一個(gè)水稻銅鋅SOD酶基因在應(yīng)答亞砷酸鹽脅迫中的作用

竇玲玲 胡海超 馬龍 柯笑楠 劉明月 練旺民 金珂 謝玲娟 劉慶坡

?

一個(gè)水稻銅鋅SOD酶基因在應(yīng)答亞砷酸鹽脅迫中的作用

竇玲玲 胡海超 馬龍 柯笑楠 劉明月 練旺民 金珂 謝玲娟 劉慶坡*

(浙江農(nóng)林大學(xué) 農(nóng)業(yè)與食品科學(xué)學(xué)院, 杭州 311300；*通訊聯(lián)系人, E-mail: liuqp@zafu.edu.cn)

【目的】水稻基因編碼一個(gè)銅鋅SOD酶，但其在響應(yīng)亞砷酸鹽[As(Ⅲ)]脅迫中的生物學(xué)功能未知。本研究旨在深入揭示由該基因調(diào)控水稻砷耐性改變的分子機(jī)理并為水稻抗逆育種提供理論參考?！痉椒ā恳砸吧腿毡厩?WT)和2個(gè)過(guò)表達(dá)轉(zhuǎn)基因株系為試材，通過(guò)脅迫處理、生理指標(biāo)測(cè)定和基因表達(dá)分析等，系統(tǒng)探究了轉(zhuǎn)基因植株對(duì)As(Ⅲ)的耐受性表現(xiàn)，并初步揭示了其調(diào)控水稻砷耐性的生理和分子機(jī)理。【結(jié)果】與WT相比，過(guò)表達(dá)轉(zhuǎn)基因株系對(duì)As(Ⅲ)更加敏感；轉(zhuǎn)基因植株在砷脅迫下的根系相對(duì)伸長(zhǎng)量、生物量(干質(zhì)量)、葉綠素含量、根系細(xì)胞質(zhì)膜完整性、葉片抗氧化程度等均顯著低于WT；在砷處理后的WT和轉(zhuǎn)基因植株葉片中的表達(dá)模式略有不同，但均表現(xiàn)為處理24 h時(shí)被顯著誘導(dǎo)表達(dá)?！窘Y(jié)論】過(guò)度表達(dá)基因可導(dǎo)致水稻的砷耐受性極顯著下降。

水稻；銅鋅SOD；亞砷酸鹽；轉(zhuǎn)基因；生理機(jī)理；基因表達(dá)

砷在自然界分布廣泛，對(duì)動(dòng)植物和人類(lèi)具有強(qiáng)烈毒害作用[1]。長(zhǎng)期以來(lái)，由于含砷農(nóng)藥和化肥等的大量施用，導(dǎo)致受砷污染土壤面積不斷增加，污染程度逐年加劇，嚴(yán)重威脅動(dòng)植物生產(chǎn)和人類(lèi)健康。據(jù)報(bào)道，目前全世界范圍內(nèi)有近1.5億人正遭受慢性砷中毒危害，其中，南亞和東南亞地區(qū)包括中國(guó)是受砷毒害最為嚴(yán)重的區(qū)域之一[2]。水稻是世界約一半人口，尤其東南亞國(guó)家的主要糧食作物，但相比于其他旱作禾谷類(lèi)作物，水稻對(duì)砷的吸收與富集能力更強(qiáng)[3]。因此，水稻砷污染已成為世界性環(huán)境與衛(wèi)生問(wèn)題。

環(huán)境中的砷主要以砷酸鹽[As(Ⅴ)]的形態(tài)進(jìn)入植物體內(nèi)，并在砷酸還原酶的催化下還原為亞砷酸鹽[As(Ⅲ)]，而As(Ⅲ)再進(jìn)一步被甲基化或螯合化，其產(chǎn)物隨后被轉(zhuǎn)移到液泡中或排出體外，從而達(dá)到解毒作用[4]。目前，從水稻基因組中已經(jīng)克隆到兩個(gè)砷酸還原酶基因和，其中主要在根系中表達(dá)，而在根系和地上部均有表達(dá)[5]。Dhankher等[6]發(fā)現(xiàn)，擬南芥基因敲除的突變體植株對(duì)As(Ⅴ)更加敏感。水稻中，As(Ⅴ)主要通過(guò)磷轉(zhuǎn)運(yùn)通道蛋白被吸收，而As(Ⅲ)則主要通過(guò)水通道蛋白超家族中的類(lèi)Nod26內(nèi)在膜蛋白，如OsNIP2;1、OsNIP2;2、OsNIP1;1和OsNIP3;2等被吸收和向地上部轉(zhuǎn)移[7-9]，其中OsNIP2;1在A(yíng)s(Ⅲ)進(jìn)入和排出根部細(xì)胞過(guò)程中起主導(dǎo)作用[9]。Zhao等[9]發(fā)現(xiàn)與對(duì)照相比，功能缺失突變體的根系對(duì)As(Ⅲ)的吸收可減少57%。另外，As(Ⅲ)可通過(guò)硅轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白Lsi2向地上部轉(zhuǎn)移和在籽粒中累積[10]。研究發(fā)現(xiàn)，水稻突變體植株地上部的砷富集量比野生型約減少70%[10]。

提高水稻對(duì)砷的耐受性是解決水稻砷污染的有效途徑之一。Mosa等[11]和Tiwari等[12]在蛙卵細(xì)胞和酵母等異源體系中，分別表達(dá)水稻基因、、和后發(fā)現(xiàn)，這些基因編碼的蛋白均可轉(zhuǎn)運(yùn)As(Ⅲ)，而且在擬南芥中過(guò)量表達(dá)相關(guān)基因后均顯著增強(qiáng)了轉(zhuǎn)基因植株對(duì)砷的耐受性。近年來(lái)，不同研究組利用過(guò)表達(dá)和/或敲除基因功能等轉(zhuǎn)基因技術(shù)發(fā)現(xiàn)，[13]、[14]和[15]在水稻As(Ⅴ)吸收、積累和耐受性方面發(fā)揮著重要作用。此外，過(guò)表達(dá)miR528和miR3979可顯著改變水稻對(duì)As(Ⅲ)的耐受性[16,17]。這表明miRNA同蛋白編碼基因一樣在水稻應(yīng)答砷脅迫中起著重要的調(diào)控作用。

植物基因組中編碼多個(gè)抗氧化酶基因，其中，超氧化物歧化酶(SOD)負(fù)責(zé)清除逆境脅迫下產(chǎn)生的超氧自由基，進(jìn)而在植物應(yīng)答逆境脅迫和衰老過(guò)程中發(fā)揮作用[18]。水稻基因編碼一個(gè)銅鋅SOD酶, 1997年已克隆[19]。1999年，Kaminaka等[20]進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，在光照條件下水稻銅鋅SOD酶可對(duì)鹽害脅迫做出快速響應(yīng)。但該基因是否參與水稻砷脅迫應(yīng)答尚不清楚。因此，本研究獲得了基因的過(guò)表達(dá)轉(zhuǎn)基因植株，通過(guò)分析其在正常和As(Ⅲ)處理后的表型、生理生化指標(biāo)變化及其時(shí)空表達(dá)模式等，明確了該基因在水稻應(yīng)答As(Ⅲ)脅迫中的作用。這對(duì)于深入闡明水稻砷耐受性的內(nèi)在分子機(jī)理具有重要意義，同時(shí)也可為水稻抗逆育種或品種改良提供理論參考。

1 材料與方法

1.1?實(shí)驗(yàn)材料與處理

以粳稻品種日本晴(WT)和過(guò)表達(dá)轉(zhuǎn)基因株系(OE-44770-4、OE-44770-13；日本晴為背景材料)為試材。分別選取一定數(shù)量健康飽滿(mǎn)的種子，先用0.5%次氯酸鈉溶液消毒15 min后，用純凈水漂洗3~5次，并在蒸餾水中浸泡24 h。然后，將浸泡好的種子轉(zhuǎn)移到覆有濾紙的發(fā)芽盒中，添加適量0.5%氯化鈣溶液，置于光照培養(yǎng)箱中催芽。培養(yǎng)條件設(shè)置為30℃光照16 h/25℃黑暗8 h。待苗長(zhǎng)4 cm時(shí)，挑選長(zhǎng)勢(shì)一致的幼苗移植到培養(yǎng)器皿中進(jìn)行水培[營(yíng)養(yǎng)液配方如下：0.091 mmol/L KNO3、0.183 mmol/L Ca(NO3)2、0.274 mmol/L MgSO4、0.1 mmol/L KH2PO4、0.183 mmol/L (NH4)2SO4、0.5 μmol/L MnCl2、3 μmol/L H3BO3、0.1 μmol/L (NH4)6Mo7O24、0.4 μmol/L ZnSO4、0.2 μmol/L CuSO4、40 μmol/L NaFe(Ⅲ)-EDTA和2 mmol/L 2-嗎啉磺酸，調(diào)節(jié)pH至5.5]，期間每3 d更換一次營(yíng)養(yǎng)液。每皿8株。實(shí)驗(yàn)設(shè)對(duì)照(CK)和As(Ⅲ)脅迫兩種處理，每個(gè)處理設(shè)置3次重復(fù)。待苗齡21 d時(shí)，利用25 μmol/L亞砷酸鈉進(jìn)行脅迫處理。

表1?定量RT-PCR所需引物

1.2?轉(zhuǎn)基因植株的獲得及陽(yáng)性檢測(cè)

利用正向(5′-ATGCAAGCCATCCTCGCCGCT G-3′)和反向引物(5′-CTACAACGGGGTCAGCCC AACAA-3′)從日本晴基因組中擴(kuò)增出基因的編碼區(qū)序列(CDS)。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)HⅠ和Ⅰ雙酶切后，連接至同樣經(jīng)過(guò)上述雙酶切的pCAMBIA1300-UBI載體上，然后采用熱激法將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH5α。最后，將目的基因經(jīng)農(nóng)桿菌介導(dǎo)侵染日本晴愈傷組織，經(jīng)潮霉素抗性篩選后獲得轉(zhuǎn)基因植株。

采用十六烷基三甲基溴化銨(CTAB)法[21]提取水稻基因組DNA，然后利用基因特異引物(5′-GCT TCCACCTCCACGAGTTT-3′和5′-AGACCGGCA ACAGGATTCAATC-3′)進(jìn)行轉(zhuǎn)基因植株的陽(yáng)性檢測(cè)。PCR程序如下94℃下預(yù)變性5 min；94℃下變性30 s，60℃下退火30 s，72℃下延伸30 s，35個(gè)循環(huán)；72℃下延伸7 min。

1.3?生理指標(biāo)的測(cè)定

1.3.1?根系相對(duì)伸長(zhǎng)量

在A(yíng)s(Ⅲ)處理前，對(duì)各供試水稻幼苗的根長(zhǎng)進(jìn)行測(cè)定，同時(shí)做好標(biāo)記。在處理6 d時(shí)，再次測(cè)定根長(zhǎng)，并根據(jù)標(biāo)記計(jì)算其根系的相對(duì)伸長(zhǎng)量。

1.3.2?生物量(干質(zhì)量)

在脅迫處理6 d時(shí)，將處理后的水稻幼苗放到解析液中浸泡10 min，將殘留水分擦干后置于烘箱中先105℃下殺青30 min，后75℃下干燥48 h。使用分析天平測(cè)定各供試植株的干質(zhì)量。

1.3.3?葉綠素含量

脅迫處理6 d時(shí)，稱(chēng)取各供試材料的葉片0.1 g，剪成1 cm大小后加入體積比為1∶1的乙醇、丙酮混合液，避光萃取保存24 h。期間每隔3~4 h搖晃一次，直至葉片完全失色。然后用分光光度計(jì)分別測(cè)定663、645、470 nm處的吸光值。

1.3.4?根尖細(xì)胞質(zhì)膜的完整性

亞砷酸鹽處理6 d后，收獲各供試材料的根系，將其置于0.5 mmol/L CaCl2溶液(pH 4.5)中浸泡5 min。用純水洗滌、吸干后，將其浸沒(méi)在4 mL的伊文思藍(lán)溶液[0.025%(/)的伊文思藍(lán)溶于100 μmol/L CaCl2中，調(diào)節(jié)pH至5.6]中染色1 h。用蒸餾水沖洗15 min后觀(guān)察染色情況并拍照。

1.3.5?氯化硝基四氮唑藍(lán)液(NBT)染色

選取As(Ⅲ)處理6 d后的各個(gè)材料相同部位的葉片若干(≥3)，將葉片浸沒(méi)在1 mg/mL 氯化硝基四氮唑藍(lán)(NBT)染液中于光下染色，直至有明顯的表型出現(xiàn)。然后將葉片轉(zhuǎn)移至乙醇中，70℃水浴處理直到葉片脫色至黃白色結(jié)束。脫色完成后的葉片保存于70%酒精中，然后放置于體式顯微鏡(型號(hào)為SZX10，OLYMPUS公司)下觀(guān)察染色情況并拍照。

1.4?基因表達(dá)分析

采用Trizol法提取水稻葉片總RNA，使用Invitrogen反轉(zhuǎn)錄試劑盒(Invitrogen Superscript Ⅲ first-strand synthesis system)將RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA，然后在Bio-Rad公司的CFX-connect 熒光定量PCR儀上進(jìn)行擴(kuò)增，反應(yīng)體系包括2.0 μL cDNA，正反向引物各1.0 μL(表1)，12.5 μL SYBR Premix ExⅡ和12.5 μL ddH2O。PCR程序如下：先95℃下預(yù)變性5 s，95℃下變性5 s，然后60℃下復(fù)性30 s，40個(gè)循環(huán)。以基因作內(nèi)參，采用2?法計(jì)算基因的相對(duì)表達(dá)量。

1.5?統(tǒng)計(jì)分析

所有數(shù)據(jù)均為≥3次或8次重復(fù)的平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤。利用SPSS 22.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。采用最小顯著性差異法(LSD)進(jìn)行方差分析，在5%水平上分析不同材料及不同處理間的差異顯著水平。

2?結(jié)果與分析

2.1?轉(zhuǎn)基因植株的陽(yáng)性檢測(cè)

采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法獲得13個(gè)基因的過(guò)表達(dá)轉(zhuǎn)基因株系，隨后利用基因特異引物對(duì)T1代650個(gè)轉(zhuǎn)基因植株進(jìn)行PCR檢測(cè)，共鑒定到520個(gè)陽(yáng)性植株，陽(yáng)性率為80%(圖1)。

M－DNA標(biāo)記 2000; 1－陽(yáng)性對(duì)照；2, 3, 5~7, 9~12, 14, 15, 19, 21, 23, 24為轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性植株；4, 8, 13, 16~18, 20, 22為轉(zhuǎn)基因陰性植株。

Fig. 1. PCR analysis of transgenic rice plants carrying overexpressed

2.2?Os08g44770.1在各轉(zhuǎn)基因株系中的表達(dá)分析

采用定量RT-PCR分析了基因在WT及各轉(zhuǎn)基因株系(OE-44770)的15 d齡水稻幼苗葉片中的表達(dá)情況。從圖2可以看出，在正常生長(zhǎng)條件下，與WT相比，在各個(gè)過(guò)表達(dá)轉(zhuǎn)基因株系葉片中的表達(dá)量均顯著升高(>20倍)。綜合考慮目標(biāo)基因在各轉(zhuǎn)基因株系中的表達(dá)水平以及收獲的各株系的種子量，選擇OE-44770-4和OE-44770-13株系用于下一步研究。

2.3?轉(zhuǎn)基因水稻的砷耐受性分析

從圖3可以看出，與WT相比，在25 μmol/L As(Ⅲ)處理3 d時(shí)，OE-44770轉(zhuǎn)基因植株的葉片出現(xiàn)了明顯的卷曲現(xiàn)象，而且較低葉位的葉片已經(jīng)開(kāi)始逐漸黃化(圖3-A)。隨著As(Ⅲ)處理時(shí)間的延長(zhǎng)(6 d)，其葉片卷曲程度明顯加劇，黃化葉片數(shù)量也逐漸增多，同時(shí)較高葉位的葉片也開(kāi)始出現(xiàn)黃化(圖3-B)。這表明基因過(guò)量表達(dá)后顯著增加了轉(zhuǎn)基因水稻對(duì)亞砷酸鹽的敏感性。

2.4?亞砷酸鹽對(duì)供試材料各生理指標(biāo)的影響

2.4.1?對(duì)生物量(干質(zhì)量)的影響

與各供試材料的對(duì)照相比，在A(yíng)s(Ⅲ)處理6 d時(shí)，WT和各轉(zhuǎn)基因株系的干質(zhì)量均顯著下降(圖4)。OE-44770-4和OE-44770-13株系的平均降幅(分別減少39.15%和31.21%)遠(yuǎn)大于WT(12.53%)。

2.4.2?對(duì)根系相對(duì)伸長(zhǎng)量的影響

從圖5可以看出，在25 μmol/L亞砷酸鹽脅迫處理6 d時(shí)，各供試水稻根系的伸長(zhǎng)量均受到不同程度的抑制。但是，WT的受抑制程度(47.08%)明顯小于2個(gè)轉(zhuǎn)基因株系OE-44770-4和OE-44770-13(71.75%和65.4%)。因?yàn)樯槊{迫下根系的相對(duì)伸長(zhǎng)量是衡量水稻砷耐受性的重要指標(biāo)，所以過(guò)表達(dá)后確實(shí)顯著降低了轉(zhuǎn)基因水稻對(duì)亞砷酸鹽的耐受性。

圖2?WT和各轉(zhuǎn)基因株系葉片中Os08g44770.1的表達(dá)量

Fig. 2. Expression level ofgene in the leaves of wild type(WT) and transgenic rice lines.

圖3?亞砷酸鹽處理3 d和6 d后野生型(WT)和兩個(gè)轉(zhuǎn)基因株系的表型

Fig. 3. Comparison of phenotypes of WT and transgenic rice plants after As(Ⅲ) treatment for 3 and 6 days.

相同小寫(xiě)字母表示不同材料不同處理間差異未達(dá)0.05顯著水平。

Fig. 4. Comparison of biomass of WT and transgenic rice plants after 6-day As(Ⅲ) treatment(=8).

相同小寫(xiě)字母表示不同材料不同處理間差異未達(dá)0.05顯著水平。

Fig. 5. Comparison of relative root elongation of WT and transgenic rice plants under As(Ⅲ) stress for 6 days (=8).

2.4.3?對(duì)葉綠素含量的影響

亞砷酸鹽對(duì)植物的毒害作用主要表現(xiàn)為葉片卷曲、黃化并逐漸死亡，而葉片的黃化主要因?yàn)榫G色素含量發(fā)生改變所致[22]。從表2可以看出，與CK相比，As(Ⅲ)處理下，各供試水稻的葉綠素 a、葉綠素b、總?cè)~綠素以及類(lèi)胡蘿卜素的含量均出現(xiàn)不同程度的降低，但多數(shù)指標(biāo)的含量均與CK未達(dá)顯著差異。不過(guò)在砷處理下，OE-44770轉(zhuǎn)基因株系的葉綠素a以及總?cè)~綠素含量顯著低于WT(表2)。

表2?亞砷酸鹽對(duì)WT和各轉(zhuǎn)基因材料葉綠素含量的影響

同列數(shù)據(jù)后跟相同小寫(xiě)字母者表示不同材料不同處理間差異未達(dá)0.05顯著水平。

Data followed by the common letters within a column indicate no significant difference among the treatments or the materials (≤0.05).

2.4.4?對(duì)根尖細(xì)胞質(zhì)膜透性的影響

植物在逆境條件下細(xì)胞會(huì)受到不同程度損傷，但受傷害程度會(huì)因植株自身抗性和逆境條件而產(chǎn)生差異[23]。我們采用伊文思藍(lán)染色法鑒定各供試材料根系細(xì)胞在A(yíng)s(Ⅲ)脅迫下的受損程度，因?yàn)檎５募?xì)胞膜不會(huì)吸收或吸收很少的伊文思藍(lán)，但當(dāng)細(xì)胞膜受損后，伊文思藍(lán)會(huì)進(jìn)入細(xì)胞，使它呈現(xiàn)藍(lán)色。細(xì)胞膜受到損傷越大，伊文思藍(lán)進(jìn)入細(xì)胞越多，染色程度越深。從圖6可見(jiàn)，在A(yíng)s(Ⅲ)處理6 d后，2個(gè)轉(zhuǎn)基因株系根系染色程度遠(yuǎn)深于WT，表明其根系細(xì)胞的受損程度較大。

2.4.5?對(duì)葉片活性氧平衡變化的影響

在逆境脅迫條件下，植物體內(nèi)會(huì)產(chǎn)生大量的O2??、?OH、H2O2等活性氧自由基。這些自由基具有很強(qiáng)的氧化活性，能夠破壞植物體內(nèi)的氧化還原平衡，從而對(duì)植物造成傷害[24]。NBT會(huì)被超氧陰離子氧化而還原成藍(lán)色沉淀。因此，通過(guò)NBT染色可推斷出各供試材料所受的氧化脅迫程度。從圖7可以看出，在A(yíng)s(III)脅迫處理下，各供試水稻的葉片均存在不同程度的藍(lán)色沉淀。但是WT葉片出現(xiàn)的沉淀較少，而OE-44770的顏色程度較深且染色范圍較廣，表明在亞砷酸鹽處理后轉(zhuǎn)基因材料比WT受到了更強(qiáng)的過(guò)氧化脅迫。

2.4?各供試水稻中Os08g44770.1基因的表達(dá)模式

在亞砷酸鹽處理的不同時(shí)間點(diǎn)(0、6、24、72、144 h)，在WT和轉(zhuǎn)基因植株葉片中的表達(dá)模式略有差異：其在WT中的表達(dá)量呈現(xiàn)先上升(0~24 h)后下降再上升的趨勢(shì)，而且在脅迫24 h時(shí)表達(dá)量達(dá)到最高，但隨著處理時(shí)間的延長(zhǎng)，其表達(dá)量出現(xiàn)下降(72 h)，但在脅迫144 h時(shí)又出現(xiàn)上調(diào)；而在轉(zhuǎn)基因材料中，的表達(dá)趨勢(shì)表現(xiàn)為處理6 h時(shí)下降，但在脅迫24 h時(shí)達(dá)到最大值，隨后在72 h時(shí)表達(dá)水平急劇下降，不過(guò)在處理6 d時(shí)其表達(dá)量又出現(xiàn)反彈(圖8)。另外，我們發(fā)現(xiàn)，在轉(zhuǎn)基因植株根系中該基因具有與其在葉片中相似的表達(dá)模式(數(shù)據(jù)未提供)。

圖6 亞砷酸鹽處理后WT和各轉(zhuǎn)基因株系根尖細(xì)胞質(zhì)膜透性比較

Fig. 6. Comparison of plasma membrane integrity of WT and transgenic rice plants after As(Ⅲ) treatment.

圖7 亞砷酸鹽處理后WT和各轉(zhuǎn)基因株系葉片活性氧平衡變化的比較

Fig. 7. Comparison of reactive oxygen balance in the leaves of WT and transgenic rice plants under As(Ⅲ) stress.

圖8 亞砷酸鹽處理后Os08g44770.1在WT和轉(zhuǎn)基因植株葉片中的表達(dá)變化

Fig. 8. Temporal expression profiles ofin the leaves of As(Ⅲ)-treated WT and transgenic rice plants.

3?討論

目前，有關(guān)水稻砷耐性相關(guān)蛋白編碼基因和調(diào)控性miRNA的鑒定及其應(yīng)答As(Ⅴ)或As(Ⅲ)脅迫的分子機(jī)制研究等方面取得了一定進(jìn)展[11-17]。Liu等[16]發(fā)現(xiàn)，miR528可負(fù)調(diào)控水稻對(duì)As(Ⅲ)的耐受性。生物信息學(xué)和煙草葉片轉(zhuǎn)染等進(jìn)一步表明，是miR528的靶基因。那么，miR528是否通過(guò)與基因互作進(jìn)而調(diào)控水稻對(duì)As(Ⅲ)脅迫做出應(yīng)答呢？我們采用過(guò)表達(dá)轉(zhuǎn)基因策略證明也負(fù)向調(diào)控水稻的砷耐受性(圖3)。miR528與在調(diào)控水稻砷耐受性改變方面的作用機(jī)理有待進(jìn)一步深入探究。

植物在進(jìn)化過(guò)程中，衍生出通過(guò)調(diào)節(jié)抗氧化酶系活性等機(jī)制以響應(yīng)外界逆境脅迫[25]。在抗氧化酶系統(tǒng)中，超氧化物歧化酶(SOD)可有效清除植物在逆境脅迫下細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生的自由基，將其轉(zhuǎn)化成過(guò)氧化氫，而后進(jìn)一步在CAT、APX等作用下將其分解成分子氧和水，使得植物免受或減少脅迫傷害[26]。Tripathi等[27]和張麗清等[17]發(fā)現(xiàn)，耐砷水稻在砷脅迫下其植株內(nèi)SOD等抗氧化酶活性明顯上調(diào)，而在砷敏感材料中的活性顯著下降，表明該酶的活性與植物的抗逆能力呈現(xiàn)一定正相關(guān)。本研究發(fā)現(xiàn)，基因在WT(耐砷品種)砷脅迫24 h時(shí)被顯著誘導(dǎo)表達(dá)；該基因在過(guò)表達(dá)轉(zhuǎn)基因植株砷處理不同時(shí)間也強(qiáng)烈上調(diào)表達(dá)(遠(yuǎn)高于其在WT中的表達(dá)水平)，但轉(zhuǎn)基因植株卻表現(xiàn)為對(duì)砷耐性顯著減弱。因此，推測(cè)當(dāng)SOD酶活性達(dá)到一定水平時(shí)，植物通過(guò)啟動(dòng)其抗氧化防御系統(tǒng)以應(yīng)對(duì)逆境脅迫[28]，但當(dāng)SOD酶基因被過(guò)度超量表達(dá)后，可能會(huì)破壞植物抗氧化防御系統(tǒng)平衡，從而產(chǎn)生相反效應(yīng)而使植物受到毒害。

根系是植物感受外界逆境脅迫的初始部位，其生理狀況直接影響到植物的生長(zhǎng)發(fā)育及其耐受性[29]。重金屬脅迫下，植物通過(guò)根系吸收污染物并向地上部運(yùn)輸、轉(zhuǎn)運(yùn)，當(dāng)污染物積累到一定程度時(shí)，植物就會(huì)出現(xiàn)中毒癥狀。研究發(fā)現(xiàn)，植物的根系相對(duì)伸長(zhǎng)量可直接反映其抗逆能力。在高濃度硒脅迫下，彩葉草幼苗的根系相對(duì)伸長(zhǎng)量明顯低于對(duì)照[30]。在逆境脅迫下，植物體內(nèi)的活性氧自由基含量會(huì)增加，導(dǎo)致根系膜質(zhì)過(guò)氧化程度加劇以及葉片活性氧代謝失衡[31]。本研究發(fā)現(xiàn)，過(guò)表達(dá)轉(zhuǎn)基因株系對(duì)亞砷酸鹽的耐受性下降，而且其根系的相對(duì)伸長(zhǎng)量、根系細(xì)胞膜完整性、葉片抗氧化程度等均顯著弱于WT。表明亞砷酸鹽脅迫會(huì)破壞轉(zhuǎn)基因植株的根系細(xì)胞結(jié)構(gòu)，進(jìn)而影響植株的生長(zhǎng)發(fā)育進(jìn)程，致使葉片發(fā)黃，植株長(zhǎng)勢(shì)變?nèi)?，甚至死亡。這與常思敏等[32]的研究結(jié)果一致。

生物量是植物響應(yīng)逆境脅迫的綜合反應(yīng)。在逆境脅迫下，植物所受脅迫程度越高，受抑制現(xiàn)象越明顯，植物生長(zhǎng)發(fā)育越緩慢[33]。本研究發(fā)現(xiàn)，隨著砷處理時(shí)間延長(zhǎng)，各供試材料的生物量(干質(zhì)量)均顯著低于CK，而且轉(zhuǎn)基因植株的生物量明顯低于WT，表明基因被過(guò)表達(dá)后，水稻對(duì)亞砷酸鹽的敏感程度加劇。另外，植物葉片中葉綠素的含量直接影響其光合作用效率[34]。研究發(fā)現(xiàn)，在逆境脅迫下，葉綠素含量越低，相應(yīng)植株的耐受性越低[35]。本研究中，砷脅迫下，過(guò)表達(dá)轉(zhuǎn)基因株系的葉綠素含量降低，而且其葉片的黃化程度也比CK嚴(yán)重。因此，可以推測(cè)被超量表達(dá)后可能導(dǎo)致植株內(nèi)產(chǎn)生嚴(yán)重過(guò)氧化脅迫而致使細(xì)胞質(zhì)膜通透性增大并伴隨大分子物質(zhì)損失[27]，進(jìn)而造成轉(zhuǎn)基因植株的砷耐受性變?nèi)酢?/p>

[1] 劉雪琴, 仝瑞建, 宋睿. 植物的砷污染研究進(jìn)展. 湖北農(nóng)業(yè)科學(xué), 2014, 53(15): 3477-3481.

Liu X Q, Tong R J, Song R. Arsenic contamination of plant., 2014, 53(15): 3477-3481. (in Chinese with English abstract)

[2] Brammer H, Ravenscroft P. Arsenic in groundwater: A threat to sustainable agriculture in South and South-east Asia., 2009, 35(3): 647-654.

[3] Su Y H, Mcgrath S P, Zhao F J. Rice is more efficient in arsenite uptake and translocation than wheat and barley., 2010, 328(1-2): 27-34.

[4] 段桂蘭. 植物體內(nèi)砷酸鹽還原的生物化學(xué)與分子生物學(xué)研究. 北京: 中國(guó)科學(xué)院生態(tài)環(huán)境研究中心, 2006.

Duan G L. The biochemical and biomolecular mechanisms of arsenate reduction in plants. Beijing: Research Center for Eco-Environmental Sciences, Chinese Academy of Sciences, 2006. (in Chinese with English abstract)

[5] Duan G L, Zhou Y, Tong Y R, Mukhopadhyay R, Rosen B P, Zhu Y G. A CDC25 homologue from rice functions as an arsenate reductase., 2007,174(2): 311-321.

[6] Dhankher O P, Rosen B P, Mckinney E C, Meagher R B. Hyperaccumulation of arsenic in the shoots ofsilenced for arsenate reductase (ACR2)., 2006,103(14): 5413-5418.

[7] Zhao F J, Ma J F, Ma J F, Meharg A A, Mcgrath S P. Arsenic uptake and metabolism in plants., 2009, 181(4): 777-794.

[8] Chen Y, Sun S K, Tang Z, Liu G, Moore K L, Maathuis F J M, Miller A J, Mcgrath S P, Zhao F J. The Nodulin 26-like intrinsic membrane protein OsNIP3;2 is involved in arsenite uptake by lateral roots in rice.2017, 68(11): 3007-3016.

[9] Zhao X Q, Mitani N, Yamaji N, Shen R F, Ma J F. Involvement of silicon influx transporter OsNIP2;1 in selenite uptake in rice., 2010, 153(4): 1871-1877.

[10] Ma J F, Yamaji N, Mitani N, Tamai K, Saeko K, Fujiwara T, Katsuhara M, Yano M. An ef?ux transporter of silicon in rice., 2007, 448(7150): 209-212.

[11] Mosa K A, Kumar K, Chhikara S, Mcdermott J, Liu Z, Musante C, White J C, Dhankher O P. Members of rice plasma membrane intrinsic proteins subfamily are involved in arsenite permeability and tolerance in plants., 2012, 21(6): 1265-1277.

[12] Tiwari M, Sharma D, Dwivedi S, Singh M, Tripathi R D, Trivedi P K. Expression inand cellular localization reveal involvement of rice NRAMP,, in arsenic transport and tolerance., 2014, 37(1): 140-152.

[13] Cao Y, Sun D, Ai H, Mei H, Liu X, Sun S, Xu G, Liu Y, Chen Y, Ma L Q. Knocking outgene decreases arsenate uptake by rice plants and inorganic arsenic accumulation in rice grains., 2017, 51(21): 12131-12138.

[14] Wang P, Zhang W, Mao C, Xu G, Zhao F J. The role ofin arsenate uptake and varietal difference in arsenate tolerance in rice., 2016, 67(21): 6051-6059.

[15] Xu J, Shi S, Wang L, Tang Z, Lü T, Zhu X L, Ding X M, Wang Y F, Zhao F J, Wu Z C.is critical for arsenate tolerance and regulates arsenic accumulation in rice., 2017, 215(3): 1090-1101.

[16] Liu Q, Hu H, Zhu L, Li R, Feng Y, Zhang L, Yang Y, Liu X, Zhang H. Involvement of miR528 in the regulation of arsenite tolerance in rice (L.)., 2015, 63(40): 8849-8861.

[17] 張麗清, 陳霞, 胡海超, 張俊艇, 官慧謙, 劉慶坡. miR3979在水稻砷耐受性中的作用. 浙江農(nóng)林大學(xué)學(xué)報(bào), 2016, 33(4): 571-580.

Zhang L Q, Chen X, Hu H C, Zhang J T, Liu Q P. miR3979-mediated arsenite tolerance in rice., 2016, 33(4): 571-580. (in Chinese with English abstract)

[18] 王建華, 劉鴻先, 徐同. 超氧物歧化酶(SOD)在植物逆境和衰老生理中的作用. 植物生理學(xué)報(bào), 1989(1): 1-7.

Wang J H, Liu H X, Xu T. The role of superoxide dismutase (SOD) in stress physiology and senescence physiology of plant., 1989(1): 1-7. (in Chinese)

[19] Kaminaka H, Morita S, Yokoi H, Masumura T, Tanaka K. Molecular cloning and characterization of a cDNA for plastidic copper/zinc-superoxide dismutase in rice (L.)., 1997, 38(1): 65-69.

[20] Kaminaka H, Morita S, Tokumoto M, Masumura T, Tanaka K. Differential gene expressions of rice superoxide dismutase isoforms to oxidative and environmental stresses., 1999, 31: S219-S225.

[21] Murray M G, Thompson W F. Rapid isolation of high molecular weight plant DNA., 1980, 8 (19): 4321-4325.

[22] 劉全吉, 孫學(xué)成, 胡承孝. 砷對(duì)小麥生長(zhǎng)和光合作用特性的影響. 生態(tài)學(xué)報(bào), 2009, 29(2): 854-859.

Liu Q J, Sun X C, Hu C X. Growth and photosynthesis characteristics of wheat (L.) under arsenic stress condition., 2009, 29(2): 854-859. (in Chinese with English abstract)

[23] 詹潔, 余永昌, 何龍飛. 逆境條件下的植物細(xì)胞程序性死亡. 南方農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào), 2006, 37(1): 13-16.

Zhan J, Yu Y C, He L F. Programmed cell death of plant in adversity conditions., 2006, 37(1): 13-16. (in Chinese with English abstract)

[24] 桑子陽(yáng), 馬履一, 陳發(fā)菊. 干旱脅迫對(duì)紅花玉蘭幼苗生長(zhǎng)和生理特性的影響. 西北植物學(xué)報(bào), 2011, 31(1): 109-115.

Sang Z Y, Ma L Y, Chen F J. Growth and physiological characteristics ofseedlings under drought stress., 2011, 31(1): 109-115. (in Chinese with English abstract)

[25] Srivastava M, Ma L Q, Rathinasabapathi B, Srivastava P. Effects of selenium on arsenic uptake in arsenic hyperaccumulatorL., 2009, 100(3): 1115-1121.

[26] 謝亞軍, 王兵, 梁新華, 韓招迪. 干旱脅迫對(duì)甘草幼苗活性氧代謝及保護(hù)酶活性的影響. 農(nóng)業(yè)科學(xué)研究, 2008,29(4): 19-22.

Xie Y J, Wang B, Liang X H, Han Z D. Effect of drought stress on active oxygen metabolism and activities of protective enzymes of licorice seedlings., 2008, 29(4): 19-22. (in Chinese with English abstract)

[27] Tripathi P, Tripathi R D, Singh R P, Dwivedi S, Chakrabarty D, Trivedi P K, Adhikari B. Arsenite tolerance in rice (L.) involves coordinated role of metabolic pathways of thiols and amino acids., 2013, 20(2): 884-896.

[28] 李黎, 宋帥杰, 方小梅. 高溫干旱及復(fù)水對(duì)毛竹實(shí)生苗保護(hù)酶和脂質(zhì)過(guò)氧化的影響. 浙江農(nóng)林大學(xué)學(xué)報(bào), 2017, 34(2): 268-275.

Li L, Song S J, Fang X M. Protection enzymes and lipid peroxidation inseedlings with temperature and water stresses., 2017, 34(2): 268-275. (in Chinese with English abstract)

[29] 汪攀, 陳奶蓮, 鄒顯花. 植物根系解剖結(jié)構(gòu)對(duì)逆境脅迫響應(yīng)的研究進(jìn)展. 生態(tài)學(xué)雜志, 2015,34(2): 550-556.

Wang P, Chen N L, Zou X H. Research progress on adaptive responses of anatomical structure of plant roots to stress., 2015, 34(2): 550-556. (in Chinese with English abstract)

[30] 袁菊紅, 胡綿好. 彩葉草根系對(duì)亞硒酸鈉脅迫的適應(yīng)機(jī)制研究. 西南農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào), 2015, 28(5): 2009-2015．

Yuan J H, Hu M H. Study on adaptive mechanisms ofroots to Na2SeO3stress., 2015, 28(5): 2009-2015. (in Chinese with English abstract)

[31] Zgallai H, Steppe K, Lemeur R. Effects of different levels of water stress on leaf water potential, stomatal, stomatal resistance, protein and chlorophyll content and certain anti-oxidative enzymes in tomato plants., 2006, 48(6): 679-685.

[32] 常思敏, 馬新明, 蔣媛媛, 賀德先, 張貴龍. 土壤砷污染及其對(duì)作物的毒害研究進(jìn)展. 河南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào), 2005, 39(2): 161-186.

Chang S M, Ma X M, Jiang Y Y, He D L, Zhang G L. Research progress on arsenic contamination in soils and arsenic toxicity in crops., 2005, 39(2): 161-186. (in Chinese with English abstract)

[33] 蔣明義, 郭紹川. 水分虧缺誘導(dǎo)的氧化脅迫和植物的抗氧化作用. 植物生理學(xué)報(bào), 1996, 32(2): 144-150.

Jiang M Y, Guo S C. Oxidative stress and antioxidation induced by water deficiency in plants., 1996, 32(2): 144-150. (in Chinese with English abstract)

[34] 林陽(yáng), 王世忠. 4 種油松混交灌木樹(shù)種的耐陰性研究. 河北林果研究, 2014, 29(3): 258-262.

Lin Y, Wang S Z. Research on the shade tolerance of 4 shrub tree species mixed with., 2014, 29(3): 258-262. (in Chinese with English abstract)

[35] 肖姣娣. 3種刺籬植物對(duì)干旱脅迫的生理生化響. 西北農(nóng)林科技大學(xué)學(xué)報(bào), 2015, 43(7): 155-160.

Xiao J D. Physiological and biochemical responses of three spiny plants to drought stress., 2015, 43(7): 155-160. (in Chinese with English abstract)

Functional Analysis of a Copper/Zinc SOD Encoding Gene in Response to Arsenite Stress in Rice

DOU Lingling, HU Haichao, MA Long, KE Xiaonan, LIU Mingyue, LIAN Wangmin, JIN Ke, XIE Lingjuan, LIU Qingpo*

(,;*Corresponding author, E-mail: liuqp@zafu.edu.cn)

【Objective】encodes a Cu/Zn-SOD protein in rice, but its biological function in response to arsenite [As(Ⅲ)] remains unclear. The results presented here would be intriguing for further investigating the molecular mechanisms of-mediated arsenic tolerance in rice, and also providing useful new idea for rice stress resistance breeding. 【Methods】Using wild type(WT) Nipponbare and two transgenic rice lines overexpressingas materials, we investigated the phenotypes of WT and transgenic plants after exposure to As(Ⅲ), and further uncovered its physiological and molecular mechanisms in regulation of As(Ⅲ) tolerance in rice through stress treatment, physiological index measurement, and gene expression analysis, etc. 【Result】The results showed that, compared with WT, transgenic rice plants were more sensitive to As(Ⅲ) stress; Under As(Ⅲ) exposure, transgenic plants showed shorter relative root elongation, lower biomass (dry weight) and chlorophyll content, as well as lower root cell membrane integrity and antioxidant abilities in leaves. Moreover,exhibited slightly different expression patterns but both showing expression peak at 24 h after As(Ⅲ) treatment in leaves of WT and transgenic plants. 【Conclusion】Strong overexpression ofin rice would result in its hypersensitivity to arsenite stress.

rice; Cu/Zn SOD; arsenite; transgenic; physiological mechanism; gene expression

Q786; Q945.78; S511.034

A

1001-7216(2018)05-0437-08

10.16819/j.1001-7216.2018.7154

2017-12-25;

2018-02-01。

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(31471431)；浙江農(nóng)林大學(xué)“青年拔尖人才”計(jì)劃資助項(xiàng)目；浙江農(nóng)林大學(xué)學(xué)生科研訓(xùn)練項(xiàng)目(2013200014, 2013200037, 2013200056)。