Halogranum amylolyticum TNN58全基因組測序及PHBV代謝途徑分析

趙有璽， 薛燕芬， 馬延和， 饒志明

（1.江南大學(xué) 工業(yè)生物技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 無錫214036；2.北京聯(lián)合大學(xué) 生物化學(xué)工程學(xué)院，北京100023；3.中國科學(xué)院 微生物研究所，北京 100101）

Polyhydroxyalkanoates （PHAs）是一類由多種羥基脂肪酸單體組成的生物聚合物。通常是在碳源過剩時，細(xì)菌或極端嗜鹽古菌合成PHAs作為一種碳源和能源的儲備物質(zhì)[1-2]。PHAs具有良好的生物可降解性、生物相容性和可再生性，可作為傳統(tǒng)化石來源的塑料的替代物，近年來引起科學(xué)家的高度關(guān)注[3-7]。PHAs的特性由許多參數(shù)決定，如單體的種類、含量、單體在鏈上的分布、聚合物的相對分子質(zhì)量及其分布等[8]。目前，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)超過150多種單體結(jié)構(gòu)和特性不同的PHAs。在這些PHAs中，poly-3-hydro-xybutyrate（PHB）和 poly（3-hydroxybutyrateco-3-hydroxyvalerate） （PHBV）受到廣泛的關(guān)注[9]。PHB具有較高的結(jié)晶度，這導(dǎo)致了其具有硬度高和脆的特性，同時由于它的熔點(diǎn)高達(dá)170℃，且在180℃時就會裂解，使得PHB的處理加工困難，這限制了它的應(yīng)用[10]。3-羥基戊酸（3-hydroxyvalerate，3HV）單體的摻入使PHBV的結(jié)晶結(jié)構(gòu)明顯改變，帶來硬度下降、強(qiáng)度下降、熔點(diǎn)下降，但分解溫度卻沒有下降，而且隨著3HV的加入，結(jié)晶的晶體規(guī)整性下降且呈現(xiàn)不同的結(jié)晶形態(tài)，這對PHBV性能都有改進(jìn)作用。因此，PHBV具有更加廣闊的應(yīng)用前景[11]。目前，PHBV在組織工程領(lǐng)域得到了廣泛的應(yīng)用。研究發(fā)現(xiàn)，PHBV材料學(xué)性能與其單體3HV含量密切相關(guān)[12]。

大多數(shù)的細(xì)菌需要在培養(yǎng)基中添加3HV的前體來合成PHBV，這極大地增加了PHBV的成本[13]。研究發(fā)現(xiàn)，大部分極端嗜鹽古菌能夠利用非相關(guān)碳源合成PHBV，這引起了科學(xué)家的關(guān)注[14-15]。我們最近的研究表明，Halogranum amylolyticumTNN58可以利用葡萄糖積累3HV摩爾分?jǐn)?shù)高達(dá)20%的PHBV。目前，這是利用非相關(guān)碳源和非基因工程改造菌株合成PHBV材料中3HV摩爾分?jǐn)?shù)最高的[16]。這使得H.amylolyticumTNN58具有極高的研究價值和一定的工業(yè)應(yīng)用前景。H.amylolyticumTNN58合成PHBV材料高3HV摩爾分?jǐn)?shù)的機(jī)制引起了我們的關(guān)注和興趣。

在本研究中，我們對H.amylolyticumTNN58的基因組進(jìn)行了測序，進(jìn)一步分析了PHBV的代謝途徑，為揭示H.amylolyticumTNN58合成PHBV材料高3HV摩爾分?jǐn)?shù)的機(jī)制奠定了一定的基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 菌株

H.amylolyticumTNN58：作者所在實(shí)驗(yàn)室保存。

1.2 基因組測序

基因組測序由作者所在實(shí)驗(yàn)室委托北京百邁克生物科技有限公司完成?；蚪M測序采用全基因組鳥槍法測序策略和Illumina公司提供的標(biāo)準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)操作方案進(jìn)行測序。測序數(shù)據(jù)使用Velvet進(jìn)行組裝。

1.3 基因組注釋

采用Glimmer軟件采用內(nèi)插馬爾可夫模型來識別基因組中的編碼基因，對基因組進(jìn)行基因預(yù)測。將預(yù)測得到的基因序列與COG、KEGG、GO、Swiss-Prot、Nr功能數(shù)據(jù)庫進(jìn)行Blast比對，進(jìn)行基因注釋。使用TRF采用從頭預(yù)測的原理進(jìn)行重復(fù)序列的預(yù)測。

1.4 PHBV前體供應(yīng)途徑的分析

根據(jù)已經(jīng)報道的H.mediterrane中存在4條3-HV供應(yīng)途徑，通過在H.amylolyticumTNN58已經(jīng)注釋的基因中檢索相關(guān)途徑的酶是否存在來預(yù)測H.amylolyticumTNN58是否存在相關(guān)代謝途徑。

1.5 PHBV降解分析

以PHA降解酶氨基酸序列為參考對象對H.amylolyticumTNN58的全基因組序列進(jìn)行本地BlastP比對分析。

1.6 乙醛酸循環(huán)和甲基天冬氨酸循環(huán)

通過在H.amylolyticumTNN58已經(jīng)注釋的基因中檢索乙醛酸和甲基天冬氨酸循環(huán)的酶是否存在，來預(yù)測H.amylolyticumTNN58是否可能存在相關(guān)代謝途徑。

2 結(jié)果與分析

2.1 基因組測序

采用全基因組鳥槍法測序策略和Illumina公司提供的標(biāo)準(zhǔn)protocol進(jìn)行測序。使用樣品的基因組DNA分別構(gòu)建 600 bp、3 kb共 2個文庫，在Illumina Hiseq2500測序平臺測序得到的875 Mb原始數(shù)據(jù)，總測序深度約為218X。拼接組裝后，TNN58共得到125個重疊群，總計大小為4.68 Mb；32個支架序列，總計大小為4.73 Mb，N50長度為820 653 bp。 17-mer總數(shù)為 518、108、634，平均固定短串深度即主峰對應(yīng)的固定短串深度為55，估計基因組大小約為4.71 Mb。

2.2 基因組序列初步分析

對基因組數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，基因組的GC含量為63.49%。采用TRF從頭預(yù)測原理進(jìn)行重復(fù)序列預(yù)測，共有366條重復(fù)序列，總長度為21 978 bp。同時分析鑒定了基因組的非編碼RNA，包括42個tRNA，8個 rRNA，8個 miRNA。 使用 Glimmer軟件采用內(nèi)插馬爾可夫模型 （interpolated Markov models，IMMs）來識別基因組中的編碼區(qū)域，預(yù)測編碼基因，共得到編碼基因5 815個。

2.3 基因功能分類

對預(yù)測基因的氨基酸序列在數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行比對注釋。在Nr庫中，有4 878個基因具有注釋信息，占到預(yù)測基因的83.88%。共有4 887個基因可以注釋到Nr、COG、KEGG、GO等數(shù)據(jù)庫，占到預(yù)測基因的 84.04%，見表1。

將預(yù)測到的所有蛋白質(zhì)序列與COG數(shù)據(jù)庫進(jìn)行BlastP比對分析，其中2 431個蛋白質(zhì)獲得COG功能注釋，見圖1。由圖1可知，COG聚類主要集中于轉(zhuǎn)錄、翻譯、糖代謝、氨基酸代謝、脂類代謝和次級代謝等。

將預(yù)測到的所有蛋白質(zhì)序列與GO數(shù)據(jù)庫進(jìn)行BlastP比對分析，其中3 598個蛋白質(zhì)獲得GO功能注釋，見圖2。由圖2可知，GO聚類主要分為3個部分，按照其參與構(gòu)成細(xì)胞組成，實(shí)現(xiàn)分子功能和參與生物過程等進(jìn)行分類。

圖1 Halogranum amylolyticum TNN58蛋白質(zhì)COG聚類分析Fig.1 COG cluster analysis of Halogranum amylolyticum TNN58 proteins

2.4 PHA合酶的初步分析

PHA合酶是PHA生物合成中的關(guān)鍵酶，決定了PHA的種類，如PHA的單體種類、含量和聚合方式等。目前報道利用非相關(guān)碳源合成PHBV的非基因工程菌中，H.amylolyticum TNN58是3-HV含量最高的微生物，對其PHA合酶分析具有一定的意義[16]。2003年，Rehm報道，細(xì)菌中PHA合酶的種類共有4類，見圖3。I類II類合酶只有一個單體PhaC，III類由 PhaC和 PhaE組成，IV類合酶由Phac和PhaR亞基組成。不同類型的PHA合酶具有不同的底物類型等差異[17]。2008年，Hanjing等在Haloarcula marismortui ATCC43049中發(fā)現(xiàn)一類新的合酶種類，由PhaC和PhaE組成，PhaC亞基53 000，PhaE亞基20 000。而細(xì)菌中的III類PHA合酶，PhaC亞基和PhaE亞基大小類似，均在40 000左右。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，目前研究發(fā)現(xiàn)的極端嗜鹽古菌的PHA合酶類似于III類PHA合酶，但是PhaC亞基的相對分子質(zhì)量明顯大于PhaE亞基，故定義為新一類的PHA合酶[18]。

圖2 Halogranum amylolyticum TNN58蛋白質(zhì)GO聚類分析Fig.2 GO cluster analysis of Halogranum amylolyticum TNN58 proteins

圖3 細(xì)菌中PHA合酶的分類Fig.3 PHA synthase in bacteria

將預(yù)測的H.amylolyticum TNN58的PHA合酶基因與H.mediterranei的PHA合酶進(jìn)行比對，發(fā)現(xiàn)兩個ORF編碼的氨基酸與H.mediterranei的PhaE和PhaC的氨基酸序列同源性達(dá)到64%和62%，因此命名為phaE和phaC。phaC的起始密碼子（ATG）與phaE的終止密碼子（TGA），有兩個堿基的重疊，共用了T和G。PhaC亞基的相對分子質(zhì)量為54 000，PhaE亞基的相對分子質(zhì)量為21 000，見圖4。進(jìn)一步的分析發(fā)現(xiàn)，PhaC亞基的氨基酸序列中存在一個“脂肪酶盒”（Gly-X-Cys-X-Gly-Gly）結(jié)構(gòu)，該結(jié)構(gòu)在PHA合酶十分保守，推測可能是PHA合酶的活性位點(diǎn) （Gerngross et al.，1994）[19]。 同時發(fā)現(xiàn)PhaC亞基具有PHA合酶所特有的三聯(lián)體催化氨基酸 Cys150-Asp305-His334，對應(yīng)于 H.mediterranei的PhaC亞基中的催化氨基酸Cys150-Asp305-His334。

圖4 H.amylolyticum TNN58 PHA合酶氨基酸比對結(jié)果Fig.4 Multiple alignments of partial amino acid sequences of the PHA synthase of H.amylolyticum TNN58

2.5 PHBV前體供應(yīng)途徑的分析

2013年，Han等通過對H.mediterrane的基因組數(shù)據(jù)，芯片組數(shù)據(jù)，代謝流分析和遺傳學(xué)實(shí)驗(yàn)等發(fā)現(xiàn)了4條propionyl-coA的供給途徑[20]。

根據(jù)Nr、COG、KEGG、GO等數(shù)據(jù)庫對基因功能的注釋，通過與Han等報道的H.mediterrane中3-HV供應(yīng)途徑進(jìn)行分析，得到了H.amylolyticum TNN58中3-HV的供應(yīng)途徑[20]。具體途徑見圖5，基因的信息見表2。TNN58的3-HV供應(yīng)途徑一共有4條。

2.6 PHBV降解分析

PHA的降解即是PHA的解聚過程。PHA的降解由PHA解聚酶PhaZ催化進(jìn)行。根據(jù)降解底物的不同，PhaZ分為兩種：胞內(nèi)降解酶（intracellular depolymerase，iPhaZ） 和 胞 外 降 解 酶 （extracellular depolymerase，ePhaZ），分別負(fù)責(zé)胞內(nèi)PHA顆粒的降解解聚和環(huán)境中PHA的降解[21]。

圖5 H.amylolyticum TNN58 PHBV合成代謝預(yù)測途徑Fig.5 Predicted biosynthetic pathway of PHBV in H.amylolyticum TNN58

以細(xì)菌中已知的 PHA降解酶 （Knoll，et al.2009）序列為參考對象對H.amylolyticum TNN58的全基因組序列進(jìn)行本地BlastP比對分析，結(jié)果并沒有找到匹配度很高的蛋白質(zhì)序列。2015年，Liu等在H.mediterrane報道了一個能夠胞內(nèi)降解PHA的PhaZ，命名為 PhaZh1[21]。以 H.mediterrane 的 PhaZh1的序列為參考對象，對TNN58的全基因組序列進(jìn)行本地BlastP比對分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)BSP003746與之高度同源，達(dá)63%，推測可能是TNN58中的iPhaZ。

基因編號基因注釋催化反應(yīng)基因編號基因注釋3-羥基丁酰-C o A脫氫酶3-2（1，2）-6 B S P 0 0 2 4 1 8 B S P 0 0 3 1 4 5甲基丙二酰輔酶A差向異構(gòu)酶3-羥基丁酰-C o A脫氫酶（1，2）-6 B S P 0 0 0 7 6 4 B S P 0 0 5 2 7 5甲基丙二酰輔酶A脫羧酶B S P 0 0 0 3 2 5 B S P 0 0 0 7 6 9（1，2）-6 3-羥基丁酰-C o A脫氫酶生物素羧化酶活性3-3 B S P 0 0 0 6 8 9（1，2）-7乙酰輔酶A C-乙酰轉(zhuǎn)移酶B S P 0 0 0 3 2 6生物素羧化酶活性3-3（1，2）-7 B S P 0 0 1 0 0 2乙酰輔酶A C-乙酰轉(zhuǎn)移酶B S P 0 0 5 2 7 0生物素羧化酶活性B S P 0 0 1 2 7 6乙酰輔酶A C-乙酰轉(zhuǎn)移酶（1，2）-7生物素羧化酶4-1 B S P 0 0 0 3 2 5 B S P 0 0 0 8 0 0乙酰輔酶A C-乙酰轉(zhuǎn)移酶（1，2）-7催化反應(yīng)B S P 0 0 5 2 7 0生物素羧化酶4-1 B S P 0 0 1 9 1 9 B S P 0 0 0 3 2 6生物素羧化酶乙酰輔酶A C-乙酰轉(zhuǎn)移酶（1，2）-7（1，2）-7乙酰輔酶A C-乙酰轉(zhuǎn)移酶B S P 0 0 5 1 9 8 B S P 0 0 5 6 6 0丙二酰輔酶A還原酶4-2 B S P 0 0 0 8 2 0 3-3乙酰輔酶A C-乙酰轉(zhuǎn)移酶（1，2）-7 4-1 B S P 0 0 4 2 7 7乙酰輔酶A合酶4-4 2-1 B S P 0 0 2 5 1 1 L-蘇氨酸脫水酶3-3乙酰輔酶A合酶4-4 L-蘇氨酸脫水酶2-1 B S P 0 0 1 8 7 7 B S P 0 0 0 2 3 2乙酰輔酶A合酶B S P 0 0 0 7 2 5 4-4 B S P 0 0 0 7 9 9 B S P 0 0 0 1 7 9 L-蘇氨酸脫水酶2-1 4-5 L-蘇氨酸脫水酶B S P 0 0 3 7 4 5 B S P 0 0 2 3 1 9烯酰-C o A水合酶2-1烯酰-C o A水合酶4-5 B S P 0 0 4 2 8 8甲基丙二酰輔酶A變位酶3-1 B S P 0 0 0 7 8 8烯酰-C o A水合酶4-5 B S P 0 0 2 2 8 9甲基丙二酰輔酶A變位酶3-1 B S P 0 0 3 1 4 6烯酰-C o A水合酶甲基丙二酰輔酶A變位酶3-1 B S P 0 0 1 1 1 2 B S P 0 0 4 2 7 6丙烯酰-C o A還原酶4-4 4-6 B S P 0 0 1 5 5 2 3-2甲基丙二酰輔酶A差向異構(gòu)酶

2.7 乙醛酸循環(huán)和甲基天冬氨酸循環(huán)

極端嗜鹽古菌的生存環(huán)境中鹽濃度很高，在此鹽濃度下，大部分微生物不能存活。極端嗜鹽古菌通過長期的進(jìn)化具有了許多獨(dú)特的特征。由于具備這些特性，它們才能適應(yīng)高鹽環(huán)境?？茖W(xué)家對極端嗜鹽古菌適應(yīng)高鹽環(huán)境的機(jī)制進(jìn)行了長期的研究。2011年Mairakhomyakova等通過對極端嗜鹽古菌Haloarcula marismortui DSM3752進(jìn)行蛋白質(zhì)組學(xué)研究，發(fā)現(xiàn)H.marismortui DSM3752中不存在乙醛酸循環(huán)。通過進(jìn)一步分析和酶活測定，他們預(yù)測H.marismortui DSM3752存在一條甲基天冬氨酸途徑替代乙醛酸循環(huán)的途徑，起到同化乙酸鹽的作用，同時認(rèn)為該途徑和極端適應(yīng)環(huán)境的機(jī)制存在一定的關(guān)系[22]。2015年，F(xiàn)arshad等通過基因敲除等技術(shù)設(shè)計遺傳學(xué)實(shí)驗(yàn)，驗(yàn)證了該條途徑的存在。同時發(fā)現(xiàn)該途徑與生物合成有關(guān)，特別是和PHA的合成有一定的關(guān)系[23]。

對H.amylolyticum TNN58的基因組進(jìn)行分析，在已經(jīng)預(yù)測功能的基因中，不存在異檸檬酸裂解酶，因此推斷，H.amylolyticum TNN58中不存在乙醛酸循環(huán)。進(jìn)一步研究H.amylolyticum TNN58中是否存在甲基天冬氨酸循環(huán)作為乙醛酸的替代途徑，我們以Haloarcula marismortui DSM3752的甲基天冬氨酸途徑為參照，對其基因組數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，結(jié)果見圖6[22]。2-酮戊二酸在谷氨酸脫氫酶的作用下轉(zhuǎn)化為谷氨酸，谷氨酸在谷氨酸變位酶的作用下生成甲基天冬氨酸，甲基天冬氨酸在甲基天冬氨酸裂解酶作用下生成康酸，接下來在康酸輔酶A轉(zhuǎn)移酶的作用下生成康酰輔酶A，在康酰輔酶A水合酶的催化下生成β-甲基蘋果酰輔酶A，β-甲基蘋果酰輔酶A通過mcl的催化裂解為丙酰輔酶A和乙醛酸。乙醛酸和乙酰輔酶A合成蘋果酸，進(jìn)入TCA循環(huán)，或者進(jìn)一步用于生物合成。丙酰輔酶A經(jīng)過一系列轉(zhuǎn)化可以生成琥珀酰輔酶A進(jìn)入TCA循環(huán)。此循環(huán)中，甲基天門冬氨酸是其特征性中間體。具體的基因信息見表3。通過表3可以看出，甲基天冬氨酸循環(huán)所涉及的酶在TNN58的預(yù)測功能基因中都存在。這6個基因存在于1個基因簇上。因此推測TNN58中，可能存在此代謝途徑。

圖6 乙醛酸循環(huán)和甲基天冬氨酸循環(huán)Fig.6 Acetaldehyde acid cycle and methylaspartate cycle

表3 H.amylolyticum TNN58基因組中預(yù)測甲基天冬氨酸循環(huán)相關(guān)基因Table 3 Predicted gene relate to methylaspartate cycle identified by H.amylolyticum TNN58 genome

3 結(jié)語

在我們的研究中，發(fā)現(xiàn)H.amylolyticum TNN58可以利用非相關(guān)碳源合成3HV摩爾比高達(dá)20%的PHBV材料，這在目前的已報道的研究中屬于最高。因此，研究H.amylolyticum TNN58合成高含量3-HV的PHBV機(jī)制，具有重要的意義。

研究發(fā)現(xiàn)，PHBV是由乙酰輔酶A和丙酰輔酶A通過3個酶——β-酮硫解酶、β-酮脂酰還原酶和PHA合酶催化合成的。PHBV中3-HV的比例與丙酰輔酶A的供給及PHA合酶的特性具有直接的關(guān)系。

通過數(shù)據(jù)分析，初步預(yù)測H.amylolyticum TNN58存在4條丙酰輔酶A的供給途徑。同時，我們初步預(yù)測和分析了H.amylolyticum TNN58的PHBV合成代謝的途徑及關(guān)鍵酶的特征，這為我們進(jìn)一步了解其合成高摩爾比3-HV的PHBV機(jī)制具有重要的參考價值，也為通過遺傳改造提高PHBV產(chǎn)量奠定了基礎(chǔ)。

通過比對分析發(fā)現(xiàn)H.amylolyticum TNN58中負(fù)責(zé)PHA降解的酶。這對于研究PHA代謝的動態(tài)平衡，在適當(dāng)?shù)拇x條件下闡明PHA如何降解成單體的機(jī)制是非常必要的。

通過對數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)H.amylolyticum TNN58不存在乙醛酸循環(huán)，同時可能存在甲基天冬氨酸途徑。這有助于我們理解甲基天冬氨酸途徑與PHBV代謝的作用，以及甲基天冬氨酸途徑在極端嗜鹽古菌適應(yīng)高鹽環(huán)境的機(jī)制中的作用。

H.amylolyticum TNN58基因組測序完成為進(jìn)一步開展該菌的基因結(jié)構(gòu)與功能和代謝途徑研究，特別是PHBV代謝途徑的研究提供有價值的信息，為進(jìn)一步闡述其合成高摩爾比3-HV的PHBV機(jī)制，通過基因工程手段提高PHBV產(chǎn)量及3HV比例等提供了參考。