葡萄糖神經(jīng)酰胺葡萄糖基轉移酶siRNA對7702肝細胞增殖的影響及機制研究*

李俊峰，鄭素軍，劉霜，任鋒，陳煜，段鐘平

在糖鞘脂代謝過程中，葡萄糖化神經(jīng)酰胺合成酶（glucosy lceramide synthase，GCS）是催化神經(jīng)酰胺進行糖基化的關鍵酶[1-5]。我們之前的研究均表明鞘脂及其代謝在多種肝臟疾病的發(fā)生發(fā)展中扮演重要的角色[6-8]。最近我們發(fā)現(xiàn)丙型肝炎患者血漿糖化神經(jīng)酰胺的變化與肝內壞死性炎癥的發(fā)生風險明顯相關[9]。我們推測內源性GCS可能與肝細胞的增殖和凋亡有一定的聯(lián)系。本研究利用體外siRNA技術干擾GCS基因表達，觀察了肝細胞的增殖和相關凋亡通路的變化，目的在于探討GCS在肝細胞增殖過程中的作用。

1 材料與方法

1.1 細胞 人源肝細胞株7702細胞為首都醫(yī)科大學附屬北京佑安醫(yī)院人工肝中心長期保存。RPMI 1640培養(yǎng)基（美國Hyclone公司），10%胎牛血清（美國Hyclone公司），細胞培養(yǎng)箱（美國Thermo公司）。

1.2 siRNA轉染細胞 取對數(shù)生長期的7702細胞，每孔取1×105細胞，鋪于24孔板。置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，待細胞貼壁后棄去上清，每孔加入siRNA和Lipofectamin 2000混合液。同時將無血清無抗生素的1640培養(yǎng)基作為空白對照組，同時將只加轉染試劑的Lipofectamin 2000作為轉染試劑組。培養(yǎng)6 h，在熒光顯微鏡下觀察轉染效率。采用實時熒光定量PCR法檢測UDP-葡萄糖神經(jīng)酰胺葡萄糖基轉移酶（UDP-glucose ceramide glucosyltransferase，UGCG）siRNA對靶基因GCS的干擾效果。UGCG siRNA 序列為：正向（5’→3’）CGC GAA UCC AUG ACA AUA UTT，反向 （5’→3’）AUA UUG UCA UGG AUU CGC GTT；陰性對照siRNA序列為：正向 （5’→3’）GCGACGAUCUGCCUAAGA UdTdT，反向（5’→3’）AUC UUA GGC AGA UCG UCG UCG CdTdT。人 GCS 引物序列：正向（5’→3’）TTC ATG TGT CAT TGC CTG GC，反向（5’→3’）AGC GTA ATC TGT AGC GAC CA。

1.3 UGCG siRNA對肝細胞增殖的影響 采用MTT法檢測。

1.4 細胞 Bcl-2、Bax和 Caspase 3基因水平檢測 采用實時熒光定量PCR法，取7702細胞1×105個/孔，鋪種于24孔板，加入完全培養(yǎng)基1 mL，培養(yǎng)細胞24 h，待細胞貼壁生長后，分為轉染組和UGCG siRNA干預組，培養(yǎng)6 h，換成無血清培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)至24 h。然后，提取細胞RNA。采用紫外分光光度法測定總RNA濃度及純度，在37℃ 10 min，42℃ 30 min，99℃ 5 min，5℃ 5 min 進行反轉錄反應，合成cDNA。采用實時熒光定量PCR法檢測mRNA水平：反應體系為20μl，PCR循環(huán)參數(shù)為：步驟 1：50℃ 2 min；步驟 2：95℃ 10 min；步驟3：95℃ 15 s，60℃ 1 min，40 個循環(huán)。人源 GCS、Bcl-2、Bax和Caspase 3基因引物序列為：人Bcl-2正向 （5’→3’）：GTG GCC TTC TTT GAG TTC GG，反向 （5’→3’）：GGC CGT ACA GTT CCA CAA AG；人 Bax正向（5’→3’）：ATG AAG ACA GGG GCC CTT TT，反向（5’→3’）：GCA ATC ATC CTC TGC AGC TC；人 Caspase 3正向（5’→3’）：ACT GGA CTG TGG CAT TGA GA，反向（5’→3’）：GCACAAAGCGACTGGATGAA；人GAPDH 正向（5’→3’）：CCA GAA CAT CAT CCC TGC CT，反向（5’→3’）：CCT GCT TCA CCA CCT TCT TG。

1.5 肝細胞Caspase 3蛋白表達檢測 采用Western blot法檢測，取對數(shù)生長期7702細胞，調整細胞密度為3～3.5×105/m1，在wRNA干預組，37℃培養(yǎng)6 h，換成無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)至24 h，分離蛋白，用BCA法測定蛋白濃度。配制12%分離膠10 ml和5%濃縮膠5ml，行聚丙烯酰胺凝膠電泳，轉PVDF膜，用5%脫脂奶粉按1:800比例配制兔抗人Caspase-3單克隆抗體，將膜浸于抗體中4℃搖床過夜，用5%脫脂奶粉按1:2000比例配制抗兔二抗，浸膜，室溫下?lián)u床上孵育1 h，將ECL發(fā)光試劑A與試劑B以1:1比例混合后，將PVDF膜曝光，掃描分析。應用Image J software 1.46軟件分析條帶灰度值。

1.6 統(tǒng)計分析 應用SPSS 19.0軟件行數(shù)據(jù)分析，計量資料以（±s）表示，采用獨立樣本t檢驗或Mann-Whitney檢驗，P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 UGCG siRNA對肝細胞轉染的抑制作用 將siRNA和轉染試劑按照不同比例轉染（兩者以VsiRNA:VLipo=3:1的比例轉染，siRNA終濃度為0.12 μmol/L）。將UGCG siRNA和陰性對照siRNA以VsiRNA:VLipo=3:1的比例轉染7702細胞24 h后，采用PCR法檢測siRNA對靶基因GCS基因水平的抑制效果，結果發(fā)現(xiàn)轉染UGCG siRNA組相比轉染試劑組，GCS基因水平有明顯被抑制的現(xiàn)象（P<0.05），而轉染陰性對照siRNA組GCS基因水平相對轉染試劑組無明顯變化（圖1）。

2.2 各組細胞增殖率比較 與單獨轉染試劑Lipofec tamin 2000轉染細胞比，轉染UGCG siRNA后肝細胞增殖明顯被抑制（P<0.05，圖2）。

2.3 各組細胞肝細胞凋亡相關分子mRNA水平比較 結果發(fā)現(xiàn)相比轉染試劑組，UGCG siRNA轉染組肝細胞Bcl-2 mRNA水平顯著下降（P<0.05），Bax mRNA水平顯著升高（P<0.05），Caspase 3 mRNA水平同樣上調（P<0.05，圖3）。

圖1 各組UGCG siRNA轉染肝細胞后糖化神經(jīng)酰胺酶mRNA水平比較 表明UGCG siRNA能夠降低GCS基因水平

圖2 各組細胞增殖率比較 表明UGCG siRNA能夠抑制7702肝細胞增殖

圖3 各組細胞肝細胞凋亡相關基因mRNA水平比較 表明UGCG siRNA能夠下調Bcl-2 mRNA水平，上調Bax和Caspase 3 mRNA水平

2.4 各組細胞Caspase 3蛋白表達情況比較 結果發(fā)現(xiàn)與轉染試劑組比，轉染UGCG siRNA肝細胞Caspase 3表達量上調（圖4）。

圖4 各組細胞Caspase 3蛋白表達情況 表明UGCG siRNA能夠上調肝細胞Caspase 3蛋白的表達

3 討論

本研究的主要發(fā)現(xiàn)為首次驗證了抑制GCS的基因表達可能會導致肝細胞的凋亡。本研究在設計上采用siRNA技術靶向干擾GCS的基因表達，進而在GCS表達特異性抑制的基礎上，探討GCS對肝細胞增殖的影響及其可能的信號通路。由于凋亡信號通路錯綜復雜，因此本文為初步研究，未能觀察GCS基因表達的抑制對其他凋亡信號通路的影響。但是，基于目前的研究結果，我們推測肝細胞內源性GCS可能參與了肝細胞的生長周期。

在鞘脂代謝中，GCS是催化神經(jīng)酰胺進行糖基化的關鍵酶，通過影響神經(jīng)酰胺和糖鞘脂的代謝平衡來調控細胞的生理活性。在神經(jīng)酰胺的糖基化過程中，葡萄糖連接在神經(jīng)酰胺的1-羥基基團，從而產(chǎn)生葡萄糖神經(jīng)酰胺[14,15]。GCS是UGCG基因編碼的內在膜蛋白，在所有真核細胞膜上表達。在GCS表達下降或者活性減低時，神經(jīng)酰胺糖基化水平下降，導致神經(jīng)酰胺水平升高，升高的神經(jīng)酰胺是有效誘導細胞凋亡的介質，能夠觸發(fā)內源性和外源性細胞凋亡。而神經(jīng)酰胺激活調控細胞凋亡的主要途徑主要為內質網(wǎng)和線粒體途徑[8]，并參與到TNF α介導的凋亡通路中[16]。本研究首先驗證靶向針對GCS基因的UGCG siRNA序列的干擾效果，發(fā)現(xiàn)該UGCG siRNA序列能夠抑制GCS基因的表達，繼而在此前提下，進一步觀察利用siRNA技術特異性抑制GCS的基因表達對肝細胞增殖的影響。結果發(fā)現(xiàn)肝細胞的增殖受到明顯抑制，轉染UGCG siRNA的肝細胞活性明顯下降，說明肝細胞的增殖可能與GCS被抑制有關，推測抑制該酶后可能會導致神經(jīng)酰胺水平升高，進而可能參與到肝細胞活性下降的過程中。

為了更深入研究GCS基因表達被抑制后引起肝細胞凋亡的可能機制，本研究進一步觀察了轉染UGCG siRNA后對肝細胞凋亡相關的Bcl-2凋亡途徑的影響。作為抗凋亡基因，Bcl-2可與Bax形成二聚體，抑制細胞凋亡，而Bax水平增加可拮抗Bcl-2的作用，促進細胞凋亡[17]。此外，研究證實Bax在線粒體膜中形成Bax通道，促進細胞色素C釋放并進入胞質，使Bcl-2與Apaf1分離后，繼而激活Caspase，誘導細胞凋亡[18，19]。因此，Bcl-2 和 Bax在調控細胞凋亡過程中發(fā)揮重要作用。本研究發(fā)現(xiàn)抑制GCS基因表達后，可以導致Bcl-2基因水平顯著降低，Bax基因水平升高，推測糖化神經(jīng)酰胺和神經(jīng)酰胺之間的代謝異?？赡軈⑴c到Bcl-2和Bax調節(jié)的肝細胞凋亡過程中。另外，Caspase 3位于Caspase級聯(lián)反應下游，是執(zhí)行凋亡功能的最主要的蛋白酶之一[20]。本研究發(fā)現(xiàn)在抑制GCS基因表達后，Caspase 3基因水平明顯上升，其蛋白表達有上升趨勢，表明可能是由于凋亡相關基因表達改變后，最終引起執(zhí)行凋亡效應的Caspase 3發(fā)生了變化，其蛋白水平上升不是非常明顯，可能是由于效應時間較短的緣故。

總之，本研究在前期研究基礎上，利用siRNA干擾技術體外轉染肝細胞，初步發(fā)現(xiàn)GCS基因表達下降后，肝細胞增殖受到抑制，同時細胞凋亡增加，這種效應可能與Bcl-2介導的凋亡過程有關，是各種原因導致GCS發(fā)生變化后肝細胞凋亡的機制所在。