倍芪腹瀉貼微生物限度檢查方法的適用性試驗(yàn)

衛(wèi)延明，閔朕，陳子龍，杜思迪，秦亞紅

(陜西省渭南市食品藥品檢驗(yàn)所，陜西 渭南 714000)

倍芪腹瀉貼是一種含藥材原粉的中藥制劑，其主要成分為五倍子、黃芪、肉桂和木香，具有收澀斂肺、補(bǔ)氣健脾、益腎助陽(yáng)的功效，主要用于脾肺氣虛、脾腎陽(yáng)虛所致的腹瀉，自汗，盜汗及遺尿的輔助治療。倍芪腹瀉貼處方中黃芪的主要有效成分為黃芪多糖和黃芪皂苷，其中黃芪皂苷對(duì)金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、銅綠假單胞菌都有明顯的抑菌作用。本文按照《中國(guó)藥典》2015年版四部﹝通則1105和通則1106﹞的具體要求[1]，建立倍芪腹瀉貼的微生物限度檢查方法。

1 儀器與材料

1.1儀器MJ-Ⅱ型真菌培養(yǎng)箱(上海一恒科技有限公司)，SPX-150型生化培養(yǎng)箱(上海金慧科電子有限公司)，SPX-250B-Z型生化培養(yǎng)箱(上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠)，HTY-2000集菌儀(杭州高得醫(yī)療器械有限公司)。

1.2樣品及試劑倍芪腹瀉貼(陜西海普藥業(yè)有限公司生產(chǎn)，批號(hào)20160901，規(guī)格：每貼重1.5 g)；培養(yǎng)基：胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基、胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基、沙氏葡萄糖液體培養(yǎng)基、沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基、麥康凱液體培養(yǎng)基、麥康凱瓊脂培養(yǎng)基、pH7.0無(wú)菌氯化鈉蛋白胨緩沖液、蛋白胨；氯化鈉和吐溫80。沖洗液：0.1%無(wú)菌蛋白胨水溶液。

1.3試驗(yàn)菌種銅綠假單胞菌[CMCC(B)10104]；金黃色葡萄球菌[CMCC(B)26003]；枯草芽孢桿菌[CMCC(B)63501]；白色念珠菌[CMCC(F)98001]；黑曲霉[CMCC(F)98003]均由青島高科園海博生物技術(shù)有限公司提供。

菌液制備：分別取金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、銅綠假單胞菌的瓷珠1粒至10 mL的胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基中，35 ℃培養(yǎng)24 h。將金黃色葡萄球菌和銅綠假單胞菌的培養(yǎng)物用0.9%無(wú)菌氯化鈉溶液制備成適宜濃度的菌懸液；再將枯草芽孢桿菌的培養(yǎng)物接種至胰酪大豆胨瓊脂斜面培養(yǎng)基上，35 ℃培養(yǎng)7 d，然后加入5 mL 0.9%無(wú)菌氯化鈉溶液進(jìn)行適當(dāng)振搖，并于65 ℃水浴中加熱30 min，取該培養(yǎng)物1 mL,用0.9%無(wú)菌氯化鈉溶液制備成適宜濃度的菌懸液。

取白色念珠菌的瓷珠1粒至10 mL的沙氏葡萄糖液體培養(yǎng)基中，25 ℃培養(yǎng)48 h，用0.9%無(wú)菌氯化鈉溶液制備成適宜濃度的菌懸液；取黑曲霉的瓷珠1粒至10 mL的沙氏葡萄糖液體培養(yǎng)基中，25 ℃培養(yǎng)5 d。將上述黑曲霉培養(yǎng)物接種至沙氏葡萄糖瓊脂斜面培養(yǎng)基上，25 ℃培養(yǎng)7 d，再加入5 mL含0.05%吐溫80的0.9%無(wú)菌氯化鈉溶液進(jìn)行洗脫，吸取孢子懸液1 mL，用含0.05%吐溫80的0.9%無(wú)菌氯化鈉溶液制備成適宜濃度的菌懸液[2-7]。

1.4供試品溶液的制備取供試品6～7貼(10 g)，去掉防粘層，將粘貼面朝上放置在無(wú)菌玻璃器皿上，在粘貼面上覆蓋一層適宜的無(wú)菌紗布，并用滅過(guò)菌的剪刀將其剪成小塊狀，放入含5%吐溫80的pH7.0無(wú)菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液100 mL中，強(qiáng)力振蕩使其溶解[2]，然后用無(wú)菌紗布以無(wú)菌方式將其過(guò)濾到一個(gè)無(wú)菌玻璃容器中，制備成1∶10的供試液A；取1∶10供試液40 mL至上述稀釋液40 mL中，混勻，制備成1∶20供試液B；取1∶10供試液20 mL至上述稀釋液80 mL中，混勻，制備成1∶50供試液C；取1∶10供試液10 mL至上述稀釋液90 mL中，混勻，制備成1∶100供試液D。

2 方法

2.1計(jì)數(shù)方法適用性試驗(yàn)

2.1.1平皿法(1∶10、1∶20、1∶50、1∶100) 取相應(yīng)稀釋級(jí)別的供試液(A、B、C、D)9.9 mL和0.1 mL的試驗(yàn)菌液，混勻，取混合液1 mL置平皿中，立即傾注15～20 mL培養(yǎng)基，待凝固后置規(guī)定溫度培養(yǎng)，需氧菌培養(yǎng)3 d，真菌和酵母菌各培養(yǎng)5 d，記錄菌落數(shù)，作為試驗(yàn)組。其中，5種需氧菌(枯草芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、白色念珠菌、黑曲霉)和2種真菌和酵母菌(白色念珠菌、黑曲霉)共計(jì)7個(gè)試驗(yàn)組，每個(gè)試驗(yàn)組平行制備兩個(gè)平皿；同法測(cè)定相應(yīng)的試驗(yàn)菌菌落數(shù)，作為菌液組；測(cè)定供試品的本底菌落數(shù)，作為供試品對(duì)照組。按照公式計(jì)算回收比值：回收比值=(試驗(yàn)組平均菌落數(shù)-供試品對(duì)照組平均菌落數(shù))/菌液組平均菌落數(shù))，結(jié)果見(jiàn)表1。

2.1.2稀釋法(1∶100)+薄膜過(guò)濾法(方法1：300 mL,方法2：500 mL) 取1∶100 供試液10 mL，采用薄膜過(guò)濾法(在第1次沖洗液中加入供試液,在最后一次沖洗液中加入小于100 cfu的試驗(yàn)菌0.1 mL),用沖洗液(方法1：300 mL，方法2：500 mL)沖洗，每次100 mL,在最后一次沖洗液中加入小于100 cfu的試驗(yàn)菌，濾干，取出濾膜貼于培養(yǎng)基平板上，作為試驗(yàn)組并測(cè)定其菌落數(shù)；同法測(cè)定供試品本底菌落數(shù)，作為供試品對(duì)照組；菌液組同平皿法。最后按照平皿法公式計(jì)算回收比值，結(jié)果見(jiàn)表1。

2.2控制菌(銅綠假單胞菌、金黃色葡萄球菌)檢查方法適用性試驗(yàn)

2.2.1試驗(yàn)組 (1)常規(guī)法：取1∶10供試液10 mL和不大于100 cfu的試驗(yàn)菌接種至100 mL的胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基中，依據(jù)各試驗(yàn)菌檢查項(xiàng)下的方法進(jìn)行試驗(yàn)，結(jié)果見(jiàn)表2。(2)培養(yǎng)基稀釋法(200 mL、400 mL) 取1∶10供試液和不大于100cfu的試驗(yàn)菌分別接種至200 mL和400 mL的胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基中，依據(jù)各試驗(yàn)菌檢查項(xiàng)下的方法進(jìn)行試驗(yàn)，結(jié)果見(jiàn)表2。(3)薄膜過(guò)濾法(方法1：沖洗300 mL,方法2：沖洗500 mL)。取1∶20供試液20 mL，薄膜過(guò)濾，用沖洗液(方法1：300 mL,方法2：500 mL)沖洗，每次100 mL，在第一次沖洗液中加入供試液，在最后一次沖洗液中加入不大于100 cfu的試驗(yàn)菌，濾干，轉(zhuǎn)移濾膜至100 mL的胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基中，依據(jù)各試驗(yàn)菌檢查項(xiàng)下的方法進(jìn)行試驗(yàn)，結(jié)果見(jiàn)表2。

表1 微生物限度計(jì)數(shù)方法適用性試驗(yàn)回收比值結(jié)果

注：-表示未進(jìn)行試驗(yàn)；x代表需氧菌，m代表真菌和酵母菌

2.2.2陽(yáng)性對(duì)照組 取不大于100 cfu的試驗(yàn)菌依據(jù)各方法項(xiàng)下的試驗(yàn)組方法進(jìn)行試驗(yàn)，結(jié)果見(jiàn)表2。

2.2.3陰性對(duì)照組 取稀釋液替代供試液，依據(jù)各試驗(yàn)菌檢查項(xiàng)下的方法進(jìn)行試驗(yàn)，結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 控制菌檢查方法適用性試驗(yàn)結(jié)果

注：“﹢”代表檢出，“-”代表未檢出

3 結(jié)果

3.1計(jì)數(shù)方法試驗(yàn)結(jié)果由表1可見(jiàn)，倍芪腹瀉貼對(duì)三種細(xì)菌有很強(qiáng)的抑菌作用，平皿法和薄膜過(guò)濾法方法1都不適用于需氧菌總數(shù)的測(cè)定，應(yīng)采用稀釋法(1∶100)+薄膜過(guò)濾法(500毫升/膜)進(jìn)行需氧菌總數(shù)的測(cè)定；可采用平皿法(1∶10)進(jìn)行真菌和酵母菌總數(shù)的測(cè)定[8-9]。

3.2控制菌檢查方法試驗(yàn)結(jié)果常規(guī)法、培養(yǎng)基稀釋法(200 mL、400 mL)和薄膜過(guò)濾法方法1的試驗(yàn)組均未檢出試驗(yàn)菌(銅綠假單胞菌、金黃色葡萄球菌)，因此不可用于控制菌銅綠假單胞菌和金黃色葡萄球菌的檢查。薄膜過(guò)濾法2(1∶20，沖洗500 mL)的試驗(yàn)組均檢出試驗(yàn)菌(銅綠假單胞菌、金黃色葡萄球菌)，因此可用于控制菌銅綠假單胞菌和金黃色葡萄球菌的檢查。見(jiàn)表2。

4 討論

4.1供試液的制備問(wèn)題普通貼劑藥層薄，面積較大，而且藥層下面都粘連著一層塑料薄膜，不易進(jìn)行有效成分的重量稱量。因此藥典規(guī)定貼劑在進(jìn)行微生物限度檢查時(shí)，供試液的制備應(yīng)取100 cm2至100 mL的稀釋液中進(jìn)行振蕩溶解，而不是按照普通方法稱取10 g至100 mL的稀釋液中進(jìn)行制備。但倍芪腹瀉貼呈圓柱形，整體外觀厚而小，而且操作起來(lái)相當(dāng)不便，并且制備出來(lái)的溶液過(guò)于黏稠，根本無(wú)法吸取[10-11]。鑒于此，筆者在進(jìn)行方法適用性試驗(yàn)前，先對(duì)該貼劑的標(biāo)示規(guī)格進(jìn)行了復(fù)核，最終確定該藥的實(shí)際規(guī)格約為1.5 g，也就是說(shuō)制備1∶10的供試液，供試品的稱樣量為6～7貼，這大大降低了溶液的黏稠度，為試驗(yàn)的順利進(jìn)行打下了良好的基礎(chǔ)。

4.2枯草芽孢桿菌菌懸液的制備問(wèn)題枯草芽孢桿菌是需氧芽孢桿菌屬，芽孢是其賴以長(zhǎng)期存活的主要形式。藥典方法培養(yǎng)時(shí)間短，芽孢含量較少，菌懸液很不穩(wěn)定。因此，菌液計(jì)數(shù)與試驗(yàn)計(jì)數(shù)結(jié)果差別很大，這大大增加了實(shí)驗(yàn)室人員的工作量?？莶菅挎邨U菌的生活周期包括繁殖期、孢子囊期和芽孢期，要形成芽孢，一般需要在斜面上培養(yǎng)7 d左右。因此，筆者首先將枯草芽孢桿菌的培養(yǎng)物接種至胰酪大豆胨瓊脂斜面上培養(yǎng)7 d，然后用稀釋液沖下菌苔，并將其放入65 ℃水浴加熱30 min，這樣做的目的是使該菌體菌懸液徹底變成芽孢菌懸液，最后再進(jìn)行稀釋計(jì)數(shù)，而且枯草芽孢桿菌的芽孢菌懸液的氯化鈉稀釋液在2～8 ℃可保存3個(gè)月左右，這不僅減輕了工作量，也提高了工作效率，節(jié)約了成本[12-15]。

4.3薄膜過(guò)濾法中供試液的濃度選擇問(wèn)題

4.3.1計(jì)數(shù)試驗(yàn) 2015版藥典規(guī)定所加菌液的體積應(yīng)不超過(guò)供試液體積的1%，這主要是為了減小誤差，降低菌液體積對(duì)供試液的稀釋作用，從而提高檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確度。而我們一般使用的吸管的最小刻度為0.1 mL，也就是說(shuō)菌液的最小加入體積為0.1 mL，按1%的比例進(jìn)行換算，那么供試液的最少加入量應(yīng)為10 mL。因此，選擇低稀釋級(jí)的供試液進(jìn)行薄膜過(guò)濾顯然行不通(正式試驗(yàn)之前進(jìn)行了預(yù)試驗(yàn))，考慮到倍芪腹瀉貼的抑菌性又太強(qiáng)，綜合上述因素我們最終選擇1∶100的供試液進(jìn)行薄膜過(guò)濾。

4.3.2控制菌檢查試驗(yàn) 倍芪腹瀉貼1∶10的供試液由于黏稠度很大，直接取10 mL進(jìn)行控制菌檢查中的薄膜過(guò)濾，很難過(guò)濾下去，影響試驗(yàn)的順利進(jìn)行。按照過(guò)去的方法，應(yīng)該采用離心沉淀法去消除這個(gè)影響，但中國(guó)藥典2015版微生物限度檢查已不允許使用離心沉淀法制備供試液。因此，我們對(duì)供試液首先進(jìn)行了1∶20的稀釋，降低了供試液的黏稠度，然后進(jìn)行過(guò)濾，效果很好。另外，控制菌檢查中供試液的加入量是取相當(dāng)于1 g供試品的供試液量，所以1∶20供試液的過(guò)濾量應(yīng)該是20 mL，而不是10 mL[16-17]。

本研究在用薄膜過(guò)濾法進(jìn)行微生物限度的方法適用性試驗(yàn)中,由于藥品本身黏稠度過(guò)高,以1∶10的供試液直接進(jìn)行沖洗,出現(xiàn)堵膜現(xiàn)象,影響了試驗(yàn)的順利進(jìn)行。因此,針對(duì)供試液黏稠度過(guò)高的藥品,在進(jìn)行薄膜過(guò)濾法的沖洗試驗(yàn)中,應(yīng)首先對(duì)其進(jìn)行適度稀釋,然后再進(jìn)行沖洗試驗(yàn)。