不同產(chǎn)地黃芪多糖降血糖活性的比較研究

運(yùn)立媛，張民，朱振元

（天津科技大學(xué)食品工程與生物技術(shù)學(xué)院，天津300457）

糖尿病是最嚴(yán)重的疾病之一，它對(duì)健康，生活質(zhì)量，人的壽命以及現(xiàn)代醫(yī)療保健系統(tǒng)都有重大影響[1]。因此，尋找安全有效的治劑成為人們的研究熱點(diǎn)。越來(lái)越多的研究者從植物中提取出具有降血糖的活性成分來(lái)治療糖尿病。

黃芪，是一種多年生草本植物，廣泛分布于世界各地的溫帶地區(qū)，是一種多年生植物[2]。黃芪的干根，在神農(nóng)本草經(jīng)中被記載，是中國(guó)2000多年來(lái)最流行的對(duì)人體健康有益的中草藥之一[3]?，F(xiàn)代植物化學(xué)和藥理試驗(yàn)證明，多糖是黃芪根的主要活性成分之一，具有多種重要的生物活性，例如造血功能、神經(jīng)保護(hù)[4]、抗氧化劑[5-6]、保護(hù)內(nèi)皮細(xì)胞[7]、免疫調(diào)節(jié)[8]、抗肝炎病毒[9]、降血糖等活性[10]。有報(bào)道指出黃芪多糖對(duì)糖尿病小鼠有顯著的低血糖作用[11]。由于自然環(huán)境的不同，因此導(dǎo)致黃芪的品質(zhì)不同。本研究旨在探討不同地區(qū)黃芪多糖的活性的差異，為黃芪在降血糖活性的應(yīng)用上提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

黃芪（Astragalus membranaceus）根：來(lái)源于山西、甘肅、四川、貴州、新疆、內(nèi)蒙古、大興安嶺，經(jīng)鑒定均為膜莢黃芪。木糖、半乳糖、甘露糖、葡萄糖、阿拉伯糖、鼠李糖、葡聚糖-2000、葡聚糖-500、葡聚糖-110、葡聚糖-70、葡聚糖-40、葡聚糖-10、α-葡萄糖苷酶（125 U/mg）、阿卡波糖：美國(guó) Sigma公司；對(duì)硝基苯-α-D-葡萄糖苷（p-Nitrophenyl-α-D-glucopyranoside，pNPG）、鏈脲佐菌素（streptozocin，STZ）：國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑北京有限公司；無(wú)水乙醇、三氯甲烷、正丁醇、苯酚、硫酸、三氟乙酸、醋酸酐均為分析純；小鼠維持飼料：斯貝福北京生物技術(shù)有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

電熱恒溫水浴鍋（HWS26）：上海一恒科技有限公司；冷凍干燥機(jī)（Modulyod-230）：美國(guó) Thermo公司；高效液相色譜儀（LC-20AT）、示差折光檢測(cè)器（RID-20AT）、凝膠色譜柱（SB-805HQ）：日本島津公司；血糖監(jiān)測(cè)儀（EZ III）：Acon生物技術(shù)有限公司。

1.3 多糖的提取

將清洗后的黃芪根置于50℃烘箱，烘干24 h，粉碎，過(guò)60目篩，備用。稱(chēng)取50 g樣品無(wú)水乙醇回流脫脂[12]，向脫脂后樣品中加入10倍體積的蒸餾水，于80℃下提取2 h，共提取3次，合并提取液，60℃下對(duì)濾液濃縮，濃縮至300 mL，向濃縮液中加入4倍體積的95%乙醇進(jìn)行沉淀，于4℃條下沉淀15 h，Sevage試劑（三氯甲烷 ∶正丁醇=4∶1，體積比）除蛋白[13]，溶液真空濃縮，冷凍干燥[14]，得粗多糖。多糖得率計(jì)算公式為：

式中：m1為黃芪多糖質(zhì)量，g；m2為黃芪質(zhì)量，g。

通過(guò)苯酚硫酸法對(duì)樣品中的中性糖含量進(jìn)行測(cè)定，以葡萄糖為標(biāo)準(zhǔn)品[15]；通過(guò)二硝基水楊酸法（3，5-Dinitrosalicylic acid，DNS）法對(duì)還原糖含量進(jìn)行測(cè)定[16]。

1.4 黃芪多糖單糖組成分析

向5 mg黃芪多糖樣品中，加入1 mL 2 mol/L三氟乙酸（trifluoroacetic acid，TFA），于110℃反應(yīng)3 h。冷卻后用N2吹干殘余的TFA，加少量甲醇，用N2吹干，反復(fù)3次以除盡TFA。向酸降解產(chǎn)物中加入10 mg鹽酸羥胺，2 mg肌醇六乙酸乙酯，0.5 mL吡啶，混合均勻后密封，于90℃反應(yīng)30 min。反應(yīng)30 min后冷卻至室溫，向反應(yīng)管中加入0.5 mL醋酸酐，于90℃繼續(xù)反應(yīng)30 min。生成糖腈乙酸酯衍生物，將衍生物通過(guò)N2吹干后，加入1 mL二氯甲烷重新溶解，通過(guò)0.22 μm濾膜進(jìn)行過(guò)濾。取1 μL進(jìn)行氣相色譜分析[17]。以單糖（葡萄糖，半乳糖，鼠李糖，木糖，甘露糖，阿拉伯糖）衍生化的產(chǎn)物作為對(duì)照。根據(jù)各峰的峰面積計(jì)算摩爾比。

1.5 黃芪多糖分子量的測(cè)定

通過(guò)SB-805HQ凝膠色譜柱結(jié)合示差檢測(cè)器對(duì)黃芪多糖進(jìn)行高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）分析。蒸餾水配制濃度為5mg/mL的多糖溶液，0.22 μm 濾膜過(guò)濾，進(jìn)樣量為 20 μL，流速為0.6 mL/min，超純水作流動(dòng)相。以T-系列葡聚糖（T-10、T-40、T-70、T-500、T-2000）為標(biāo)準(zhǔn)品，以保留時(shí)間為橫坐標(biāo)，分子量的對(duì)數(shù)值為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線[18]，通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算多糖各組分的分子質(zhì)量。

1.6 α-葡萄糖苷酶抑制活力測(cè)定

腸道內(nèi)的葡萄糖產(chǎn)生可以通過(guò)α-葡糖苷酶抑制劑進(jìn)行抑制，從而降低餐后血糖的升高[18]。阿卡波糖等α-葡糖苷酶抑制劑是常見(jiàn)且有效的治療Ⅱ-型糖尿病的臨床治療藥物。

試驗(yàn)分為抑制劑組與對(duì)照組[19-20]。抑制劑分別為不同產(chǎn)地的黃芪多糖及阿卡波糖。向抑制劑組分別加入400 μL抑制劑及400 μLα-糖苷酶（1U）。抑制劑對(duì)照組分別加入400 μL抑制劑及400 μL磷酸鹽緩沖液（pH 7.0）；空白組分別加入400 μL磷酸鹽緩沖液及400 μL α-糖苷酶（1U），空白對(duì)照組中加入 800 μL 磷酸鹽緩沖液（pH7.0），于37℃反應(yīng)20 min。之后向每組中加入100μLpNPG（100mmol/L）于37℃反應(yīng)40min。最后以1.5 mL NaOH溶液（1.0 mol/mL）以停止反應(yīng)的進(jìn)行，于410 nm處測(cè)各組的吸光度值。抑制率計(jì)算公式為：

式中：A1為抑制劑組吸光度值；A2為抑制劑對(duì)照組吸光度值；A3為空白組吸光度值；A4為空白對(duì)照組吸光度值。

1.7 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)

雄性昆明小鼠[（20±2）g，證書(shū)號(hào)：SXCK（津）2014-0008）]由中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院中心（北京）提供。飼養(yǎng)溫度保持在（22±2）℃，環(huán)境濕度（55±10）%，自由飲水，攝取維持飼料。

1.7.1 Ⅱ型糖尿病小鼠模型的建立

小鼠在培養(yǎng)環(huán)境中適應(yīng)6天后，除空白組，其他小鼠于腹腔內(nèi)注射160 mg/kg·BW的新鮮制備的pH4.5的鏈脲佐菌素（STZ）溶液。注射鏈脲佐菌素72 h后，通過(guò)血糖監(jiān)測(cè)儀進(jìn)行測(cè)試，當(dāng)血糖水平超過(guò)11.1 mmol/L時(shí)，被認(rèn)為是造模成功的Ⅱ型糖尿病小鼠，可用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.7.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的分組

將STZ誘導(dǎo)小鼠隨機(jī)分成9組，每組10只。分別為空白組（NC），模型組（DC），阿卡波糖陽(yáng)性對(duì)照組（PC），山西黃芪多糖組（SX），甘肅黃芪多糖組（GS），四川黃芪多糖組（SC），貴州黃芪多糖組（GZ），新疆黃芪多糖組（XJ），內(nèi)蒙古黃芪多糖組（NMG），大興安嶺黃芪多糖組（DXAL）。多糖灌胃劑量為120 mg/kg·BW。

所有的小鼠都采用灌胃的方式給藥，連續(xù)灌胃4周。在整個(gè)過(guò)程中，小鼠以維持飼料喂養(yǎng)。每周通過(guò)血糖儀測(cè)定空腹血糖（fasting blood glucose，F(xiàn)BG）值。

1.7.3 口服糖耐量的測(cè)定

糖耐量是指人體對(duì)攝入的葡萄糖具有很大耐受能力的現(xiàn)象。在實(shí)驗(yàn)最后一天前12小時(shí)禁食。尾靜脈采血測(cè)血糖值，對(duì)小鼠灌胃40%葡萄糖溶液，灌胃劑量為2.5 g/kg·BW。灌胃后測(cè)0、30和120 min的血糖值并計(jì)算血糖曲線下面積（area under curve，AUC）。

曲線下面積（AUC）=0.5×空腹血糖值+30 min血糖值+1.5×60 min血糖值+120 min血糖值

1.8 數(shù)據(jù)處理

2 結(jié)果與分析

2.1 不同產(chǎn)地黃芪粗多糖得率及含量分析

通過(guò)熱水提取、Sevage除蛋白、乙醇醇沉、冷凍干燥后得黃芪粗多糖。通過(guò)苯酚硫酸法對(duì)不同產(chǎn)地黃芪多糖的含量進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果如表1。

表1 不同產(chǎn)地黃芪多糖的得率及糖含量分析Table 1 The analysis on the yield and sugar content of Astragalus polysaccharide from different regions %

多糖含量由高到低分別為：四川＞貴州＞甘肅＞內(nèi)蒙古＞山西＞新疆＞大興安嶺。多糖得率如表1所示，得率由高到低分別為：山西＞新疆＞大興安嶺＞甘肅＞內(nèi)蒙古＞貴州＞四川。由結(jié)果可以看出，不同產(chǎn)地黃芪多糖得率與含量存在著顯著的差異。

2.2 不同產(chǎn)地黃芪多糖單糖組成及分子量分析

多糖結(jié)構(gòu)和物理化學(xué)性質(zhì)是影響多糖生物活性的主要因素。單糖組成和分子量在多糖的活性中起著關(guān)鍵的作用。不同產(chǎn)地黃芪多糖的單糖組成及分子量分析如表2所示。

表2 不同產(chǎn)地黃芪多糖單糖組成及分子量分析Table 2 Molecular weight distribution and monosaccharide composition of crude Astragalus polysaccharide

試驗(yàn)結(jié)果表明，不同區(qū)域的多糖具有不同的摩爾比，且內(nèi)蒙古、大興安嶺的黃芪多糖主要含有木糖。通過(guò)HPLC法對(duì)不同產(chǎn)地黃芪多糖的分子量進(jìn)行分析。通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出多糖的平均相對(duì)分子質(zhì)量，結(jié)果如表2所示。由結(jié)果可以看出，不同產(chǎn)地黃芪多糖的相對(duì)分子質(zhì)量存在的差異，且各產(chǎn)地的黃芪多糖均含有兩個(gè)組分。

2.3 α-葡萄糖苷酶抑制活性

阿卡波糖與不同產(chǎn)地黃芪多糖的葡萄糖苷酶抑制活性如圖1所示。

由圖1可以看出葡萄糖苷酶的抑制活性與多糖濃度呈量效關(guān)系，且內(nèi)蒙古和大興安嶺的黃芪多糖均表現(xiàn)出明顯的抑制活性。這可能是由于相對(duì)分子質(zhì)量和單糖成分的差異造成的。

圖1 不同產(chǎn)地黃芪多糖的α-葡糖苷酶抑制活性Fig.1 α-glucosidase inhibition activity of crude Astragalus polysaccharides in different regions.

2.4 體內(nèi)降血糖實(shí)驗(yàn)

2.4.1 不同產(chǎn)地黃芪多糖對(duì)小鼠體重及臟器指數(shù)的影響

體重的減少是糖尿病的常見(jiàn)特征[21]。傳統(tǒng)上的Ⅱ型糖尿病治療與體重相關(guān)。在此研究中，每周對(duì)9組糖尿病小鼠進(jìn)行體重的測(cè)定，結(jié)果如表3所示。

表3 不同產(chǎn)地黃芪多糖對(duì)Ⅱ型糖尿病小鼠的體重及臟器指數(shù)的影響Table 3 The effect of Astragalus polysaccharide from different regions on the weight and organ index of typeⅡdiabetes mellitus mice

經(jīng)過(guò)4周的治療，所有的糖尿病小鼠體重都有所增加。然而，模型組糖尿病小鼠的體重仍然顯著低于正常小鼠（p＜0.01），肝臟，胰腺，胸腺和脾臟的重量明顯降低（p＜0.01）。黃芪多糖組中小鼠體重的增加和器官指數(shù)的增加意味著黃芪多糖可有效地緩解Ⅱ型糖尿病。與模型組相比內(nèi)蒙古黃芪多糖藥物組與黃芪多糖藥物組臟器指數(shù)增加的更顯著（p＜0.01）。

2.4.2 不同產(chǎn)地黃芪多糖對(duì)空腹血糖水平的影響

不同產(chǎn)地黃芪多糖對(duì)糖尿病小鼠血糖水平的影響見(jiàn)圖2。

由圖2可以看出，經(jīng)STZ注射后，與正常組相比，模型組空腹血糖顯著升高（p＜0.01），說(shuō)明鏈脲佐菌素可造成小鼠胰島損傷，導(dǎo)致胰島素分泌不足。與模型組相比，黃芪多糖組中小鼠的空腹血糖均有所降低，且在第四周后，內(nèi)蒙古與大興安嶺多糖組小鼠血糖值分別顯著降低47.83%與49.49%。

2.4.3 不同產(chǎn)地黃芪多糖對(duì)糖尿病小鼠糖耐量的影響

不同產(chǎn)地黃芪多糖對(duì)糖尿病小鼠糖耐量的影響見(jiàn)圖3。

口服葡萄糖耐量實(shí)驗(yàn)如圖3a所示，所有實(shí)驗(yàn)組小鼠的血糖水平在30 min時(shí)達(dá)到峰值，120 min后，血糖值有均呈下降趨勢(shì)，且正常組小鼠血糖值逐漸恢復(fù)到正常水平。如圖3b，根據(jù)曲線下面積（AUC）可以看出，與正常組相比，模型組的曲線下面積顯著升高（p＜0.01），與模型組相比，黃芪多糖實(shí)驗(yàn)組中，各組的曲線下面積均有所降低，且內(nèi)蒙古黃芪多糖組和大興安嶺黃芪多糖組小鼠葡萄糖耐量顯著降低（p＜0.01）。

圖2 不同產(chǎn)地黃芪多糖對(duì)糖尿病小鼠血糖水平的影響Fig.2 Effect of APS from different regions on fasting blood glucose levels in diabetic mice

圖3 不同產(chǎn)地黃芪多糖對(duì)糖尿病小鼠糖耐量的影響Fig.3 Effects of APS from different regions on glucose tolerance in the diabetic mice

3 結(jié)論

由試驗(yàn)結(jié)果可知，不同產(chǎn)地的黃芪多糖在分子質(zhì)量，單糖組成，單糖摩爾比上存在著差異，且內(nèi)蒙古與大興安嶺黃芪多糖主要由木糖組成。α-葡萄糖苷酶抑制活性與體內(nèi)降血糖活性表明，不同產(chǎn)地的黃芪多糖均有降血糖效果，且內(nèi)蒙古和大興安嶺的黃芪多糖降血糖活性最顯著。