應(yīng)用環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)檢測(cè)江蘇水稻種子攜帶的水稻惡苗病菌

袁詠天 戎振洋 葉文武 張紅生 莊義慶 鄭小波,*

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應(yīng)用環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)檢測(cè)江蘇水稻種子攜帶的水稻惡苗病菌

袁詠天1戎振洋1葉文武1張紅生2莊義慶3鄭小波1,*

(1南京農(nóng)業(yè)大學(xué) 植物保護(hù)學(xué)院，南京 210095；2南京農(nóng)業(yè)大學(xué) 農(nóng)學(xué)院，南京 210095；3鎮(zhèn)江市農(nóng)業(yè)科學(xué)院，江蘇 鎮(zhèn)江 212400；*通訊聯(lián)系人，E-mail: xbzheng@njau.edu.cn)

【目的】本研究旨在了解江蘇省水稻主栽品種種子攜帶水稻惡苗病原菌的情況?！痉椒ā坎捎铆h(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)(loop-mediated isothermal amplification，LAMP)對(duì)江蘇65個(gè)水稻主栽品種種子攜帶藤倉鐮孢、層出鐮孢、擬輪枝鐮孢和等4種水稻惡苗病菌進(jìn)行檢測(cè)。【結(jié)果】65個(gè)品種中有54個(gè)品種的種子樣本攜帶惡苗病菌，表明江蘇省稻種攜帶水稻惡苗病菌是一種普遍現(xiàn)象。其中，藤倉鐮孢為優(yōu)勢(shì)種，檢出率高達(dá)83.07%，其次是層出鐮孢和，檢出率分別為12.30%、6.15%，但供試的65個(gè)品種種子均未檢測(cè)到攜帶有擬輪枝鐮孢?！窘Y(jié)論】該技術(shù)可用于水稻種子攜帶惡苗病菌的快速檢測(cè)。

水稻惡苗?。环N子帶菌檢測(cè)；環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)；

惡苗病是水稻上重要的種傳病害之一，是江蘇省稻區(qū)的常見病害[1]。近年來，隨著旱育秧技術(shù)和粳稻品種的推廣以及惡苗病菌對(duì)浸種藥劑產(chǎn)生抗藥性，惡苗病在江蘇省的發(fā)病率逐漸上升，嚴(yán)重影響水稻產(chǎn)量[2]。目前研究表明，水稻惡苗病是由藤倉鐮孢菌()、擬輪枝鐮孢菌()、層出鐮孢菌()和導(dǎo)致的[3]。其中，藤倉鐮孢致病力最強(qiáng)，分布最廣，是引起水稻惡苗病的主要致病菌[4]。

種子的健康狀況與水稻生產(chǎn)密切相關(guān)，其質(zhì)量是影響水稻產(chǎn)量的重要因素之一[5]。有研究表明，稻種攜帶的惡苗病菌是該病的主要初侵染源，帶菌種子調(diào)運(yùn)是該病遠(yuǎn)距離傳播和擴(kuò)散的重要途徑[6, 7]。在種子的形成、收獲和儲(chǔ)藏過程中，病原菌常以菌絲或孢子的形式寄藏于種子表面或內(nèi)部，使種子變色甚至腐爛，嚴(yán)重影響種子質(zhì)量和萌芽率[8-9]。因此，做好種子的帶菌檢測(cè)是保證種子質(zhì)量的重要手段，有助于預(yù)防種傳病害的發(fā)生與傳播，對(duì)水稻生產(chǎn)具有積極意義。

關(guān)于水稻種子帶菌檢測(cè)方面已有許多研究，應(yīng)用的檢測(cè)技術(shù)包括傳統(tǒng)檢測(cè)法和現(xiàn)代的分子生物學(xué)技術(shù)。其中比較常用的有分離培養(yǎng)法、洗滌檢驗(yàn)法、吸水紙保濕檢驗(yàn)法、瓊脂平皿檢驗(yàn)法以及基于PCR的分子檢測(cè)方法等[10-14]。這些檢測(cè)方法雖能反映種子的帶菌情況，但都存在一定缺陷，如檢測(cè)所需時(shí)間長，或檢測(cè)結(jié)果準(zhǔn)確度偏低，或需要昂貴而精密的儀器。由于種子上攜帶的病原菌種類多而雜，依賴傳統(tǒng)組織分離和形態(tài)學(xué)鑒定方法，很難達(dá)到快速準(zhǔn)確的檢驗(yàn)?zāi)康腫15]。尤其是惡苗病菌中的藤倉鐮孢和層出鐮孢，它們不僅在形態(tài)學(xué)上極為相似，基因序列上也很接近，鑒定難度很大[3, 16]。因此，有必要探索針對(duì)水稻種子攜帶惡苗病菌的快速檢測(cè)與鑒別的新技術(shù)。

環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)(loop-mediated isothermal amplification, LAMP)[17]，與傳統(tǒng)的檢測(cè)方法相比，具有檢測(cè)特異性強(qiáng)、靈敏度高、所需時(shí)間短和檢測(cè)結(jié)果可直接用肉眼判別等優(yōu)點(diǎn)[18]。我們應(yīng)用本實(shí)驗(yàn)室前期研發(fā)的可以分別特異性檢測(cè)4種水稻惡苗病菌的4項(xiàng)LAMP檢測(cè)技術(shù)，以江蘇省65個(gè)水稻品種種子為樣本開展種子攜帶惡苗病菌的檢測(cè)，旨在了解江蘇省水稻品種攜帶水稻惡苗病原菌的現(xiàn)狀，同時(shí)為水稻種子攜帶惡苗病菌的快速檢測(cè)與鑒別提供新技術(shù)。

1 材料與方法

1.1 供試水稻品種的收集

2017年5月至7月，從江蘇省南部、中部、北部的8個(gè)不同地區(qū)共收集了水稻主栽品種65個(gè)，收集的每份稻種用牛皮紙袋裝好并編號(hào)，記錄來源地信息。

1.2 水稻種子攜帶惡苗病菌DNA的提取

為了保證檢測(cè)結(jié)果的可靠性，本研究分別采用三種不同的方法來提取水稻種子所攜帶病原菌的DNA，包括水洗法、研磨法和水洗后研磨法。所提取的DNA樣本作為LAMP檢測(cè)的模板，于－20℃下保存。

1.2.1 水洗法

供試水稻種子在容器中混勻后，采用五點(diǎn)取樣法，每一品種稱取50 g種子，然后裝入250 mL三角瓶中，加入200 mL ddH2O并滴加20%吐溫3~5滴。用錫箔紙封住瓶口，置超聲波清洗器的水槽內(nèi)，以40 kHz的頻率震蕩洗滌10 min。用200目鋼篩過濾震蕩洗滌后的混合液，鋼篩上剩下的水稻種子用少量ddH2O沖洗。將收集的濾液分裝于50 mL離心管中，用冷凍離心機(jī)以6500 r/min的轉(zhuǎn)速離心5 min，棄上清液后收集沉淀[18]。將沉淀物置于37℃恒溫箱中晾干，沉淀物DNA的提取采用美國MOBIO公司的土壤微生物DNA強(qiáng)力提取試劑盒PowerSoil?DNA分離試劑盒，方法步驟參見說明書[19]。

1.2.2 研磨法

供試水稻種子在容器中混勻后，采用五點(diǎn)取樣法，每一品種稱取10g種子，置于滅菌的研缽中，加入石英砂與液氮充分研磨成粉末，將研磨好的粉末充分混勻后，每份樣本稱取1.2 g，分裝入容積為2 mL的EP管中，每管0.4 g。DNA的提取采用中國北京天根公司的新型植物基因組DNA提取試劑盒(DNAsecure Plant Kit)進(jìn)行，方法步驟參見說明書。每品種所提取的3管DNA分別進(jìn)行LAMP檢測(cè)，當(dāng)有1管及1管以上的DNA樣本檢測(cè)呈陽性時(shí)，即判定該樣本攜帶目標(biāo)病原菌。

1.2.3 水洗后研磨法

即將超聲波水洗處理過濾后殘留在鋼篩上的水稻種子用ddH2O沖洗干凈，取10g用研磨法提取DNA。具體步驟參照以上兩種方法。

表1 用于檢測(cè)藤倉鐮孢的LAMP引物

1.3 水稻種子攜帶病原菌的LAMP檢測(cè)

采用本實(shí)驗(yàn)室研發(fā)的4項(xiàng)LAMP檢測(cè)技術(shù)，可分別特異性檢測(cè)水稻惡苗病的4種致病菌，即藤倉鐮孢()、層出鐮孢()、擬輪枝鐮()和。藤倉鐮孢的LAMP特異性引物見表1，其擴(kuò)增條件和靈敏度分別為62℃，70 min和100 μg/L。層出鐮孢、擬輪枝鐮孢和的LAMP特異性檢測(cè)技術(shù)體系見表2。

LAMP反應(yīng)體系的總體積為26 μL，其中，10×ThermoPol 緩沖液2.5 μL，MgSO4(50 mmol/L) 4 μL，甜菜堿(5 mol/L) 4 μL，dNTPs(10 mmol/L) 3.5 μL，內(nèi)引物FIP和BIP(20 μmol/L)各2 μL，外引物F3和B3(10 μmol/L)分別為0.5 μL，環(huán)引物L(fēng)F和LB(10 μmol/L)分別為1 μL，羥基萘酚藍(lán)(2.4 mmol/L) 2 μL，DNA聚合酶(8 U/μL) 1 μL，水稻種子樣品提取的DNA(作為模板)2 μL。反應(yīng)溫度是62℃，恒溫，反應(yīng)時(shí)間為70 min。反應(yīng)結(jié)果可用肉眼直接進(jìn)行觀察判斷，呈天藍(lán)色時(shí)為陽性，呈紫色則為陰性。檢測(cè)過程中以特定的目標(biāo)病原菌標(biāo)準(zhǔn)菌株純培養(yǎng)提取的DNA為模板作為陽性對(duì)照，以ddH2O代替病菌的DNA作為陰性對(duì)照[18]。

1.4 發(fā)病稻苗病原菌的分離驗(yàn)證

為進(jìn)一步驗(yàn)證水洗法LAMP檢測(cè)稻種攜帶惡苗病菌的結(jié)果，選擇-Ff-LAMP、- Fp-LAMP、-Fv-LAMP、-Fan-LAMP檢測(cè)呈陽性的水稻品種，分別隨機(jī)稱10 g種子置于培養(yǎng)皿中，在常溫下用ddH2O浸泡種子，每隔9 h換一次ddH2O，18 h后轉(zhuǎn)移至28℃恒溫培養(yǎng)箱中直到稻種露白。將露白稻種播在盛有滅菌蛭石的塑料盆中，置27℃溫室中育苗20 d誘導(dǎo)幼苗自然發(fā)病。每一供試品種選取20株疑似發(fā)病幼苗(即呈現(xiàn)徒長、矮化、褪綠和死苗等惡苗病疑似癥狀的小苗)，剪取其根莖部(每株取病組織200 mg)分別提取DNA作為模板供LAMP檢測(cè)。同時(shí)，對(duì)上述疑似發(fā)病稻苗進(jìn)行病原菌分離與鑒定。將病組織剪成0.5 cm大小的組織塊，置70%酒精中表面消毒1 min，移至2% NaClO中浸泡2 min，用無菌水沖洗3次。沖洗后的組織塊用滅菌的濾紙片吸干表面的自由水，置于PDA培養(yǎng)基平板上，在25℃黑暗條件下培養(yǎng)3 d后，切取菌落邊緣菌絲轉(zhuǎn)入新的PDA培養(yǎng)基上純化。分離物純菌絲的基因組采用中國北京天根公司的新型植物基因組DNA提取試劑盒提取。根據(jù)病原菌形態(tài)和Tef-1α堿基序列比對(duì)進(jìn)行惡苗病菌種的鑒定。

表2 3種水稻惡苗病原菌的LAMP檢測(cè)技術(shù)體系

2 結(jié)果與分析

2.1 水洗法LAMP檢測(cè)水稻種子攜帶的水稻惡苗病菌

應(yīng)用本實(shí)驗(yàn)室研發(fā)的分別特異性針對(duì)水稻惡苗病4種致病菌的4種LAMP檢測(cè)技術(shù)，以水洗法(見1.2.1)提取的DNA為模板，對(duì)江蘇省65個(gè)品種的水稻種子攜帶的惡苗病菌進(jìn)行LAMP檢測(cè)。以品種寧粳6號(hào)種子帶菌的LAMP檢測(cè)結(jié)果為例(圖1)，圖中為以寧粳6號(hào)種子采用水洗法提取的DNA作為模板，1~4依次為可特異性檢測(cè)藤倉鐮孢、層出鐮孢、擬輪枝鐮孢和的LAMP反應(yīng)結(jié)果(陽性呈天藍(lán)色，陰性呈紫色)，可通過肉眼觀察直接判別其水稻種子攜帶有藤倉鐮孢和層出鐮孢2種病原菌。

以水洗法獲得的稻種洗滌沉淀物所提取的DNA為模板，對(duì)江蘇省不同區(qū)域來源的65個(gè)水稻品種種子攜帶水稻惡苗病菌的LAMP檢測(cè)結(jié)果見表3。供試的65個(gè)品種的水稻種子樣本中有54個(gè)樣本攜帶惡苗病菌，即83.07%的種子樣本攜帶該病原菌。所有樣本中共檢測(cè)到3種水稻惡苗病菌：藤倉鐮孢的檢出率最高，達(dá)83.07%，54個(gè)帶菌樣本均攜帶有該病原菌；其次是層出鐮孢，檢出攜帶該病原菌的樣本有8份，檢出率為12.30%；再次是，檢出樣本有4份，檢出率為6.15%；所有供試樣本均未檢測(cè)到擬輪枝鐮孢。65個(gè)水稻品種中，只檢測(cè)到攜帶藤倉鐮孢一種病原菌的有42份，占所檢測(cè)總樣本數(shù)的64.61%；有12份樣本同時(shí)攜帶藤倉鐮孢和層出鐮孢或，占所檢測(cè)樣本的18.46%，前者有8份樣本，后者為4份。

上述結(jié)果表明江蘇省水稻品種攜帶水稻惡苗病菌是一個(gè)普遍現(xiàn)象，且其優(yōu)勢(shì)種為藤倉鐮孢，層出鐮孢和可能僅起輔助作用。此外，從表3還可以看出，藤倉鐮孢在所采集的8個(gè)地區(qū)普遍分布，而層出鐮孢和僅在部分區(qū)域被檢測(cè)到。3種惡苗病菌在江蘇省的南部、中部和北部均有分布。

表3 江蘇省65個(gè)水稻品種種子攜帶水稻惡苗病原菌的LAMP檢測(cè)

－藤倉鐮孢；－層出鐮孢；－；－: 沒有檢測(cè)到。

,;,;,;－, Undetected.

2.2 水洗法LAMP檢測(cè)水稻惡苗病菌的可靠性

為了探究水洗法LAMP檢測(cè)水稻惡苗病菌是否能夠反映稻種攜帶惡苗病菌的真實(shí)狀況，本研究進(jìn)一步以研磨法提取的DNA為模板進(jìn)行LAMP檢測(cè)，并對(duì)帶菌稻種育苗后自然發(fā)病的稻苗進(jìn)行病原菌分離鑒定加以驗(yàn)證。

1－藤倉鐮孢；2－層出鐮孢；3－擬輪枝鐮孢；4－Fusarium andiyazi；5－陰性對(duì)照。

Fig. 1. Results of loop-mediated isothermal(LAMP) assays for rice bakanae pathogens on rice seeds of cultivar Ningjing 6.

2.2.1 以研磨法提取的DNA為模板的LAMP檢測(cè)

根據(jù)水洗法LAMP檢測(cè)水稻惡苗病菌的結(jié)果，從表3中選取不同帶菌類型的40個(gè)水稻品種的種子樣本，包括未檢測(cè)出攜帶惡苗病菌的品種11個(gè)，只攜帶藤倉鐮孢一種病原菌的品種17個(gè)，同時(shí)攜帶藤倉鐮孢和層出鐮孢的品種8個(gè)，同時(shí)攜帶藤倉鐮孢和的品種4個(gè)。所選取的40個(gè)品種的種子采用研磨法(見1.2.2)提取DNA為模板進(jìn)行LAMP檢測(cè)，并將檢測(cè)結(jié)果與水洗法比較。結(jié)果表明，11份經(jīng)水洗法檢測(cè)未攜帶惡苗病菌的稻種采用研磨檢測(cè)也均未檢出該病原菌，兩者檢測(cè)結(jié)果一致；17個(gè)只攜帶藤倉鐮孢的種子樣本中檢出攜帶該病菌的樣本有13份；8個(gè)同時(shí)攜帶藤倉鐮孢和層出鐮孢的樣本中，檢出攜帶藤倉鐮孢的樣本有7份，攜帶層出鐮孢的樣本有4份；4個(gè)同時(shí)攜帶藤倉鐮孢和的樣本中，檢出攜帶藤倉鐮孢的樣本有3份，攜帶的樣本0份；所有供檢測(cè)種子樣本中均未檢出擬輪枝鐮孢。

比較兩種不同的種子帶菌DNA提取方法的LAMP檢測(cè)結(jié)果可以看出，水洗法的結(jié)果似更能反映水稻種子攜帶惡苗病菌的真實(shí)狀況。分析其原因，一是本研究采用的水洗法在DNA提取過程中加入了超聲波處理的程序，不僅有利于洗脫附著種子表面的菌絲和孢子，病種子的組織碎片以及破損病種內(nèi)部的病原菌亦可能被洗脫出來；二是水洗法比研磨法更有利于富集附著于種子表面的病原菌，有助于提高混雜于種子中或附著在種子表面的病原菌的檢出率。部分采用水洗法檢測(cè)出攜帶惡苗病菌的種子樣本采用研磨法未檢測(cè)到該病原菌，主要原因可能是這些種子樣本所攜帶的病原菌混雜在種子中或附著于種子表面且?guī)Ь科退隆?1份經(jīng)水洗法未檢測(cè)到惡苗病菌的種子樣本用研磨法也都未檢測(cè)到病原菌，進(jìn)一步為用水洗法提取的DNA作為模板進(jìn)行LAMP檢測(cè)結(jié)果的可靠性提供了佐證。根據(jù)上述研究結(jié)果，我們認(rèn)為本研究采用的水洗法對(duì)稻種攜帶惡苗病菌的檢測(cè)是可行的。

2.2.2 發(fā)病稻苗病原菌分離鑒定的驗(yàn)證結(jié)果

為進(jìn)一步驗(yàn)證本研究的LAMP檢測(cè)結(jié)果，我們選取同時(shí)攜帶藤倉鐮孢和層出鐮孢的品種寧粳6號(hào)和同時(shí)攜帶藤倉鐮孢和的品種鹽稻11分別育苗，誘導(dǎo)稻苗自然發(fā)病后，對(duì)疑似惡苗病發(fā)病小苗組織提取的DNA進(jìn)行LAMP檢測(cè)，并采用組織分離法分離病原菌。對(duì)寧粳6號(hào)育成的20株疑似發(fā)病稻苗的檢測(cè)與分離的結(jié)果表明，有13株稻苗經(jīng)藤倉鐮孢的LAMP檢測(cè)呈陰性，有2株經(jīng)層出鐮孢的LAMP檢測(cè)呈陽性，其余5株檢測(cè)均呈陰性。提示上述陽性病苗樣本可能分別由藤倉鐮孢或?qū)映鲧犳咔秩舅?。進(jìn)一步對(duì)檢測(cè)的所有樣本進(jìn)行組織分離和分離物鑒定。13株經(jīng)藤倉鐮孢LAMP檢測(cè)呈陽性的稻苗中有12株分離出藤倉鐮孢，2株經(jīng)層出鐮孢的LAMP檢測(cè)呈陽性的稻苗中有1株分離出層出鐮孢，其他陰性樣本均未分離到該兩種病原菌，證實(shí)上述陽性病苗的確分別由藤倉鐮孢或?qū)映鲧犳咔秩舅?。?duì)鹽稻11的20株疑似發(fā)病稻苗的檢測(cè)與分離的結(jié)果表明，有15株經(jīng)藤倉鐮孢的LAMP檢測(cè)呈陽性，從其中12株分離出藤倉鐮孢，有3株經(jīng)的LAMP檢測(cè)呈陽性，從其中1株分離出。其他檢測(cè)呈陰性的樣本均未分離到該兩種病原菌，證實(shí)上述陽性病苗的確分別由藤倉鐮孢或侵染所致。

經(jīng)水洗法LAMP檢測(cè)呈陽性的稻種育苗可自然誘發(fā)惡苗病，并從發(fā)病組織分離出所檢測(cè)的惡苗病菌，進(jìn)一步驗(yàn)證了水洗法LAMP檢測(cè)的可靠性。同時(shí)，攜帶藤倉鐮孢與層出鐮孢的寧粳6號(hào)和攜帶藤倉鐮孢與的鹽稻11育出的病苗中，藤倉鐮孢的發(fā)病率遠(yuǎn)高于層出鐮孢和，表明藤倉鐮孢對(duì)水稻具更強(qiáng)的致病力，提示該病原菌可能是引起江蘇水稻惡苗病的優(yōu)勢(shì)種。此外，稻苗發(fā)病組織的LAMP檢出率與病原菌組織分離的檢出率存在一定差異，可能原因是LAMP檢測(cè)的檢出率顯著高于組織分離的檢出率。

2.2.3 以水洗后研磨法提取的DNA為模板的LAMP檢測(cè)結(jié)果

根據(jù)表3的結(jié)果，選擇同時(shí)攜帶藤鐮倉鐮孢和層出鐮孢、藤倉鐮孢和以及只攜帶藤倉鐮孢的品種各2個(gè)，用水洗后研磨法提取DNA為模板供LAMP檢測(cè)。將該檢測(cè)結(jié)果與水洗法和研磨法檢測(cè)的結(jié)果進(jìn)行對(duì)比(表4)，以了解惡苗病菌在種子的存在部位。供試的稻種，經(jīng)水洗法去除表面攜帶的病原菌后，進(jìn)一步采用研磨法提取DNA經(jīng)LAMP檢測(cè)，仍有4個(gè)品種檢出藤倉鐮孢，但均未檢測(cè)出層出鐮孢和。表明藤倉鐮孢既存在種子表面，也存在種子內(nèi)部，而層出鐮孢和則主要附著于種子表面。未經(jīng)水洗的稻種用研磨法提取的DNA檢測(cè)到層出鐮孢而未檢測(cè)到，可能是因種子表面的攜帶量太少。

表4 3種提取方法的LAMP檢測(cè)結(jié)果對(duì)比

－藤倉鐮孢；－層出鐮孢；－；－: 沒有檢測(cè)到。

,;,;,;－, Undetected.

3 討論

本研究應(yīng)用分別特異性針對(duì)4種水稻惡苗病菌的4項(xiàng)LAMP檢測(cè)技術(shù)，對(duì)江蘇省65個(gè)水稻主栽品種種子進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果顯示，供試的65個(gè)品種的水稻種子樣本中有54個(gè)樣本攜帶惡苗病菌；共檢測(cè)到3種惡苗病菌，檢出率由高到低依次為藤倉鐮孢、層出鐮孢和；所有檢測(cè)樣本均未檢測(cè)到攜帶有擬輪枝鐮孢。結(jié)果表明江蘇省水稻種子攜帶惡苗病菌是一種普遍現(xiàn)象，且藤倉鐮孢為優(yōu)勢(shì)致病菌，為了解當(dāng)?shù)厮痉N子攜帶惡苗病菌的情況提供了有價(jià)值的參考。

同時(shí)，本研究為水稻種子攜帶惡苗病菌的檢測(cè)提供了一個(gè)操作簡(jiǎn)便、快捷且準(zhǔn)確性高的檢測(cè)技術(shù)。過去的研究表明，惡苗病菌可附著于水稻種子表面或寄藏于種子內(nèi)部[7]。因此需要探尋并建立適用的種子攜帶病原菌基因組DNA提取方法以盡可能提升LAMP檢測(cè)結(jié)果的可靠性。研磨法對(duì)檢測(cè)種子內(nèi)部寄藏的病原菌是可行的，但對(duì)檢測(cè)種子外部攜帶的病原菌(混雜于種子中或附著于種子表面的病原菌)則適用性偏低，尤其是種子外部攜帶病原菌的量偏低時(shí)漏檢的機(jī)率大。且受采用試劑盒提取DNA方法的限制，研磨法難以滿足對(duì)較大種子樣本進(jìn)行檢測(cè)的需要，因而可能影響檢測(cè)結(jié)果的可靠性。本研究建立的水洗法提取種子攜帶惡苗病菌DNA的方法，在種子洗滌過程中增加了超聲波震蕩處理，有助于最大限度地洗脫附著于種子表面的病原菌、病種子組織碎片以及破損病種子內(nèi)部的病原菌。而且，洗滌液經(jīng)離心可進(jìn)一步將目標(biāo)病原菌富集于沉淀物中，有助于顯著提高檢出率和檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性。此外水洗法操作簡(jiǎn)便，適用于對(duì)較大種子樣本進(jìn)行檢測(cè)，可降低漏檢的機(jī)率，符合實(shí)際應(yīng)用的需求。因此，以水洗法提取的基因組DNA為模板對(duì)水稻種子攜帶惡苗病菌進(jìn)行LAMP檢測(cè)是較為可行的方法。

以往的水稻種子帶菌檢測(cè)，大多需要先分離獲得病原菌的純培養(yǎng)，然后根據(jù)其形態(tài)特征進(jìn)行病原菌種類鑒定[13]。操作過程繁瑣，耗時(shí)較長，且檢出率偏低。近年來報(bào)道的基于PCR檢測(cè)稻種攜帶惡苗病菌的方法[14]，對(duì)種子帶菌檢測(cè)技術(shù)有所提升，但也存在對(duì)DNA模板要求較高、操作程序偏繁瑣，檢測(cè)所需時(shí)間偏長等缺點(diǎn)。本研究應(yīng)用的LAMP檢測(cè)技術(shù)具有以下優(yōu)點(diǎn)：1)其4條引物可特異性識(shí)別目標(biāo)病原菌的6個(gè)靶標(biāo)區(qū)段，對(duì)識(shí)別目標(biāo)病原菌的特異性更高，并可在等溫條件高效快速地?cái)U(kuò)增靶標(biāo)基因[17]；2)操作簡(jiǎn)單，經(jīng)濟(jì)，不需要昂貴的儀器設(shè)備[22]；3)由于在擴(kuò)增反應(yīng)體系中加入指示劑羥基萘酚藍(lán)(HNB)，擴(kuò)增反應(yīng)結(jié)果可直接用肉眼判斷，陽性反應(yīng)結(jié)果呈天藍(lán)色，陰性呈紫色；4)檢測(cè)所需時(shí)間短，應(yīng)用本技術(shù)完成一次水稻種子帶菌檢測(cè)(從水洗法提取DNA到檢測(cè)完成)只需4 h左右；5)對(duì)DNA模板質(zhì)量要求不高，可從包含目標(biāo)病原菌、稻種組織、塵土顆粒以及其他微生物的混合DNA中直接檢出目標(biāo)病原菌。此外，本研究運(yùn)用的4個(gè)LAMP檢測(cè)技術(shù)是特異性針對(duì)水稻惡苗病的4種致病菌的，因而病原菌的檢測(cè)與種的鑒定可同步完成，大大提高了稻種攜帶惡苗菌的檢測(cè)效率。

本研究還對(duì)來自浙江、安徽、廣西、福建等地區(qū)的15個(gè)水稻種子攜帶惡苗病菌進(jìn)行了LAMP檢測(cè)，有10份樣本檢測(cè)出攜帶有藤倉鐮孢(結(jié)果未顯示)，提示我國南方稻區(qū)種子攜帶藤倉鐮孢可能較為普遍。值得注意的是，來自江蘇和南方其他省份的80份水稻種子樣本中均未檢測(cè)到攜帶有擬輪枝鐮孢，提示種子帶菌可能不是擬輪枝鐮孢引起水稻惡苗病的主要初侵染源。我們對(duì)2016－2017年從江蘇不同區(qū)域稻田采集的近200份疑似惡苗病菌植株中檢測(cè)出21份由擬輪枝鐮孢引起的病害樣本，并從病組織中分離出該病原菌，提示由擬輪枝鐮孢引起的惡苗病在江蘇省有一定程度的發(fā)生。我們選擇未攜帶惡苗病菌的潤農(nóng)4號(hào)為供試種子樣本，在每50 g稻種中人工添加0、1000、2000、4000、8000個(gè)擬輪枝鐮孢(分離自水稻惡苗病組織)的分生孢子。采用水洗法提取DNA作為LAMP檢測(cè)的模板，結(jié)果是添加8000個(gè)孢子的樣本檢測(cè)呈陽性。由于人工接種無病稻種可導(dǎo)致稻苗發(fā)生惡苗病的病菌孢子數(shù)量需達(dá)到1×106個(gè)/mL[14]，說明本文研發(fā)的技術(shù)對(duì)稻種攜帶擬輪枝鐮孢的檢測(cè)是適用的。所有供試品種的種子樣本均未檢測(cè)出攜帶擬輪枝鐮孢，可能是水稻種子不攜帶擬輪枝鐮孢或所攜帶菌量太低不足以檢出所致。造成上述現(xiàn)象的原因仍有待進(jìn)一步研究。

謝辭：南京農(nóng)業(yè)大學(xué)水稻研究所萬建民教授為本研究提供部分供試品種，謹(jǐn)此致謝！

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Detection of Seed-borne Rice Bakanae Pathogens in Jiangsu Province, China Using Loop-mediated Isothermal Amplification Assays

YUAN Yongtian1, RONG Zhenyang1, YE Wenwu1, ZHANG Hongsheng2, ZHUANG Yiqing2, ZHENG Xiaobo1,*

( College of Plant Protection,,,;College of Agronomy,,,;Zhenjiang Agric-academy of Sciences,,; Corresponding author ,:)

【Objective】The research aims to reveal the situation of seed-borne rice bakanae pathogens in Jiangsu Province, China. 【Methods】The seeds of 65 major rice cultivars collected from this area were analyzed by using loop-mediated isothermal amplification (LAMP) assays for specific detection of 4 known rice bakanae pathogen species, including,,and. 【Results】There were 54 rice cultivars carrying rice bakanae pathogens, indicating it’s a common phenomenon that rice seeds carrying rice bakanae pathogens in Jiangsu Province. And the most frequent species was, representing 83.07% of the total samples tested, followed byand,representing 10% and 6% respectively. However, none of the 65 rice cultivars was tested to be carrying. 【Conclusions】The method is readily available for detecting seed-borne rice bakanae pathogens.

rice bakanae;detection of seed-borne pathogens; loop-mediated isothermal amplification

S435.111.4+4; S511.041

A

1001-7216(2018)05-0493-08

2017-09-26;

2017-12-13。

國家863計(jì)劃資助項(xiàng)目(2012AA101501)。

10.16819/j.1001-7216.2018.7119