長期口服恩替卡韋治療的慢性乙型肝炎患者換用α干擾素治療臨床療效隨訪研究

王芳芳，張國范，郭春霞，楊振浩，潘延鳳，余祖江

近年來，我國急性 HBV感染明顯減少，但隨著感染 HBV人口的老齡化，其帶來的危害仍然是嚴重的負擔[1]。慢性乙型肝炎（CHB）治療的目的是達到病毒清除、延緩肝臟失代償、肝硬化和肝細胞癌的發(fā)生，進而改善患者的生活質量和延長生存時間[2]。HBV復制被認為是影響CHB疾病進展的最危險因素[3]，核苷（酸）類似物（NAs）能有效抑制 HBV DNA復制，其臨床應用有效地阻斷了CHB的進展[4，5]。然而，大部分口服NAs的CHB患者在停藥后會出現(xiàn)病毒學反彈，引起疾病復發(fā)[6-8]，少數(shù)患者在停用NAs后會誘發(fā)肝衰竭[9]。α干擾素具有提高免疫反應的作用，可以增強針對HBV的特異性免疫功能，在停藥后具有較持久的應答反應[10]。因此，經(jīng)NAs治療長期應答的CHB患者在換用α干擾素鞏固治療后，是否可以停止治療，值得探索。本研究選擇長期口服恩替卡韋治療且應答良好的CHB患者換用重組人干擾素α2b治療，觀察了其療效情況，現(xiàn)將研究結果報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 本研究屬于前瞻性隊列研究，選擇自2006～2010年以來在我院長期口服恩替卡韋治療而獲得病毒學應答的CHB患者120例，男75例，女性45例，平均年齡46.5±12.3歲。診斷符合亞太（APASL）乙型肝炎防治指南的標準[11]，接受恩替卡韋治療時間為7～11（8.4±2.6）年。所有病例均符合以下納入標準：（1）年齡≥25 歲；（2）口服恩替卡韋至少7年以上；（3）血清HBeAg陽性，而血清HBV DNA 陰性。排除標準：（1）有嚴重心、肺、腦、骨髓等器官、系統(tǒng)疾病者；（2）有腎功能障礙或潛在腎臟病病史者；（3）有自身免疫性疾病史，包括甲狀腺機能亢進癥、糖尿病病史者；（4）合并其他病毒性肝炎、藥物性肝損傷、酒精性肝炎、脂肪肝、自身免疫性肝炎、原發(fā)性膽汁性肝硬化、原發(fā)性硬化性膽管炎、慢性血吸蟲病、代謝性肝病和代償期或失代償期肝硬化患者；（5）有癲癇、抑郁和其他中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病者；（6）對干擾素過敏者；（7）合并 AIDS 等其他病毒感染者。將患者隨機分成兩組，兩組在年齡、性別、治療時間和病情方面比較，無統(tǒng)計學差異（P＞0.05），具有可比性。所有患者簽署知情同意書，本研究獲本院醫(yī)學倫理委員會批準。

1.2 治療方法 觀察組繼續(xù)口服恩替卡韋治療12周，同時給予重組人干擾素α-2b（安達芬，安徽安科生物）3～6 MIU肌肉或皮下注射，1次/d，連用15 d，后改為隔日1次，至48 w。在注射α-干擾素治療12 w時停用恩替卡韋；對照組繼續(xù)口服恩替卡韋至48 w。兩組停藥后，均隨訪24 w。

1.3 臨床檢測 使用貝克曼公司生產(chǎn)的全自動生化分析儀檢測血生化指標；采用ELISA法檢測血清HBV標記物（Abbott試劑盒，其中血清HBsAg的檢測水平為0.05 IU/ml）；采用實時熒光定量PCR法檢測 HBV DNA（Rotor-Gene 6000，Corbett Research公司）。

1.4 療效判斷標準 停藥24 w病毒學復發(fā)（virologicalrelapse，VR）被定義為血清HBV DNA定量檢測重新大于1×104copies/ml；生化學復發(fā)（clinical relapse，CR）被定義為血清谷丙轉氨酶（ALT）水平大于正常值上限2倍以上。

1.5 統(tǒng)計學方法 應用SPSS 18.0軟件和Cochran Mantel-Haenszel檢驗進行統(tǒng)計學處理，計量資料以±s表示，采用t檢驗，計數(shù)資料采用x2檢驗，以P＜0.05為有統(tǒng)計學差異。

2 結果

2.1 兩組復發(fā)率比較 停藥后隨訪24 w，觀察組病毒學和臨床復發(fā)率顯著低于對照組（P＜0.01，表1）。

表1 兩組復發(fā)率（%）比較

2.2 兩組血清HBsAg和HBeAg陰轉率和HBV DNA復陽率比較 在停藥隨訪24 w時，觀察組血清HBsAg和HBeAg轉陰分別為11例（18.3%）和13例（21.7%），而對照組無血清HBsAg和HBeAg陰轉病例（0.0%和0.0%，P＜0.05）；觀察組血清 HBV DNA復陽10例（16.7%），顯著低于對照組的42例（70.0%，P<0.05）。

2.3 兩組血清HBsAg水平變化的比較 在治療和隨訪過程中，觀察組患者血清HBsAg水平均呈下降趨勢，但對照組患者血清HBsAg水平均無顯著變化。自治療24 w開始，兩組患者血清HBsAg水平存在顯著差異（P＜0.01，表2）。

2.4 不良反應情況 觀察組患者在注射干擾素期間，均出現(xiàn)發(fā)熱、肌肉酸痛等流感樣癥狀，發(fā)生白細胞計數(shù)下降57例，紅細胞計數(shù)下降2例，血小板計數(shù)下降41例，出現(xiàn)甲狀腺功能亢進3例。所有出現(xiàn)不良反應的患者均給予對癥處理，全部病例均按照 試驗設計要求完成治療，無退出病例。

表2 兩組血清 HBsAg 水平（IU/ml，±s）變化比較

表2 兩組血清 HBsAg 水平（IU/ml，±s）變化比較

例數(shù) 治療前 治療24 w 48 w 停藥24 w觀察組 60 3097.7±289.9 1944.7±268.6 530.7±261.3 512.4±176.7對照組 60 3091.6±280.3 3080.4±255.1 3087.1±264.1 3148.5±212.3 t值 - 0.121 2.838 11.60 11.54 P值 - 0.904 0.005 0.000 0.000

3 討論

雖然在核苷（酸）類似物出現(xiàn)后使CHB的治療有了劃時代的改變，但長期用藥后出現(xiàn)了種種不盡如人意的問題，如耐藥和停藥后病情復發(fā)問題，其中最嚴重的問題是停藥后誘發(fā)肝衰竭。因為，核苷（酸）類似物屬于HBV DNA聚合酶的抑制劑，可以抑制HBV DNA復制，但是其并不能清除肝細胞核內(nèi)HBV共價環(huán)狀閉合DNA（cccDNA）和前基因組RNA（pgRNA）的合成[12，13]。HBV cccDNA 在肝細胞核內(nèi)與組蛋白結合，形成一種微小染色體，充當新病毒前基因組RNA合成的模板，并確保后代病毒顆粒的形成[14，15]。因此，HBV cccDNA代表了病毒在宿主體內(nèi)持續(xù)感染的存在，也是核苷（酸）類似物停藥后復發(fā)和無法治愈的主要原因[16]。CHB患者病情復發(fā)與HBV cccDNA有關是可以解釋的，但是核苷（酸）類似物停藥后出現(xiàn)病毒學反彈并誘發(fā)肝衰竭可能還是與HBV RNA有關。HBV RNA是裝備完整的乙型肝炎病毒外殼內(nèi)含有的HBV pgRNA，在口服核苷類似物的患者由于藥物阻斷了病毒從pgRNA逆轉錄成HBV DNA，因而在此類患者的肝細胞中存在大量的HBV RNA病毒顆粒[17]。盡管我們在患者血液中檢測不出HBV DNA，但是血液中存在著大量的HBV RNA病毒顆粒，HBV RNA病毒顆粒在停藥后會迅速轉化成HBV DNA，我們認為這是誘發(fā)病情加重的生物學原因[18，19]。

盡管口服核苷（酸）類似物不能清除肝細胞核內(nèi)的HBV cccDNA和和阻斷HBV RNA合成，但是它可以完全阻斷HBV DNA的形成，經(jīng)過長期口服核苷（酸）類似物患者體內(nèi)不存在HBV DNA，從而進一步阻斷了新的HBV cccDNA的形成，為α干擾素治療提供了發(fā)揮最大藥效的機會。因為有研究顯示[20]，α干擾素具有抗病毒和免疫調(diào)節(jié)的雙重作用，其介導的免疫應答能在病毒生命周期的多個不同環(huán)節(jié)抑制HBV復制。首先，α干擾素的抗病毒作用可以實現(xiàn)清除患者體內(nèi)HBV RNA的作用，因為α干擾素誘導的MxA蛋白可以使得HBV RNA核衣殼破壞，從而將HBV RNA暴露于胞漿中[21]，而α干擾素誘導的 OAS/RNase抗病毒通路可以降解HBV RNA，從而最終實現(xiàn)患者體內(nèi) HBV RNA的清除[22]。理論上，可以防止核苷（酸）類似物停用患者出現(xiàn)病毒學反彈。本研究在停用恩替卡韋的患者換用α干擾素后沒有出現(xiàn)病毒學反彈，而對照組在停用后出現(xiàn)了病情加重，佐證了推測的正確性。其次，α干擾素可以不破壞肝細胞，即通過APOBEC蛋白的堿基切除修復通路，直接消除肝細胞內(nèi)HBV cccDNA[23]，也可以破壞病毒感染的肝細胞，即通過誘導針對病毒的特異性細胞毒性T淋巴細胞應答，從而間接消除HBV cccDNA[24]。本研究在注射α干擾素的觀察組患者血清HBsAg持續(xù)下降并出現(xiàn)多例HBsAg陰轉患者，表明α干擾素確實可以通過直接或間接消除HBV cccDNA，因為有研究顯示[25]患者血清HBsAg水平與肝內(nèi)HBV cccDNA水平高度相關，降低HBsAg水平意味著肝內(nèi)的HBV cccDNA已經(jīng)降低。另外，α干擾素還能通過表觀遺傳學修飾的方式沉默HBV cccDNA。HBV cccDNA是一種微小染色體，α干擾素能夠使與其結合的組蛋白的去乙?；图谆沟肏BV cccDNA處于高度濃縮的染色體狀態(tài)而不能轉錄，達到抑制HBV前基因組RNA和mRNA合成和轉錄[26]。本研究結果也支持以上的觀點，在停止治療后隨訪24周時，觀察組患者血清HBsAg水平依然持續(xù)下降，且病毒學復發(fā)率為11.7%，顯著低于對照組的率65.0%（P＜0.05），顯示經(jīng)α干擾素治療后大多數(shù)患者肝細胞HBV cccDNA可能已經(jīng)被沉默而不能再產(chǎn)生子代病毒顆粒了。

綜上所述，針對長期口服恩替卡韋等核苷（酸）類似物治療的CHB患者，雖然血清不存在HBV DNA，但是其肝細胞中可能還存在HBV cccDNA和HBV RNA，也是造成恩替卡韋停藥后病情復發(fā)和病毒學反彈的主要生物學原因，而應用α干擾素能夠消除和沉默HBV cccDNA，并清除HBV RNA，因而可以達到清除病毒和預防停藥后病情復發(fā)的作用。本研究結果顯示，長期口服恩替卡韋治療的CHB患者在達到完全應答后換用重組人干擾素α2b繼續(xù)治療，可以有效降低患者血清HBsAg水平，預防恩替卡韋停藥后病情復發(fā)和病情加重。該方案可能是目前長期口服核苷（酸）類似物治療的CHB患者安全停藥的最有效的方法，且能讓部分患者因出現(xiàn)血清HBsAg消失而達到臨床治愈，值得臨床進一步驗證。