分子標記輔助選擇改良C418對紅蓮型粳稻不育系的恢復力

張宏根 仲崇元 司華 劉巧泉 顧銘洪 湯述翥

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分子標記輔助選擇改良C418對紅蓮型粳稻不育系的恢復力

張宏根 仲崇元 司華 劉巧泉 顧銘洪 湯述翥*

(揚州大學 江蘇省作物遺傳生理國家重點實驗室培育點/糧食作物現(xiàn)代產(chǎn)業(yè)技術協(xié)同創(chuàng)新中心/教育部植物功能基因組學重點實驗室, 江蘇 揚州 225009;*通訊聯(lián)系人, E-mail: sztang@yzu.edu.cn)

【目的】高效選育紅蓮型(Honglian，HL)粳稻恢復系有助于HL型雜交粳稻育種，對促進三系雜交粳稻的發(fā)展具有重要的意義。【方法】是一個HL型恢復基因，來源于HL型秈稻強恢復系9311。前期研究中，在以9311為供體、日本晴為受體的一套染色體片段代換系中鑒定出攜帶的株系R1093。本研究利用R1093與BT型粳稻恢復系C418(攜帶)雜交，通過常規(guī)回交育種結(jié)合分子標記輔助選擇技術，將導入C418中，進行與聚合育種；利用BT型、HL型六千辛A進行測交鑒定改良系的恢復力。【結(jié)果】共獲得12個BC3F4株系和55個BC4F3株系，其中6個改良系的農(nóng)藝性狀已基本接近C418；測交鑒定結(jié)果表明聚合的改良系對HL型粳稻不育系的恢復度達到85%以上，可應用于水稻生產(chǎn)；對BT型粳稻不育系的恢復度提升效果不顯著?！窘Y(jié)論】聚合能有效改良BT型粳稻恢復系對HL型粳稻不育系恢復力，是選育HL型粳稻恢復系的一條重要途徑。

粳稻；紅蓮型；恢復系；分子標記輔助選擇

水稻是我國第一大糧食作物，促進水稻產(chǎn)量的增長有助于保障我國糧食安全。當前，我國水稻種植面積約0.3億hm2，其中秈稻約占2/3，雜交秈稻約占秈稻種植面積的80%，而雜交粳稻只占粳稻種植面積的3%左右[1]。育種實踐證明，雜交稻較常規(guī)稻有15%~20%的增產(chǎn)潛力[2]。因此，發(fā)展雜交粳稻是我國水稻增產(chǎn)的一條有效途徑。

雜交稻分為三系法雜交稻與兩系法雜交稻。三系法雜交稻利用的是質(zhì)核互作雄性不育系，包臺(Chinsurah BoroⅡ, BT)型、紅蓮(Honglian, HL)型、野敗(Wild Abortive, WA)型水稻不育胞質(zhì)的恢保關系不同，花粉敗育時期及特征不同，育性遺傳方式不同，被認為是3種代表類型[3]。三系雜交粳稻以利用BT型不育系為主。BT型不育系花粉三核期敗育，敗育時期相對較晚，花粉呈染敗類型，BT型粳稻不育系不育性欠穩(wěn)定，影響制種純度[4]。為克服BT型粳稻不育系不育性欠穩(wěn)定及細胞質(zhì)單一的問題，育種家在雜交粳稻育種過程中探索利用其他不育細胞質(zhì)。鑒于WA型不育系不育性穩(wěn)定，在20世紀70年代育種家們便開展了WA型粳三系育種工作，但轉(zhuǎn)育成的WA型粳稻不育系存在兩大問題：一是開花習性差，二是難以篩選到強恢復源，致使WA型粳稻不育系難以利用。HL型不育系花粉為圓敗類型，與BT型不育系染敗花粉相比，花粉敗育相對徹底。本課題組通過多年研究發(fā)現(xiàn)，HL型粳稻不育系的開花習性及異交結(jié)實性與BT型粳稻不育系無顯著差異，而不育性較BT型不育系穩(wěn)定，可恢復性雖不如BT型不育系，但遠優(yōu)于WA型不育系[5-8]，可以選育HL型粳稻不育系及相應恢復系來配制雜交粳稻新組合。HL型不育系與BT型不育系均屬于配子體不育類型，具有類似的恢保關系[8]，因此HL型粳稻不育系可以由主栽粳稻品種直接轉(zhuǎn)育，目前本課題組已培育出多個HL型粳稻不育系。對HL型粳稻恢復系篩選研究發(fā)現(xiàn)，現(xiàn)有大多數(shù)BT型粳稻恢復系對HL型不育系只具有部分恢復力，難以直接用于雜交稻配組[8]。因此，加強HL型粳稻恢復系的選育對于促進HL型三系雜交粳稻在生產(chǎn)上應用具有重要的意義。

有關BT型恢復基因的遺傳與定位，大多數(shù)研究認為BT型恢復系帶有1對恢復基因，并將該基因定位于第10染色體長臂上，在位點內(nèi)存在兩個育性恢復基因和，且上位于[9, 10]。HL型恢復基因遺傳研究主要集中在秈稻核背景下。多數(shù)研究認為HL型秈稻不育系的育性恢復受1對基因控制，絕大多數(shù)恢復系所帶的恢復基因為，該基因與BT型恢復基因為同一基因；但HL型強恢復系9311除攜帶外，它還攜帶位于第8染色體上的一個恢復基因[11-15]。目前，尚未見有關用于雜交粳稻恢復系選育的報道。

C418是一個配合力較強的BT型粳稻恢復系，利用C418已選育了多個雜交粳稻組合，如屜優(yōu)418、泗優(yōu)418、9優(yōu)418、3優(yōu)18、陵香優(yōu)18、陵風優(yōu)18、雙優(yōu)18等。C418與大多數(shù)BT型粳稻恢復系一樣，對HL型粳稻不育系僅具有部分恢復力。本課題組在前期研究中，從以9311為供體、日本晴為受體的一套染色體片段系中鑒定出1個攜帶HL型恢復基因的代換系R1093[16]。本研究通過常規(guī)回交育種結(jié)合分子標記輔助選擇技術，將導入BT型粳稻恢復系C418中；在此基礎上，分析導入的改良系對HL型粳稻不育系的恢復力，探索選育HL型粳稻恢復系的途徑。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

受體品種為BT型粳稻恢復系C418(攜帶恢復基因)，由遼寧省農(nóng)業(yè)科學院選育；供體品種為以9311為供體的日本晴背景代換系R1093(攜帶恢復基因)。測配親本為BT型、HL型粳稻不育系六千辛A及BT型粳稻不育系52605A。上述代換系及不育系材料均由本課題組選育。

1.2 恢復基因聚合系的選育

試驗于2012年至2016年分別在揚州大學實驗農(nóng)牧場和海南陵水揚州大學南繁基地進行。2012年冬季海南，種植各親本，同時配制52605A/C418和C418/R1093這2個F1組合。

2013年正季揚州，種植所配F1組合，以C418為母本，配制C418//C418/R1093 BC1F1組合，收獲52605A/C418 F1植株上種子。

2013年冬季海南，種植BC1F1群體，田間觀察表型并結(jié)合分子標記檢測結(jié)果選擇帶有的單株為父本與C418雜交，同時溫室種植52605A/C418 F2群體。

2014年正季揚州，種植BC2F1群體，結(jié)合分子標記檢測結(jié)果選取基因型為的單株作父本進行回交，并篩選優(yōu)良單株留種。

2014年冬季海南，種植BC2F2、BC3F1群體, 在BC3F1群體中繼續(xù)選取目標單株回交；在BC2F2群體中選取1株基因型為、6株基因型為的植株及C418分別與HL型六千辛A配制相應的測交F1；在BC3F1群體中，結(jié)合分子標記檢測結(jié)果篩選優(yōu)良單株留種。

圖1 恢復基因聚合系的選育過程

Fig. 1. Breeding scheme of the improved lines.

2015年正季揚州，種植BC3F2、BC4F1和測交F1；在BC3F2、BC4F1群體中，結(jié)合分子標記檢測結(jié)果篩選優(yōu)良單株留種。

2015年冬季海南，種植BC3F3、BC4F2株系。從這些株系中，隨機選擇10株純合基因型植株及C418分別與BT型、HL型六千辛A測交；篩選出6個位點純合且農(nóng)藝性狀與C418相近的株系。C418回交改良過程如圖1所示。

以上試驗材料正季在揚州于5月10日播種，6月10日移栽，冬季在海南陵水12月15日播種，1月15日移栽，每行栽插10株，單苗栽插，株行距13.3 cm×25.0 cm，栽插密度為30萬穴/hm2，水稻生長期間管理同一般大田。

1.3 水稻DNA的提取及PCR擴增

水稻基因組DNA提取采用CTAB法[17]，并稍作改進。檢測的標記為RM407[16]，檢測的標記為STS10-16[18]，引物序列列于表1。PCR擴增采用20 μL的反應體系：2.5 μL模板DNA、2 μL 10×緩沖液(不含Mg2+)、2 μL dNTPs(2.5 mmol/L)、2 μL MgCl2(25 mmol/L)、1.6 μL 10 μmol/L的引物、0.2 μL的酶(5 U/μL)，11.7 μL ddH2O。PCR擴增程序：95℃下預變性5 min；94℃下變性40 s，53℃下退火40 s，72℃下延伸40 s，擴增30個循環(huán)；72℃下延伸10 min，4℃下保溫。擴增產(chǎn)物在3%瓊脂糖凝膠中電泳，經(jīng)溴化乙錠染色后在Bio-Rad凝膠成像系統(tǒng)下拍照并分析電泳結(jié)果。

表1 恢復基因連鎖標記及引物序列

1.4 恢復基因聚合系的恢復力鑒定

2015?2016年正季揚州，待種子成熟后，選取測交系小區(qū)中部3~5株(2015年取樣5株，2016年取樣3株)考查整株自然小穗育性。

1.5 農(nóng)藝性狀調(diào)查

每個株系種植60株，2次重復。抽穗后記載各小區(qū)的始穗期，并折算成播始天數(shù)(播種至始穗的天數(shù))。成熟后，每小區(qū)調(diào)查10株的穗數(shù)計算單株穗數(shù)；齊地面割取10個主莖，測定株高、劍葉、倒2葉、倒3葉葉片長度、劍葉出葉角度(劍葉基部與主莖的夾角)、莖粗、穗頸粗度(頸粗)、穗葉差(劍葉葉尖高度與穗尖高度的差值，劍葉葉尖高于穗尖為正值，劍葉葉尖低于穗尖為負值)、主莖穗長、主莖穗總粒數(shù)、一次枝梗數(shù)和穗彎曲度。

1.6 統(tǒng)計分析

數(shù)據(jù)利用SPSS 21.0軟件進行處理，農(nóng)藝性狀及測交F1小穗育性按系與對照分別進行差異顯著性測定。

2 結(jié)果與分析

2.1 C418所帶恢復基因的驗證

已有的研究表明，C418攜帶BT型恢復基因(/)[9]。為驗證C418是否僅攜帶基因，2013年冬，在溫室種植52605A/C418 F2群體，利用與緊密連鎖的標記STS10-16對F2群體內(nèi)94株單株進行檢測，部分植株電泳結(jié)果如圖2。

P1為52605A；P2為C418；1~44為52605A/C418 F2群體內(nèi)單株。

Fig. 2. Molecular detection of 52605A/C418 F2individuals using STS10-16.

A－標記RM407擴增結(jié)果；B－標記STS10-16擴增結(jié)果。P1為C418；P2為R1093；1~40為C418//C418/R1093 BC2F2群體內(nèi)單株。

Fig. 3. Molecular detection of C418//C418/R1093 BC2F2individuals.

**表示與C418測交F1的小穗育性存在極顯著差異。C418和L1基因型為Rf1Rf1rf6rf6，L2~L7基因型為Rf1Rf1Rf6Rf6。

Fig. 4. Spikelet fertility of the testcrossing F1plants from the crosses between HL-Liuqianxin A and the improved lines, HL-Liuqianxin A and C418, respectively(2015).

表2 各世代的分子標記輔助選擇結(jié)果

恢復基因頻率指的是BCF1群體中基因型為植株比例，BCF2群體中基因型為植株比例。

Individuals with the genotypes ofandin BCF1and BCF2populations, respectively, are selected to analyze the frequency of.

表3 BT型、HL型六千辛A測交F1的小穗育性(2016)

**表示改良系與C418測交F1的小穗育性存在極顯著差異。

All values are listed as mean±;**means significant difference in spikelet fertility between F1s from the improved lines and C418 at 0.01 probability level.

BT型不育系屬配子體不育類型，若C418僅帶，由于F1植株攜有的配子不參與受精，52605A/C418 F2群體中位點僅出現(xiàn)與基因型，表現(xiàn)為雙親雜合帶型及C418帶型，且兩種帶型的植株比應為1∶1。從圖2中可以發(fā)現(xiàn)，標記STS10-16在F2群體中僅擴增出雙親雜合帶型及C418帶型，其中擴增出雜合帶型的植株51株，擴增出C418帶型的植株43株，兩者符合1∶1分離比(2=0.681<20.05,1=3.84)，表明C418僅帶有1對主效恢復基因，即。

2.2 連鎖標記的篩選及分子標記輔助選擇結(jié)果

為HL型胞質(zhì)雄性不育恢復基因，本實驗室在粳稻核背景下對其精細定位過程中，共開發(fā)了61對SSR和InDel標記[16]，用這些標記對C418和R1093進行多態(tài)性分析，獲得了14對在雙親間具有多態(tài)且具有較好擴增效果的標記，其中標記RM407與相距大約15 kb，與發(fā)生交換的概率非常低，從減少分子檢測工作量的角度考慮，本研究僅選擇RM407用于位點的檢測；同時，我們選用標記STS10-16對位點進行檢測。標記RM407及STS10-16對BC2F2群體內(nèi)單株檢測結(jié)果如圖3所示。

2013－2016年間，利用標記RM407對不同回交世代群體內(nèi)的單株進行檢測，不同基因型植株檢測結(jié)果見表2。

由表2可以看出，在標記RM407處，不同基因型的單株在各回交世代群體中分離比均接近理論值，說明利用該標記對位點選擇是可行的。至2016年正季，共獲得了12個BC3F4、55個BC4F3株系(基因型為)。

2.3 改良系對HL型粳稻不育系的恢復力鑒定

2014年冬季海南，在BC2F2群體中，根據(jù)標記檢測結(jié)果，隨機選擇6株基因型為的植株、1株基因型為的單株及對照C418()分別與HL型六千辛A配組，共獲得8個測交F1。2015年正季揚州，成熟后每個測交F1群體選取5株考查整株小穗育性，計算每個測交系的平均小穗育性，具體結(jié)果如圖4。

由圖4可以看出，C418與僅帶的改良系(L1)對HL型六千辛A的恢復力無顯著差異，攜帶的改良系(L2~L7)與HL型六千辛A的測交F1小穗育性均在90%左右，與對照相比，其測交后代的小穗育性極顯著提高(<0.01)。這些結(jié)果初步表明，在C418中導入能顯著增強其對HL型粳稻不育系的恢復力。

為進一步研究聚合恢復基因?qū)L型粳稻不育系育性恢復的效應及育種利用的可能性，2015年海南，從BC3F3、BC4F2株系中隨機選取10株基因型為植株(株號為SL1~SL10)及C418分別與BT型、HL型六千辛A雜交，共獲得22個測交F1。2016年揚州正季考查測交F1小穗育性(表3)。

由表3可見，受體親本C418是BT型粳稻恢復系，與BT型不育系測交后代育性較高；改良系與BT型不育系測交F1平均小穗育性較C418提高2%左右，未達顯著水平，改良效果不太明顯。C418與HL型六千辛A測交F1的小穗育性為74.49%，所有聚合基因的改良系單株測交F1小穗育性平均為91.58%，較C418提高17.09個百分點，并且所有改良系測交后代小穗育性與對照相比均極顯著提高(<0.01)；大多數(shù)改良系對BT型、HL型粳稻不育系的恢復度相近，其中SL1和SL9對六千辛A測交F1平均小穗育性已超過95%。

由以上兩年結(jié)果可見，通過聚合6能夠改良現(xiàn)有BT型粳稻恢復系對HL型粳稻不育系的恢復力，使相應的配組后代結(jié)實率達到可應用水平。

2.4 改良系主要農(nóng)藝性狀表現(xiàn)

2015年冬季海南，在12個BC3F3，55個BC4F2改良株系中，結(jié)合田間株型、抽穗期和開花習性等農(nóng)藝性狀目測考查，初步篩選出6株基因型為且農(nóng)藝性狀與對照C418相似的單株；2016年正季揚州，種植6個改良系（編號G1~G6）及對照C418。記載各系的生育期，成熟后取樣考查14個主要農(nóng)藝性狀并與C418進行比較分析。

表4 改良系與C418主要農(nóng)藝性狀比較(2016)

*表示與C418在0.05水平上差異顯著。穗葉差―劍葉葉尖與穗尖的高度差。

All values are listed as mean±; * means significant difference at 0.05 probability level, respectively. DTH, Days to heading; PH, Plant height; CT, Culm thickness; PNP, Panicle number per plant; CPL, Length of caulis panicle; SNC, Spikelet number of caulis panicle; PBN, Primary rachis branch number; AFL, Angle between flag leaf and caudex; TLL, Length of the 3rd leaf from top; SLL, Length of the 2nd leaf from top; FLL, Length of flag leaf; DPFL, Vertical distance between panicle tip and flag leaf tip; PND, Panicle neck diameter; PCD, Panicle curvature degree.

由表4可以看出，由于上世代是在海南進行的單株選擇，兩地兩季氣候差異及各單株的光溫反應不同，所選擇鑒定的改良系生育期與對照存在較小差異。其他13個農(nóng)藝性狀的考查結(jié)果表明，除株系G2在劍葉長度上與C418存在顯著差異外，大多數(shù)聚合系的農(nóng)藝性狀基本回復到C418的形態(tài)，說明本研究分子標記輔助回交育種的效果較好。

3 討論

生產(chǎn)上，三系雜交粳稻一直以利用BT型不育細胞質(zhì)為主，細胞質(zhì)源單一；同時BT型粳稻不育系的花粉在三核期敗育，部分不育系的育性不穩(wěn)定，這些是制約雜交粳稻發(fā)展的因素之一。尋求可用于三系雜交粳稻育種的其他細胞質(zhì)源能有效克服BT型粳稻不育系存在的問題，促進三系雜交粳稻的發(fā)展。本課題組經(jīng)多年研究發(fā)現(xiàn)，利用HL型不育胞質(zhì)來發(fā)展三系雜交粳稻是可行的[5-8]。HL型粳稻不育系可以由BT型粳稻保持系轉(zhuǎn)育而成，選育過程較容易。由于HL型不育細胞質(zhì)主要應用于雜交秈稻中，已選育的恢復系均為秈型恢復系，而現(xiàn)有粳稻恢復系均為BT型恢復系，因而選育HL型粳稻恢復系是實現(xiàn)HL型雜交粳稻生產(chǎn)應用的關鍵。本課題組為實現(xiàn)HL型不育胞質(zhì)在三系雜交粳稻中的應用，利用HL型粳稻不育系與BT型粳稻恢復系進行測交，結(jié)果表明大多數(shù)BT型恢復系僅對HL型粳稻不育系表現(xiàn)出部分恢復的能力[8, 18]，無法應用于生產(chǎn)。因此，基于現(xiàn)有BT型粳稻恢復系來高效選育HL型粳稻恢復系對于實現(xiàn)HL型雜交粳稻生產(chǎn)利用具有十分重要的意義。

BT型粳稻恢復系利用的恢復基因首先是通過“秈粳架橋”技術從秈稻品種IR8中獲得，并育成了第一個恢復系C57；在“九五”期間，再次以此方法育成了粳稻恢復系C418[19, 20]。在生產(chǎn)上，全國大量的BT型粳型恢復系均是以C57、C418或其中間材料為親本培育的。據(jù)不完全估計，到20世紀末國內(nèi)應用的粳稻恢復系60%含有C57的血緣[21]，這造成了BT型粳稻恢復系的恢復基因源十分狹窄。已有遺傳分析及BT型育性恢復基因定位結(jié)果表明，BT型粳稻恢復系攜恢復基因(/)[9,10]，尚無其他恢復基因定位的報道，該結(jié)果也驗證了BT型粳稻恢復系的恢復基因比較單一。生產(chǎn)上，HL型秈稻不育系恢復譜廣，但強恢復系不多，遺傳分析發(fā)現(xiàn)大多恢復系只帶有1對主效恢復基因，并將其定位在第10染色體上，該基因與BT型恢復基因為同一基因[17-19]。盡管在秈稻核背景下，單個()就能夠使得HL型秈稻不育系育性恢復正常，但()對HL型粳稻不育系只具有部分恢復力，這也是大多數(shù)BT型粳稻恢復系對HL型粳稻不育系恢復度不高的原因[14, 18]。9311為HL型秈稻強恢復系，攜帶有2對恢復基因和，其配制的雜交秈稻組合花粉恢復度達75%，育性表現(xiàn)穩(wěn)定[14, 15]。為一個新的恢復基因，位于第8染色體上，在BT型粳稻恢復系中尚未見利用的報道。本研究利用分子標記輔助選擇技術，將與進行聚合，共獲得67個改良系。測交鑒定表明在現(xiàn)有BT型粳稻恢復系中導入能夠顯著提高對HL型粳稻不育系的恢復度，并且多數(shù)改良系對HL型粳稻不育系的恢復度達到BT型雜交粳稻可應用水平，這表明基于現(xiàn)有BT型粳稻恢復系進行與聚合育種是選育HL型粳稻恢復系的可行途徑。

傳統(tǒng)的恢復系選育及改良需通過大量測交和育性鑒定來篩選，工作量大。此外，小穗育性受環(huán)境因素影響較大，測交F1田間育性鑒定準確性會受到一定的干擾。通過分子標記技術輔助選擇，只對目標基因進行選擇，無需在每個回交世代進行恢復力鑒定，節(jié)省工作量，提高了育種效率。分子標記輔助選擇的準確性主要取決于目的基因與連鎖標記的緊密程度，所用的選擇標記與目的基因連鎖越緊密，輔助選擇的結(jié)果越準確可靠。本研究中所使用的標記RM407與基因緊密連鎖，從測交結(jié)果來看，分子標記輔助選擇獲得聚合的單株均能表現(xiàn)出對HL型粳稻不育系較強恢復力，選擇的準確度非常高。相關研究結(jié)果為今后分子標記輔助選擇改良粳稻恢復系的恢復力提供了借鑒。

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Improving the Ability of C418 to Restore the Fertility of the Honglian-type Cytoplasmic Male SterilityLines via Molecular Marker-assisted Selection

ZHANG Honggen, ZHONG Chongyuan, SI Hua, LIU Qiaoquan, GU Minghong, TANG Shuzhu*

(//,,,;*Corresponding author,:)

【Objective】Efficient breeding ofrestorers for Honglian(HL) typecytoplasmic male sterile(CMS) lines is vital to develop HL-typehybrids, which is of great significance for the development of three-linehybrids.【Method】, a fertility restorer gene for HL-type CMS, was identified from ‘9311’, anrestorer for HL-type CMS lines. In our previous study, R1093, a chromosome segment substitution line derived from the cross between the donor parent ‘9311’and the recipient parent ‘Nipponbare’, had been identified to carry. In the present study,was pyramided into C418, a BT-typerestorer only carrying, using backcross via marker-assisted selection, and the restoration ability of the improved lines for BT-, HL-type CMS lines was analyzed by testcrossing.【Result】To 2016, a total of 67 improved lines, including 12 BC3F4lines and 55 BC4F3lines, had been obtained, and most of the agronomic traits were well maintained in six improved lines. The testcrossed F1plants from improved lines and BT-Liuqianxin A exhibited the similar fertility levels with those of the testcrossed F1plants from C418. The significant increased fertility levels were observed on the testcrossed F1plants from improved lines and HL-Liuqianxin A, and most of these testcrossing lines exhibited fertility levels over 85%, indicating these improved lines can be applied to rice production.【Conclusions】The pyramiding ofandcan improve the restoration ability of BT-typerestorer lines to HL-typeCMS lines, which should be an important way to breed HL-typerestorer lines.

; Honglian-type; restorer line; marker-assisted selection

Q755; S511.0351

A

1001-7216(2018)05-0445-08

2017-12-24；

2018-03-01。

國家重點研發(fā)計劃資助項目 (2016YFD0101107); 國家自然科學基金資助項目(31771743); 江蘇高校優(yōu)勢學科建設工程項目。

10.16819/j.1001-7216.2018.7152