瓊脂塊檢測(cè)篩選法在阿維菌素育種中的應(yīng)用研究

崔莉

摘要：現(xiàn)有技術(shù)中阿維菌素自然選育流程耗時(shí)長(zhǎng)、篩選效率低、設(shè)備及功能間的利用率低，因此，提供一種快速初篩方法對(duì)于阿維菌素的生產(chǎn)來說具有非常重要的意義。

Abstract： In the prior art， the natural selection process of Abamectin takes a long time， the screening efficiency is low， and the utilization ratio of equipment and function room is low. Therefore， it is very important to provide a rapid screening method for the production of Abamectin.

關(guān)鍵詞：瓊脂塊檢測(cè)篩選法；阿維菌素育種；高效育種

Key words： agar block detection and screening method；Abamectin breeding；efficient breeding

中圖分類號(hào)：Q933 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：1006-4311（2018）29-0244-02

1 研究依據(jù)

阿維菌素是由鏈霉菌中灰色阿佛曼鏈霉菌發(fā)酵產(chǎn)生，由一組十六元大環(huán)內(nèi)酯化合物組成，是高效、廣譜的抗生素類殺蟲劑。目前，阿維菌素自然選育流程如下：選擇出發(fā)株→制備分離平板培養(yǎng)基→制備單孢子懸浮液→涂布分離培養(yǎng)→挑單菌落接斜面→搖瓶初篩→初篩留種→接復(fù)篩斜面→搖瓶復(fù)篩→復(fù)篩留種→性狀考察→高產(chǎn)菌種復(fù)篩留種。

現(xiàn)行工藝操作繁瑣、周期偏長(zhǎng)，從單菌落培養(yǎng)到菌種性能的初篩檢測(cè)長(zhǎng)達(dá)35天左右，其缺陷為：流程繁瑣、選育周期長(zhǎng)、工作量大、需專用設(shè)備（恒溫振蕩器）、能耗大、成本高、篩選效率低。因此，在菌種選育“初篩以量為主、復(fù)篩以質(zhì)為主”的篩選原則下，提供一種快速初篩方法對(duì)于阿維菌素的生產(chǎn)來說具有非常重要的意義。

抑菌圈法又叫擴(kuò)散法，成本低廉、結(jié)果準(zhǔn)確可靠，操作便捷、簡(jiǎn)單易行，是抗生素產(chǎn)生菌初篩快速有效分離的篩選方法。其方法是，將待檢測(cè)菌種的單菌落瓊脂塊移至含有試驗(yàn)菌的瓊脂塊培養(yǎng)基上，在適宜溫濕度下培養(yǎng)一段時(shí)間后取出，用游標(biāo)卡尺來測(cè)定各抑菌圈的直徑，直徑大小反映了瓊脂塊產(chǎn)抗生素能力的大小，以此判斷擇優(yōu)選取。由于阿維菌素沒有抑菌活性，其自身不能分泌抑制試驗(yàn)菌生長(zhǎng)的物質(zhì)或分泌某種對(duì)試驗(yàn)菌有毒的物質(zhì)，當(dāng)其轉(zhuǎn)入含試驗(yàn)菌的培養(yǎng)基上就會(huì)被試驗(yàn)菌所抑制甚至殺滅，所以阿維菌素菌選過程中效價(jià)的檢測(cè)不能采用抑菌圈法。

2 研究目的

本項(xiàng)目以縮短阿維菌素選育周期、提高篩選效率、節(jié)約篩選成本為研究目標(biāo)，建立新的菌選方法、提高篩選效率。

3 研究?jī)?nèi)容

本項(xiàng)目采用瓊脂塊培養(yǎng)初篩法，過程為：生產(chǎn)菌種斜面培養(yǎng)，制備單孢子懸浮液，涂布分離培養(yǎng)出單菌落，挑取單菌點(diǎn)種于固體培養(yǎng)基平板上，HPLC法檢測(cè)產(chǎn)素能力，挑取高產(chǎn)株搖瓶復(fù)篩，留種保藏。

4 研究方法

4.1 儀器與材料

①儀器：漩渦混合器、臺(tái)式低速離心機(jī)、安捷倫高效液相色譜儀。

②材料：出發(fā)菌株（生產(chǎn)菌株阿佛曼鏈霉菌Streptomyces avermitilis），分離（斜面）培養(yǎng)基、點(diǎn)種培養(yǎng)基、種子搖瓶培養(yǎng)基、發(fā)酵搖瓶培養(yǎng)基；丙酮（分析純）、甲醇（分析純）、無水甲醇（色譜純），有機(jī)濾膜。

4.2 培養(yǎng)基

4.2.1 分離（斜面）培養(yǎng)基（g/L）：

可溶性淀粉10、（NH4）2SO4 2.5、NaCl 0.6、MgSO4·7H2O 1.2、K2HPO4·3H2O 3.0、CaCO3 3.0、瓊脂粉20；pH7.2～7.4，用蒸餾水配制，121℃滅菌30min。

4.2.2 點(diǎn)種培養(yǎng)基（g/L）：

1#——可溶性淀粉10、（NH4）2SO4 2.5、NaCl 0.6、MgSO4·7H2O 1.2、K2HPO4·3H2O 3.0、CaCO3 3.0、瓊脂粉20、pH7.2～7.4，用蒸餾水配制，121℃滅菌30min。

2#——玉米淀粉70、黃豆餅粉8.0、花生餅粉10、酵母粉5.0、酵母膏4.0、CaCO3 3.0、COCl2·6H2O 0.003、淀粉酶0.0025、瓊脂粉20；pH7.0～7.2，用蒸餾水配制，121℃滅菌30min。

3#——玉米淀粉70、黃豆餅粉8.0、花生餅粉10、酵母粉5.0、酵母膏3.0、玉米漿2.2、COCl2·6H2O 0.003、淀粉酶0.0025、瓊脂粉20；pH7.0～7.2，用蒸餾水配制，121℃滅菌30min。

4#——玉米淀粉25、黃豆餅粉8.0、花生餅粉10、酵母粉5.0、酵母膏5.0、玉米漿4.0、COCl2·6H2O 0.003、淀粉酶0.0025、瓊脂粉20；pH7.0～7.2，用蒸餾水配制，121℃滅菌30min。

4.2.3 搖瓶種子培養(yǎng)基（g/L）：

玉米淀粉25、黃豆餅粉8.0、花生餅粉10、酵母粉5.0、酵母膏5.0、玉米漿4.0、COCl2·6H2O 0.003、淀粉酶0.0025、pH7.0～7.2，用自來水配制，121℃滅菌30min。

4.2.4 搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)基（g/L）：

玉米淀粉70、黃豆餅粉8.0、花生餅粉10、酵母粉5.0、酵母膏3.0、玉米漿2.2、COCl2·6H2O 0.003、淀粉酶0.0025、pH7.0～7.2，用自來水配制，121℃滅菌30min。

4.3 方法

4.3.1 培養(yǎng)方法

①分離平皿的制備：挑選生長(zhǎng)飽滿的工作細(xì)胞庫(kù)斜面，加入15ml無菌水，用接種環(huán)刮取孢子，將其懸浮在無菌水中制成混合均勻的孢子懸浮液。用無菌濾紙過濾收集孢子液，并進(jìn)行10-1～10-6梯度稀釋，取10-5、10-6稀釋液0.1～0.15ml注入于分離培養(yǎng)基上，用三角耙耙勻，倒置于恒溫室28±1℃培養(yǎng)7～9天。

②點(diǎn)種平皿的制備：取培養(yǎng)至第5～7天的上述分離平板，用肉眼篩出飽滿、均勻、分泌孢子量大、形態(tài)規(guī)整以及經(jīng)驗(yàn)型產(chǎn)抗能力差的單菌落，在背面標(biāo)記序號(hào)；并在點(diǎn)種培養(yǎng)基背面標(biāo)記相應(yīng)的序號(hào)（1個(gè)分離單菌落對(duì)應(yīng)2個(gè)點(diǎn)種菌落序號(hào)；分別用3-1、3-2標(biāo)示），用無菌牙簽輕輕點(diǎn)種于相應(yīng)序號(hào)位置標(biāo)記處的點(diǎn)種培養(yǎng)基上，點(diǎn)種培養(yǎng)平皿倒置于恒溫室28±1℃培養(yǎng)10～12天；分離平皿倒置于恒溫室28±1℃繼續(xù)培養(yǎng)2天左右，觀察菌落的生長(zhǎng)變化。

③斜面制備：用點(diǎn)種肉眼篩選方法選取優(yōu)質(zhì)單菌落和點(diǎn)種后帶序號(hào)的單菌落，用接種環(huán)挑取單菌落接種于斜面培養(yǎng)基上，倒置于恒溫室28±1℃培養(yǎng)7～9天。

④種子搖瓶：將培養(yǎng)好的斜面菌種用接種鏟鏟取1.0cm*1.0cm接種于種子搖瓶培養(yǎng)基中，28±1℃、220r/min振蕩培養(yǎng)25～30hr，觀察其菌絲生長(zhǎng)情況。

⑤發(fā)酵搖瓶：將培養(yǎng)成熟的種子液按10%的接種量轉(zhuǎn)接于發(fā)酵搖瓶中，28±1℃、220r/min振蕩培養(yǎng)10天。

4.3.2 初篩

①液體搖瓶復(fù)篩：

取4.3.1⑤培養(yǎng)好的發(fā)酵液10ml于離心管中，3000r/min離心10min，棄去上清液。加入丙酮10ml，在漩渦混合器上振蕩提取5min，靜置10min，再經(jīng)3000r/min離心10min得萃取液，經(jīng)0.45u有機(jī)濾膜過濾，準(zhǔn)確吸取5.0ul樣品濾液進(jìn)樣，利用自動(dòng)高效液相色譜儀檢測(cè)菌株的生產(chǎn)能力。

②瓊脂塊培養(yǎng)初篩：

分別將兩塊4.3.1②培養(yǎng)好的、同序號(hào)點(diǎn)種單菌落鏟下置于同一離心管中，加10ml分析純甲醇，在漩渦混合器上充分振蕩3min提取，4000r/min離心10min、靜置10min后，經(jīng)0.45u有機(jī)濾膜過濾，準(zhǔn)確吸取5.0ul樣品濾液進(jìn)樣，利用自動(dòng)高效液相色譜儀檢測(cè)菌株的生產(chǎn)能力。

5 研究結(jié)果與分析

5.1 結(jié)果

5.1.1 點(diǎn)種培養(yǎng)基優(yōu)化試驗(yàn)結(jié)果：點(diǎn)種培養(yǎng)基設(shè)計(jì)見4.2.2。點(diǎn)種菌落生長(zhǎng)情況如下：1#培養(yǎng)基：菌落呈饅頭型、山丘型，孢子分泌量少；2#培養(yǎng)基：菌落呈草帽型、類草帽型，孢子分泌量多；3#培養(yǎng)基：菌落呈十字型、光禿型，孢子幾乎無分泌；4#培養(yǎng)基：菌落呈光禿型、饅頭型，孢子分泌量無或很少。

5.1.2 搖瓶初篩、瓊脂塊初篩及復(fù)篩HPLC檢測(cè)結(jié)果對(duì)照（表1）

5.1.3 常規(guī)搖瓶初篩流程與改進(jìn)瓊脂塊培養(yǎng)初篩流程選育周期對(duì)比：搖瓶初篩流程選育周期為26～31天；瓊脂塊培養(yǎng)初篩流程為11～13天，相對(duì)比縮短培育期15～18天。

5.2 分析

通過4批共30株菌株的點(diǎn)種試驗(yàn)，得到單菌落的表型分布有6種，分別是：草帽型、類草帽型、饅頭型、十字型、光禿型、山丘型；結(jié)合表1與搖瓶復(fù)篩試驗(yàn)結(jié)果可得知：這6種形態(tài)的菌落其產(chǎn)抗能力依次為：草帽型、類草帽型、饅頭型、山丘型、十字型、光禿型；從表1：搖瓶初篩與瓊脂塊培養(yǎng)初篩HPLC檢測(cè)結(jié)果對(duì)照表來看，搖瓶復(fù)篩效價(jià)高的菌株其瓊脂塊培養(yǎng)初篩效價(jià)亦表現(xiàn)高；從表1：高產(chǎn)菌株復(fù)篩考察來看，點(diǎn)種后培養(yǎng)成熟的單菌落傳斜面，經(jīng)搖瓶考察產(chǎn)抗能力良好的菌株，其經(jīng)菌種保藏后再次復(fù)篩驗(yàn)證，其仍能保持良好的初篩性能；從搖瓶初篩流程與瓊脂塊初篩流程選育周期對(duì)比來看，瓊脂塊培養(yǎng)初篩選育新工藝可縮短15～18天；提高篩選效率、節(jié)約篩選成本。

6 研究結(jié)論

①瓊脂塊初篩選育新工藝可較傳統(tǒng)搖瓶初篩選育周期縮短近半個(gè)月，提高篩選效率、節(jié)約篩選成本。②瓊脂塊初篩選育新工藝得到的菌株性能與相應(yīng)的增殖斜面得到的驗(yàn)證結(jié)果能有效對(duì)應(yīng)。③瓊脂塊初篩選育法篩出的的優(yōu)良菌株，復(fù)篩性能穩(wěn)定。

參考文獻(xiàn)：

[1]陳紅霞.阿維菌素生物合成基因改造的研究[D].沈陽(yáng)藥科大學(xué)，2002.

[2]李燕霞，喬建軍.阿維菌素B1a組分高產(chǎn)菌株的定向選育[J].工業(yè)微生物，2008（01）.

[3]陳芝，溫嘉，宋淵，文瑩，李季倫.阿維鏈霉菌種內(nèi)原生質(zhì)體融合選育僅產(chǎn)阿維菌素B的高產(chǎn)菌株[J].科學(xué)通報(bào)，2007（03）.