氮肥對水稻胚乳淀粉品質(zhì)、相關(guān)酶活性及基因表達量的影響

孫濤 同拉嘎 趙書宇 王海微 韓云飛 張忠臣 金正勛

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氮肥對水稻胚乳淀粉品質(zhì)、相關(guān)酶活性及基因表達量的影響

孫濤 同拉嘎 趙書宇 王海微 韓云飛 張忠臣 金正勛*

(東北農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院, 哈爾濱 150030;*通訊聯(lián)系人, E-mail: zxjin326@hotmail.com)

【目的】旨在為闡明灌漿成熟期氮素營養(yǎng)對水稻淀粉品質(zhì)影響機理以及建立優(yōu)質(zhì)高產(chǎn)水稻栽培技術(shù)提供理論依據(jù)?！痉椒ā窟x用4個籽粒直鏈淀粉含量差異顯著的粳稻品種，通過盆栽試驗研究氮素營養(yǎng)對稻米淀粉組分和蛋白質(zhì)含量及稻米蛋白質(zhì)水解對淀粉黏滯特性的影響，并分析氮素營養(yǎng)對灌漿過程中籽粒蔗糖合酶(SuSy)、蔗糖磷酸合酶(SPS)、蔗糖酸性轉(zhuǎn)化酶(AI)活性及、、、基因轉(zhuǎn)錄表達量的影響?！窘Y(jié)果】結(jié)果表明，籽粒支鏈淀粉含量對氮素營養(yǎng)很敏感，灌漿成熟期氮素營養(yǎng)能改變籽粒淀粉組分含量；施氮條件下，高直鏈淀粉含量品種蒸煮食味品質(zhì)下降更加明顯，去除稻米蛋白質(zhì)可明顯提高稻米黏滯特性，蛋白質(zhì)對淀粉黏滯特性的影響很大；增加灌漿成熟期氮素營養(yǎng)能顯著或極顯著提高籽粒SuSy和AI活性，顯著抑制籽粒SPS活性；灌漿成熟期氮素營養(yǎng)能改變灌漿不同時期籽粒、和基因轉(zhuǎn)錄表達量，以致灌漿過程中這些基因的轉(zhuǎn)錄表達量變化動態(tài)發(fā)生改變，但基因轉(zhuǎn)錄表達量不因氮素營養(yǎng)而發(fā)生改變；受氮素營養(yǎng)的影響，灌漿起始期籽粒基因表達量明顯上調(diào)，而灌漿中后期明顯下調(diào)；氮素營養(yǎng)明顯抑制灌漿成熟期籽?；蚝凸酀{中后期的基因轉(zhuǎn)錄表達，顯著提高灌漿前期和中期的籽粒基因轉(zhuǎn)錄表達量；氮素營養(yǎng)能抑制灌漿起始期籽?；虻霓D(zhuǎn)錄表達，而提高灌漿中后期的基因轉(zhuǎn)錄表達。【結(jié)論】灌漿成熟期氮素營養(yǎng)除了通過蛋白質(zhì)含量對淀粉品質(zhì)產(chǎn)生影響外，還通過調(diào)控淀粉合成相關(guān)的酶活性和基因表達量等生理環(huán)節(jié)對淀粉含量和精細結(jié)構(gòu)起作用，最終改變稻米黏滯特性和食味品質(zhì)。

水稻；氮素營養(yǎng)；淀粉合成關(guān)鍵酶基因；轉(zhuǎn)錄表達量

氮素是水稻生長發(fā)育所必需的重要元素，對水稻產(chǎn)量和品質(zhì)影響很大。淀粉和蛋白質(zhì)是水稻籽粒中最重要的組分。大量研究證實，蛋白質(zhì)和直鏈淀粉是影響稻米蒸煮食味品質(zhì)的兩個最重要的內(nèi)在因素[1-4]，而稻米主要以米飯形式被消費，因此，稻米蒸煮食味品質(zhì)是在眾多品質(zhì)性狀中最重要的評價指標。籽粒成熟過程中淀粉和蛋白合成途徑同步進行，兩者既對立又統(tǒng)一，相互依賴又競爭[5]。對于施氮肥對淀粉品質(zhì)的影響，普遍認為施氮肥直接增加籽粒蛋白質(zhì)含量，進而對淀粉黏滯特性起負向作用，降低稻米蒸煮食味品質(zhì)。氮素營養(yǎng)也影響淀粉組分及含量[6,7]，隨著施氮量的增加稻米直鏈淀粉含量逐漸增加[8]；然而也有研究表明結(jié)實期施氮對直鏈淀粉含量影響不明顯[9]，增施氮肥能降低直鏈淀粉含量[10]等。

淀粉積累為一系列復(fù)雜酶促反應(yīng)過程。水稻通過光合作用在葉綠體中形成淀粉，然后被分解形成磷酸丙酮，在蔗糖磷酸合酶(sucrose phosphate synthase, SPS)、蔗糖合酶(sucrose synthase, SuSy)和蔗糖酸性轉(zhuǎn)化酶(acid invertase, AI)的作用下從葉綠體運輸?shù)交|(zhì)中形成蔗糖，以蔗糖的形式運輸至 “庫”器官，為淀粉合成供給物質(zhì)基礎(chǔ)。進入籽粒細胞液中的蔗糖通過糖酵解形成ADPG，接著在結(jié)合型顆粒淀粉酶(granule-bound starch synthase,)作用下形成直鏈淀粉，在淀粉合酶(soluble starch synthase,)、淀粉分支酶(starch branching enzyme,)和淀粉脫分支酶(starch debranching enzyme,)等共同作用下生成支鏈淀粉。已有研究結(jié)果表明[11,12]，氮素營養(yǎng)能調(diào)控和基因表達量和酶活性，并改變直鏈淀粉和支鏈淀粉組成。

鑒于氮素營養(yǎng)對水稻產(chǎn)量和品質(zhì)及碳氮代謝起重要的調(diào)控作用以及氮肥對品質(zhì)影響的認識，我們在前期研究基礎(chǔ)上選用水稻籽粒直鏈淀粉含量有顯著差異的粳稻品種，通過盆栽試驗研究灌漿成熟期氮素營養(yǎng)對稻米蛋白質(zhì)和淀粉組分含量及籽粒蔗糖代謝關(guān)鍵酶活性和和基因表達量、蛋白質(zhì)與淀粉品質(zhì)關(guān)系的影響，旨在為闡明灌漿成熟期氮素營養(yǎng)對水稻淀粉品質(zhì)影響的分子調(diào)控機理和建立優(yōu)質(zhì)高產(chǎn)水稻栽培技術(shù)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 盆栽試驗及取樣方法

選取籽粒直鏈淀粉含量有顯著差異的粳稻品種東農(nóng)423(直鏈淀粉含量16.49%)和藤系180 (8.81%)以及從這兩個親本配制的組合中連續(xù)定向選擇培育的籽粒直鏈淀粉含量超親變異的兩個穩(wěn)定子代東農(nóng)1706(19.31%)和東農(nóng)1712(9.77%)作為供試材料。于2015年和2016年在東北農(nóng)業(yè)大學(xué)校內(nèi)進行盆栽試驗，盆長100 cm，寬40 cm，高40 cm。4月1日至15日根據(jù)供試材料的生育期進行分期播種，以使抽穗期盡量一致。大缽體盤育苗，每孔播催芽籽2粒，大棚旱育秧管理，5月13日至20日選擇長勢一致的秧苗等距離插秧，每個供試品種插6盆，每盆插8穴，每穴插2棵，待緩苗后每穴留1棵苗，正常水分管理。

全生育期總施氮量(尿素，折合純氮)7 kg/667 m2，并以盆的表面積換算得出每盆的施肥量。在此總施氮量基礎(chǔ)上，設(shè)齊穗期增施氮肥(20%純氮)處理和不施氮對照兩個水平，3次重復(fù)，氮、磷、鉀肥(分別折合成N、P2O5、K2O)比例為1∶0.5∶1。氮肥為尿素，磷肥為磷酸二銨，鉀肥為硫酸鉀。施肥方法是全部磷肥和50%的鉀肥以及總氮肥量的50%用作基肥，于插秧前施入，施肥后充分攪拌0－20 cm土層?？偟柿康?0%作分蘗肥施用，總氮肥量的30%和50%的鉀肥作為穗肥施用。

在抽穗時，各處理選取生長整齊一致且同一天抽出葉鞘3 cm的稻穗掛牌標記。自抽穗后10、15、20、25、30 d分別取樣，然后選取灌漿程度基本一致的穗中部約30粒籽粒，在低溫條件下去殼去胚后存入凍存管中，存放于－80℃超低溫冰柜里備用。

收獲時各處理按盆混收脫粒，自然干燥3個月后磨糙米，經(jīng)1.7 mm分級篩過篩后用全自動精米機磨精米，利用漩渦式粉碎機磨粉，供品質(zhì)分析用。

表1 qRT-PCR目的基因引物

表2 灌漿成熟期氮素營養(yǎng)對水稻產(chǎn)量性狀的影響

同列數(shù)據(jù)后大寫字母表示差異極顯著，小寫字母表示差異顯著。下同。

Within a column，values flanked by different capital letters and small letters are significantly different at 1% level and 5% level，respectively. The same as in tables below.

1.2 稻米理化特性測定及米粉蛋白質(zhì)水解方法

采用凱氏定氮法測定米粉蛋白質(zhì)含量，換算系數(shù)為5.95，按照中華人民共和國農(nóng)業(yè)部部頒標準(NY/T 83?88)[13]測定米粉直鏈淀粉含量，采用硫酸-蒽銅法[14]測定米粉總淀粉含量。支鏈淀粉含量為總淀粉含量減去直鏈淀粉含量。

采用澳大利亞Newport Scientific儀器公司的Super3型RVA(Rapid Visco Analyzer)快速測定儀，按照美國谷物化學(xué)協(xié)會規(guī)程的標準方法[15]測定供試樣品米粉淀粉黏滯特性，用TCW(Thermal Cycle Windows)配套軟件進行分析。

米粉蛋白質(zhì)水解采用楊玉玲[16,17]等堿浸法進行，稍有改進。稱取待測精米粉6 g，加入0.05 mol/L的NaOH溶液60 mL在室溫下浸泡24 h，離心去掉上清液，再加0.1 mol/L的NaOH溶液至原體積并浸泡12 h，再加無水乙醇室溫靜止4 h吸水吸脂，離心后在50℃下烘干得到脫蛋白精米粉樣品，作為蛋白質(zhì)水解處理樣品。同時稱取米粉6 g，加入蒸餾水60 mL，過程同水解處理一致。

1.3 籽粒蔗糖代謝相關(guān)酶活性及基因轉(zhuǎn)錄表達量測定方法

參照金正勛等[18]方法測定蔗糖磷酸合酶(SPS)、酸性蔗糖轉(zhuǎn)化酶(AI)及蔗糖合酶(SuSy)活性。

?。?0℃冰箱中保存的籽粒，采用Trizol法提取總RNA，加入去核糖核酸酶DNaseⅠ消除基因組DNA污染，采用反轉(zhuǎn)錄試劑盒(NOVA，購自江蘇愚公生命科技有限公司)合成cDNA。根據(jù)NCBI (http://www.ncbi.nlm.nih.gov)上公布的基因RNA序列，用Premier 5.0軟件設(shè)計qRT-PC引物(表1)，在NCBI 網(wǎng)站上作BLAST比對，保證引物專一性。以cDNA為模板，為內(nèi)參基因，參照SYBR?Green qPCR試劑盒進行qRT-PCR，每個樣品重復(fù)3次。參照基因法[19]，計算目標基因相對表達量。采用SPSS 17.0軟件進行數(shù)據(jù)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 齊穗期施氮肥對水稻產(chǎn)量性狀的影響

增施氮肥時期為穗數(shù)和每穗粒數(shù)已形成不變的齊穗期，因此施肥處理對該兩個性狀沒有影響，而對千粒重和結(jié)實率影響較大(表2)。

增幅因品種而異，其中結(jié)實率增幅為0.34%~ 1.99%，千粒重增幅為2.17%~5.74%。說明增加灌漿成熟期氮素營養(yǎng)可顯著提高稻谷的粒重和結(jié)實率，進而有利于提高稻谷產(chǎn)量和籽粒成熟。

2.2 齊穗期施氮肥對灌漿不同時期籽粒淀粉組分含量響應(yīng)

由表3可見，齊穗期增施氮肥處理的各品種籽粒支鏈淀粉含量和總淀粉含量極顯著增加，而直鏈淀粉含量則顯著或極顯著降低，變幅因品種而異，其中高直鏈淀粉含量品種東農(nóng)423和東農(nóng)1706受氮素營養(yǎng)的影響籽粒直鏈淀粉含量降幅小于支鏈淀粉含量，而低直鏈淀粉含量品種藤系180和東農(nóng)1712受氮素營養(yǎng)的影響籽粒直鏈淀粉含量降幅大于支鏈淀粉，而且低直鏈淀粉含量品種的籽?？偟矸酆吭龇笥诟咧辨湹矸酆科贩N。說明籽粒淀粉組分含量受灌漿成熟期氮素營養(yǎng)的影響較大，而且氮素營養(yǎng)對淀粉組分含量的影響因籽粒直鏈淀粉含量不同而異。

表3 灌漿不同時期處理間籽粒中總淀粉、直鏈淀粉、支鏈淀粉含量應(yīng)比較

DAF―抽穗后天數(shù)。同列數(shù)據(jù)后大寫字母表示差異極顯著，小寫字母表示差異顯著。下同。

DAF, Days after heading. Within a column, values flanked by different capital letters and small letters are significantly different at 1% level and 5% level, respectively. The same as in tables below.

2.3 蛋白質(zhì)水解對稻米黏滯特性影響

增施氮肥最直接的影響是提高籽粒蛋白質(zhì)含量，降低淀粉黏滯特性和食味品質(zhì)。為了明確氮肥對淀粉黏滯特性的直接和間接影響，采用堿浸法水解供試材料米粉中的蛋白質(zhì)，然后比較了淀粉黏滯特性，其結(jié)果列于表4。

由表4可見，與未施氮肥對照相比，齊穗期施氮肥極顯著提高東農(nóng)423、東農(nóng)1706、藤系180的稻米蛋白質(zhì)含量，而東農(nóng)1712略有提高，其中高直鏈淀粉含量品種東農(nóng)423和東農(nóng)1706的增幅度達到1個百分點以上，說明增加灌漿成熟期氮素營養(yǎng)顯著提高籽粒蛋白質(zhì)含量，其增幅因品種而異。

就淀粉譜特性而言，齊穗期施氮肥，高直鏈淀粉含量品種東農(nóng)423和東農(nóng)1706的最高黏度、最低黏度、最終黏度及下降黏度值均極顯著下降，而低直鏈淀粉含量品種藤系180和東農(nóng)1712則與之相反，均極顯著增加，說明高直鏈淀粉含量品種受氮肥的影響蒸煮食味品質(zhì)變劣更加明顯，灌漿成熟期氮素營養(yǎng)對稻米蒸煮食味品質(zhì)的影響因直鏈淀粉含量不同而異。

與未水解蛋白質(zhì)對照相比，水解處理后供試的4個品種無論是齊穗期施氮肥與否，米粉中的蛋白質(zhì)含量都降低到2.48%~2.64%，最終供試材料間米粉蛋白質(zhì)含量差異都甚小，供試品種的米粉蛋白質(zhì)含量都在同一水平，說明米粉堿水處理后蛋白質(zhì)水解效果很顯著。與未水解對照相比，水解處理的米粉直鏈淀粉含量極顯著增加，這可能與蛋白質(zhì)水解后米粉量發(fā)生變化有關(guān)，并非絕對含量增加。

表4 蛋白質(zhì)水解對稻米RVA譜特性的影響

同列數(shù)據(jù)后大寫字母表示差異極顯著，小寫字母表示差異顯著。下同。

Within a column, values flanked by different capital letters and small letters are significantly different at 1% level and 5% level, respectively. The same as in tables below.

水解處理與未水解對照相比，供試的4個品種無論是齊穗期施氮肥與否，米粉的最高黏度和崩解值均極顯著增加，而黏滯峰消減值、最低黏度、最終黏度等均極顯著降低，其中崩解值增幅和黏滯峰消減值降幅較大，增加或降低的平均值分別為91.90和－81.95，而且低直鏈淀粉含量品種變幅比高直鏈淀粉含量品種更大。說明去除稻米蛋白質(zhì)可明顯提高稻米的黏滯特性，降低稻米蛋白質(zhì)含量能顯著提高稻米蒸煮食味品質(zhì)，同時淀粉組成對淀粉黏滯特性的影響也很大，降低稻米直鏈淀粉含量對提高淀粉黏滯特性具有重要作用。灌漿成熟期氮素營養(yǎng)一方面通過提高籽粒蛋白質(zhì)含量直接影響?zhàn)匦?，另一方面通過影響淀粉組分含量間接影響?zhàn)匦浴?/p>

2.4 齊穗期施氮肥對灌漿不同時期籽粒蔗糖代謝相關(guān)酶活性影響

由表5可見，籽粒直鏈淀粉含量不同的品種間灌漿同一時期籽粒SuSy、SPS、AI 活性差異達到顯著或極顯著水平。在灌漿不同時期籽粒SuSy活性均極顯著高于SPS和AI，后兩者的酶活性在整個灌漿過程中一直處于較低水平，說明不同品種間籽粒SuSy、SPS、AI活性有顯著的遺傳差異，在灌漿過程中SuSy在籽粒中的活性很高。

與未施氮肥對照相比，齊穗期施氮肥顯著或極顯著提高灌漿不同時期籽粒SuSy和AI活性，提高幅度因品種和灌漿時期不同而異，其中SuSy活性提高幅度最高在抽穗后15~25 d，其中東農(nóng)423在抽穗后20 d時提高幅度最大，增幅為18.60%，東農(nóng)1706在15 d時增幅為74.73%，而藤系180和東農(nóng)1712在抽穗后25 d時增幅最大，分別為64.79%和68.19%，AI 活性提高幅度達到一倍以上。

與未施氮肥對照相比，齊穗期施氮肥極顯著降低灌漿前期高直鏈淀粉含量品種的SPS活性，東農(nóng)423和東農(nóng)1706在抽穗后10 d時降幅最大，分別為－74.85%和－73.02%，而低直鏈淀粉含量品種的SPS活性到灌漿中期極顯著降低，藤系180和東農(nóng)1712在抽穗后20 d時降幅最大，分別為－45.01%和－78.22%。

以上結(jié)果說明，在灌漿過程中籽粒SuSy、SPS和AI活性受施氮量的影響都很大，增加灌漿成熟期施氮量能顯著或極顯著提高籽粒SuSy和AI活性，而顯著抑制籽粒SPS活性，三種酶的作用及其對外界因素的反應(yīng)相互獨立。

2.5 齊穗期施氮肥對灌漿不同時期籽粒淀粉合成關(guān)鍵酶基因表達量影響

由表6可見，灌漿不同時期籽粒、、、基因轉(zhuǎn)錄表達量供試的4個品種間差異均達顯著或極顯著水平，說明上述基因的轉(zhuǎn)錄表達量品種間有顯著或極顯著的遺傳差異。

在籽粒灌漿過程中齊穗期未施氮肥處理的4個供試品種籽粒、、、基因轉(zhuǎn)錄表達量均呈單峰曲線變化，在抽穗后20 d表達量達到最高。但齊穗期施氮肥處理后上述4個基因的轉(zhuǎn)錄表達量變化動態(tài)發(fā)生改變，其中基因轉(zhuǎn)錄表達量仍然呈單峰曲線變化，抽穗后20 d表達量最高，而和基因轉(zhuǎn)錄表達量是抽穗后10 d最大，以后呈直線下降，基因是抽穗后10 d前轉(zhuǎn)錄表達量較低，但抽穗10 d后起表達量迅速升高，直至抽穗后30 d達到高峰。說明灌漿成熟期施氮量能改變灌漿不同時期籽粒、和基因轉(zhuǎn)錄表達量，以致灌漿過程中這些基因的轉(zhuǎn)錄表達量發(fā)生變化，但基因轉(zhuǎn)錄表達量變化動態(tài)不因施氮量而發(fā)生變化。

表5 灌漿不同時期處理間籽粒蔗糖合酶(SuSy)、蔗糖磷酸合酶(SPS)和蔗糖酸性轉(zhuǎn)化酶(AI)活性比較

同列數(shù)據(jù)后大寫字母表示差異極顯著，小寫字母表示差異顯著。SuSy－蔗糖合酶；SPS－蔗糖磷酸合酶；AI－蔗糖酸性轉(zhuǎn)化酶。下同。

Within a column, values flanked by different capital letters and small letters are significantly different at 1% level and 5% level, respectively. SuSy, Sucrose synthase; SPS, Sucrose phosphate synthase; AI, Acid invertase.

就灌漿不同時期基因轉(zhuǎn)錄表達量變化而言，抽穗后10 d時施氮肥處理的籽粒基因轉(zhuǎn)錄表達量極顯著高于沒施氮肥的對照，高出1.05~5.76倍，而抽穗后20 d和30 d的轉(zhuǎn)錄表達量卻極顯著低于對照，分別低17.7%~98.98%和69.83%~ 95.71%，說明受氮素營養(yǎng)的影響灌漿起始期籽?；虮磉_量明顯上調(diào)，而灌漿中后期明顯下調(diào)，上、下調(diào)幅度因品種而異。

表6 灌漿不同時期籽粒OsGBSSⅠ、OsISAⅠ、OsSBEⅠ、OsSBEⅡ基因轉(zhuǎn)錄表達量比較

同列數(shù)據(jù)后大寫字母表示差異極顯著，小寫字母表示差異顯著。

Within a column, values flanked by different capital letters and small letters are significantly different at 1% level and 5% level, respectively.

與未施氮肥對照相比，施氮肥處理的籽?；蜣D(zhuǎn)錄表達量在整個灌漿過程中均極顯著下降，但基因轉(zhuǎn)錄表達量變化因灌漿時期不同而異，抽穗至抽穗后20 d基因轉(zhuǎn)錄表達量普遍顯著或極顯著升高，而抽穗后30 d普遍顯著或極顯著下降，而東農(nóng)1712在整個灌漿過程中均極顯著升高。說明氮素營養(yǎng)明顯抑制灌漿成熟期籽粒基因和灌漿中后期基因轉(zhuǎn)錄表達，顯著提高灌漿前期和中期籽?；蜣D(zhuǎn)錄表達。

與未施氮肥對照相比，施氮處理籽?；蜣D(zhuǎn)錄表達量抽穗后10 d時除東農(nóng)1706略高外，其他品種均極顯著或略有降低，但抽穗后20 d和30 d時供試的4個品種均極顯著或略有升高，說明氮素營養(yǎng)能抑制灌漿起始期籽?；虻霓D(zhuǎn)錄表達，而促進灌漿中后期的基因轉(zhuǎn)錄表達，抑制或提高的幅度因品種不同而異。

3 討論

圍繞著氮肥與稻米品質(zhì)間的關(guān)系國內(nèi)外學(xué)者做了大量研究，大多是從氮肥與稻米蛋白質(zhì)含量和蒸煮食味性狀或氮代謝關(guān)系進行研究[1-4,12,20]，近幾年氮素營養(yǎng)與淀粉合成相關(guān)基因表達量關(guān)系方面也有一些報道[6,11,21]。已有研究結(jié)果表明，隨著蛋白質(zhì)含量的提高稻米蒸煮食味品質(zhì)逐漸降低[4,22]，增施氮肥尤其是抽穗以后施氮肥顯著提高籽粒蛋白質(zhì)含量[23]，進而降低稻米黏滯性和食味品質(zhì)，本研究也得到同樣的結(jié)果與結(jié)論。在本研究中去除稻米蛋白質(zhì)可顯著提高稻米淀粉譜特性中的崩解值，顯著降低黏滯峰消減值，大幅提高稻米黏滯特性，再次證明蛋白質(zhì)含量高影響蒸煮食味品質(zhì)。

然而，氮素營養(yǎng)作為水稻生長發(fā)育及產(chǎn)量和品質(zhì)形成過程中不可缺少的大量元素，不僅對蛋白質(zhì)合成相關(guān)的氮代謝有影響，而且對淀粉合成相關(guān)的碳代謝也有影響[1,7,11,12,18,22]。在本研究中受灌漿成熟期氮素營養(yǎng)的影響籽粒SuSy和AI活性及灌漿起始期的籽?；蚣肮酀{前期和中期的籽粒和灌漿中后期的基因轉(zhuǎn)錄表達量顯著或極顯著升高，而籽粒SPS活性及灌漿中期、后期的籽?；蚝驼麄€灌漿過程中的基因、灌漿中后期的基因和灌漿起始期籽?；蜣D(zhuǎn)錄表達顯著受到抑制。、、、基因是參與胚乳直鏈淀粉和支鏈淀粉生物合成的關(guān)鍵酶基因，SuSy和AI、SPS酶是參與蔗糖代謝的關(guān)鍵酶。已有研究結(jié)果表明，GBSS主要控制著直鏈淀粉的合成[24-25]，是控制水稻胚乳中直鏈淀粉占總淀粉比值的關(guān)鍵酶[26]，GBSSⅠ是胚乳直鏈淀粉合成過程中的關(guān)鍵酶[27]，是參與合成直鏈淀粉的關(guān)鍵基因，其表達量直接影響直鏈淀粉含量,抑制該基因的表達量能降低籽粒直鏈淀粉含量[21]。SSS用于延伸α-1,4糖苷鍵連接的葡萄糖鏈，再由BEs形成分枝，最后由DBE去除不適分枝合成支鏈淀粉，SBEⅠ和SBEⅡ分別負責70%和30%的水稻胚乳支鏈淀粉合成[28,29]，其中SBEⅠ主要催化短鏈的形成，SBE3催化長鏈的形成[30-32]，突變體顯示有些特定支鏈淀粉側(cè)鏈的長度有變化[33]。異淀粉酶是直接參與支鏈淀粉合成的酶，是水稻籽粒中最重要的淀粉結(jié)構(gòu)決定基因之一[34,35]，水稻花后高溫會導(dǎo)致基因表達量顯著上調(diào)[36],支鏈淀粉中的長B鏈數(shù)量減少和中長B鏈數(shù)量增加[37]。由此可知，參與淀粉生物合成的各關(guān)鍵酶或基因都擔負著特殊的功能，每個基因的功能和表達量或酶活性的變化都會造成淀粉含量和精細結(jié)構(gòu)的變化，進而影響淀粉品質(zhì)。支鏈淀粉和直鏈淀粉的組分比例以及支鏈淀粉的精細結(jié)構(gòu)是影響稻米蒸煮食味品質(zhì)的重要內(nèi)在決定因素。在本研究中蛋白質(zhì)含量很相近的齊穗期施氮肥處理和對照處理米粉間淀粉黏滯特性仍然表現(xiàn)很大差異，也說明灌漿成熟期氮素營養(yǎng)除了通過蛋白質(zhì)含量對淀粉品質(zhì)起影響外，還通過調(diào)控淀粉合成相關(guān)的酶活性和基因表達量等途徑對淀粉含量和精細結(jié)構(gòu)起作用,最終改變稻米黏滯特性和食味品質(zhì)。因此，如何調(diào)控灌漿成熟期氮素營養(yǎng)是今后優(yōu)質(zhì)水稻栽培所要解決的關(guān)鍵問題，而不是簡單采取少施氮肥或抽穗后不施氮肥等控氮技術(shù)措施來達到優(yōu)質(zhì)的目的。穗肥相對比例不足則葉片早衰，籽粒灌漿時間縮短,整精米率和直鏈淀粉含量升高而蛋白質(zhì)含量下降[38]?？氐胧┮蛩旧笃谌鄙俚貭I養(yǎng)而降低光合效率及早衰，稻谷成熟度和結(jié)實率低，導(dǎo)致既減產(chǎn)又降低稻米品質(zhì)。保持灌漿成熟期的水稻植株氮濃度不僅能增加劍葉中RuBP羧化酶各亞基基因的轉(zhuǎn)錄表達量和表達持續(xù)時間[7]及RuBP羧化酶活性和光合產(chǎn)物量[6]，而且還能增強或減弱灌漿不同時期的籽粒、、、及SuSy、AI、SPS和ADPG，SSS和SBE等淀粉合成相關(guān)基因的表達量和酶活性，降低籽粒直鏈淀粉含量及提高支鏈淀粉含量和改變精細結(jié)構(gòu)，進而改善淀粉的黏滯性，提高稻米的蒸煮食味品質(zhì)。在本研究中，齊穗期施氮肥處理的東農(nóng)423品種的崩解值大于對照，而黏滯峰消減值小于對照，千粒重和結(jié)實率均高于對照，說明通過灌漿成熟期氮素營養(yǎng)的合理管理可達到提高產(chǎn)量，又改善蒸煮食味品質(zhì)的目的。因此，針對蛋白質(zhì)和淀粉合成相關(guān)酶基因表達調(diào)控機理，采用精準合理地施用氮肥，以保證優(yōu)質(zhì)淀粉品質(zhì)形成所需的灌漿成熟期氮素營養(yǎng)，進而協(xié)調(diào)優(yōu)質(zhì)與高產(chǎn)，最終達到既提高水稻產(chǎn)量，又改善稻米品質(zhì)的目的。

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Effects of Nitrogen Fertilizer Application on Starch Quality, Activities and Gene Expression Levels of Related Enzymes in Rice Endosperm

SUN Tao, TONG Laga, ZHAO Shuyu, WANG Haiwei, HAN Yunfei, ZHANG Zhongchen, JIN Zhengxun*

(,,,;*Corresponding author,:)

【Objective】The research aims to lay a theoretical basis for clarifying the influencing mechanism of nitrogen fertilization during grain filling period on rice starch quality.【Method】Fourrice varieties with significant difference in amylose content in grains were selected. Pot experiments were conducted to study the effect of nitrogen application on the starch component and protein content in rice grains, and the protein hydrolysis of rice grains on starch viscosity properties, and to analyze the effect of nitrogen nutrition on the activity of sucrose synthase(SuSy), sucrose phosphate synthase(SPS) and acid invertase(AI) and the mRNA expression levels of,,andgenes of rice grains during grain filling period.【Results】The results showed that the grain amylopectin content was sensitive to nitrogen nutrition, and nitrogen nutrition during grain filling period changed the content of starch components in grains. The cooking and eating quality of high amylose content varieties degraded even more. The removal of rice protein could significantly improve the viscosity of rice, and the starch composition had a great influence on the viscosity properties of rice starch. Increasing nitrogen nutrition at grain filling stage significantly or highly significantly increased the activity of SuSy and AI in grains, and significantly inhibits the activity of SPS. The nitrogen nutrition at grain filling stage changed the mRNA expression level of,andof rice grains at different stages of grain filling, so that the change dynamics of the mRNA expression quantity of these genes changed during grain filling period except. Due to the influence of nitrogen nutrition, at the beginning of grain filling,expression level was upregulated significantly, but downregulated significantly in the middle and late stages of grain filling. Nitrogen fertilization could significantly inhibit the transcription expression quantity ofof grains at grain filling stage andof grains in the middle and late stages of grain filling, and could significantly improve the mRNA expression quantity ofof grains in the early and middle stages of grain filling. Nitrogen nutrition could inhibit the transcription expression quantity ofgene of grains at the beginning of grain filling, and improve the transcription expression quantity of genes in the middle and late stages of grain filling.【Conclusion】In addition to the effect of protein content on starch quality during grain filling and ripening, nitrogen nutrition also affected starch content and fine structure by regulating enzyme activities and gene expression related to starch synthesis. Ultimately, it changed the rice viscosity and taste quality.

rice; nitrogen nutrition; key enzyme genes involved in starch synthesis; transcription expression quantity

Q786; S143.1; S511.032

A

1001-7216(2018)05-0475-10

2018-01-29；

2018-04-23。

國家重點研發(fā)計劃資助項目(2017YFD0300506-5); 國家科技支撐計劃資助項目(2015BAD23B05-11);東北農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)科團隊建設(shè)資助項目。

10.16819/j.1001-7216.2018.8013