體菌進(jìn)行自然轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)，結(jié)果顯示本實(shí)驗(yàn)獲得6 株aadA1基因陽(yáng)性的自然轉(zhuǎn)化子，轉(zhuǎn)化率為40 %。

對(duì)27 種抗生素的藥敏檢測(cè)結(jié)果顯示，6 株自然轉(zhuǎn)化子與陰性對(duì)照組彎曲菌相比，其對(duì)大多數(shù)抗生素的抑菌圈縮小，表明自然轉(zhuǎn)化子獲得整合子結(jié)構(gòu)后能夠產(chǎn)生耐藥性；而9 株接合失敗的菌株顯示對(duì)這些抗生素的抑菌圈增大或不變(表2)，表明大多數(shù)彎曲菌仍然保持對(duì)藥物的敏感性。

表2 彎曲菌自然轉(zhuǎn)化前后耐藥表型變化Table 2 The phenotypic change of drug resistance of the Campylobacters after natural transformation

2.3 彎曲菌化學(xué)消除試驗(yàn)結(jié)果及分析 將攜帶aadA1基因盒的耐藥彎曲菌進(jìn)行整合子- 耐藥基因盒消除試驗(yàn)。15 株彎曲菌經(jīng)過(guò)0.1 % SDS 化學(xué)處理，5 株彎曲菌能夠一次化學(xué)消除整合子結(jié)構(gòu)，所有菌株經(jīng)5 次處理以后，PCR 未檢測(cè)到整合子。表明經(jīng)0.1% SDS 化學(xué)處理能夠成功消除整合酶int1基因。部分彎曲菌株消除整合酶int1基因前后的PCR 檢測(cè)結(jié)果見圖4。

經(jīng)0.1% SDS 化學(xué)處理后，部分抗菌藥物耐藥率在消除整合酶int1基因前后發(fā)生改變。其中對(duì)氨基糖苷類抗生素的耐藥率變化最大，其它藥物均未發(fā)生明顯變化(表3)。表明隨著整合子- 耐藥基因盒的消除，部分菌株對(duì)氨基糖苷類藥物耐藥性發(fā)生逆轉(zhuǎn)。

圖4 部分彎曲菌菌株整合酶基因消除前后的PCR鑒定Fig.4 The identification of the isolates with the int1 gene before and after eliminating by PCR

表3 化學(xué)消除試驗(yàn)前后彎曲菌耐藥性變化Table 3 The change of antibiotic resistance rate before and after chemical eliminating

3 討 論

彎曲菌作為一種重要的人獸共患病病原菌，不僅能夠引起人類和動(dòng)物細(xì)菌性腹瀉，還可以引起格林- 巴利綜合征[12]。本研究中彎曲菌的Ⅰ型整合子陽(yáng)性率為18.6 %，采用PCR 擴(kuò)增Ⅰ型整合子的可變區(qū)，測(cè)序比對(duì)結(jié)果顯示15 株彎曲菌均擴(kuò)增出1 825 bp大小相同的條帶，為氨基糖苷類抗生素耐藥基因aadA1，基因盒單一。

在自然條件下，細(xì)菌攝取外源DNA 并轉(zhuǎn)化為自身遺傳物質(zhì)，該過(guò)程稱為自然轉(zhuǎn)化[11]。通常情況下，耐藥基因可以通過(guò)轉(zhuǎn)座子和整合子等可移動(dòng)元件在質(zhì)?；蚴侨旧w間遷移擴(kuò)散[13]。本研究表明在實(shí)驗(yàn)室條件下，I 型整合子能夠由供體菌DNA 自然轉(zhuǎn)化到受體彎曲菌NCTC11168 中，轉(zhuǎn)化率為40 %。而鄧?guó)P如證明在實(shí)驗(yàn)室條件下aadE-Sat4-aphA3及其氨基糖類耐藥基因島(type I、type II 和 type III)均能夠通過(guò)自然轉(zhuǎn)化的方式由耐藥供體菌C.coli轉(zhuǎn)移到敏感受體菌C.jejuniNCTC11168，發(fā)生了跨彎曲菌亞種的傳播，轉(zhuǎn)化率達(dá)100 %[11]。基于現(xiàn)有的研究和自然轉(zhuǎn)化試驗(yàn)的結(jié)果，本研究推測(cè)彎曲菌中的aadA1基因盒是通過(guò)自然轉(zhuǎn)化的方式傳播，但彎曲菌不同于其它的大多數(shù)細(xì)菌，苛刻的培養(yǎng)環(huán)境導(dǎo)致了其傳播過(guò)程的穩(wěn)定性。此外，彎曲菌中整合位點(diǎn)的多樣性和選擇性也影響自然轉(zhuǎn)化的轉(zhuǎn)化率。獲取外源DNA 的細(xì)菌通常能夠獲得抗藥性和致病性[14-15]，整合子的成功轉(zhuǎn)化表明受體菌株獲得整合子后獲得部分耐藥性。以此推斷，多重耐藥彎曲菌可以通過(guò)食品源動(dòng)物將細(xì)菌耐藥性傳遞給人類，造成其耐藥性增加。自然轉(zhuǎn)化成功表明整合子能夠通過(guò)同源重組的方式使耐藥基因盒在彎曲菌中發(fā)生水平傳播。

在實(shí)驗(yàn)室條件下，采用化學(xué)消除法能夠消除耐藥基因盒從而消除細(xì)菌耐藥性，本研究消除氨基糖苷類抗生素耐藥基因盒前后，彎曲菌耐藥率變化明顯，表明整合子- 耐藥基因盒消除能夠部分逆轉(zhuǎn)彎曲菌的耐藥性。而化學(xué)消除雖然操作便捷，但消除率低。有研究顯示用中藥(如三黃片和艾葉草)對(duì)臨床分離的大腸桿菌耐藥質(zhì)粒的消除率為31 %和60 %[16-17]，本研究利用SDS 對(duì)彎曲菌第一輪的消除率為33 %，與三黃片消除效果相當(dāng)。

綜上所述，雖然化學(xué)消除能夠一定程度消除細(xì)菌對(duì)抗生素的耐藥性，但隨著接合的發(fā)生使耐藥消除菌株又重新獲得耐藥性，給疾病防治和耐藥性阻斷帶來(lái)很大困難。單純消除整合子耐藥基因盒結(jié)構(gòu)在致病菌耐藥性流行的防控中難以取得明顯效果，因此，在家禽養(yǎng)殖中需要強(qiáng)化科學(xué)用藥、精準(zhǔn)用藥，以提高禽產(chǎn)品質(zhì)量安全控制水平，加強(qiáng)食品安全風(fēng)險(xiǎn)管理。