油桐花水提物干預(yù)燒傷大鼠Bcl—2、Bax表達(dá)的研究

李金鳳 王永萍

【摘 要】 目的：通過研究油桐花水提物外用對燒傷大鼠的影響，并探索其對Bcl-2、Bax基因表達(dá)的影響。方法：60只Wistar大鼠，隨機(jī)分為6組，每組10只。除正常組外其余5組建立大鼠深Ⅱ度燒傷模型，并對其進(jìn)行相應(yīng)藥物治療。待傷勢恢復(fù)后，相機(jī)拍攝各組患處，處理取材。用Elisa和免疫組化法檢測Bcl-2和Bax的表達(dá)情況。結(jié)果：Elisa檢測表明，與模型組比較，各用藥組血清中Bcl-2表達(dá)明顯上調(diào)（P<0.01）；HE染色結(jié)果顯示，模型組有大量纖維組織增生及炎性細(xì)胞浸潤，各用藥組炎性細(xì)胞浸潤緩解；免疫組化實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與模型組比較，各用藥組與正常組促凋亡因子Bax表達(dá)水平比較明顯降低；各治療組中抗凋亡因子Bcl-2表達(dá)水平均有上調(diào)。結(jié)論：油桐花水煎劑對大鼠燒傷有明顯治療作用，與陽性藥物燒燙傷膏作用相似，可抑制細(xì)胞凋亡，有利于恢復(fù)燒燙傷創(chuàng)面。

【關(guān)鍵詞】 油桐花；燒燙傷；Bcl-2；Bax；凋亡

【中圖分類號】R285.5 【文獻(xiàn)標(biāo)志碼】 A 【文章編號】1007-8517（2018）14-0014-05

Abstract：Objective To study the effect of external application of water extract of Tung Flower flower on burned rats and explore its influence on the expression of Bcl-2 and Bax gene. Methods Sixty Wistar rats were randomly divided into 6 groups of 10 each. Rats with deep second degree burns were established in the other 5 groups except the normal group and treated with corresponding drugs. After the injury recovers， the camera photographs the affected area and processes the materials. The expression of Bcl-2 and Bax was detected by Elisa and immunohistochemistry. Results Elisa test showed that the expression of Bcl-2 in the serum of each drug group was significantly increased compared with the model group （P<0.01）. The results of HE staining showed that the model group had a large number of fibrous tissue proliferation and inflammatory cell infiltration， and the inflammatory cell infiltration in each drug group relieved. The results of immunohistochemistry showed that compared with the model group， the expression level of pro-apoptosis factor Bax was significantly decreased in each drug group and normal group； the expression level of anti-apoptosis factor Bcl-2 was up-regulated in each treatment group. Conclusion Tung oil flower decoction has obvious curative effect on burns in rats. Similar to the burn and burn cream on the market， it can inhibit cell apoptosis and is beneficial to the recovery of burn wounds.

Keywords：Tung Flower；Burn and Scald； Bcl-2； Bax； Apoptosis

中醫(yī)認(rèn)為燒燙傷屬于“燙火傷”范疇，常因外襲火毒，灼潰皮膚，皮肉焦卷，疼痛難忍甚至傷筋動骨，有些患者因火毒內(nèi)攻，出現(xiàn)較重的全身癥狀[1]。油桐花具有消腫、鎮(zhèn)痛、止血、生肌、促進(jìn)傷口愈合等作用[2]，在燒燙傷治療方面，有很好的療效[3-4]。作為凋亡家族中最主要成員，Bcl-2與Bax在燒傷中也有重要作用[5-6]。但目前未見桐子花水提物調(diào)節(jié)Bcl-2與Bax表達(dá)干預(yù)燒燙傷相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道。實(shí)驗(yàn)擬通過油桐花水提液調(diào)節(jié)凋亡蛋白Bcl-2、Bax干預(yù)燒燙傷，初步確定油桐花對燒燙傷的作用機(jī)制。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 實(shí)驗(yàn)動物 SPF級Wistar雄性大鼠60只，體重（150±20）g，適應(yīng)性喂養(yǎng)一周，購于長沙市天勤生物技術(shù)有限公司，動物許可證編號：SCXK（湘）2014-0011。

1.2 藥品與試劑 油桐花采自貴州省遵義市正安縣并由貴陽中醫(yī)學(xué)院孫慶文教授鑒定，無水乙醇（批號：20150601，重慶川東化工集團(tuán)有限公司），二甲苯（批號：20150508，重慶茂業(yè)化學(xué)試劑有限公司），燒燙傷膏（批號：20150601，長春海外制藥集團(tuán)有限公司），蘇木素染色液（批號：AR1180-1，博士德生物有限公司），伊紅染色液（批號：AR1180-2，博士德生物有限公司），Elisa檢測試劑盒（批號：CK-E30187R，上海研輝生物科技有限公司）。

1.3 主要儀器 FW177中草藥粉粹機(jī)（天津市泰斯特儀器有限公司），DZKW-4水浴鍋（北京中興偉業(yè)儀器有限公司），F(xiàn)A2204N電子天平（上海箐海儀器有限公司），BCD-219冰箱（上海上菱白富樂），RE-5210旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（上海亞榮生化儀器廠），KD-BM組織包埋機(jī)（浙江金華科迪），XSZ-HS3生物顯微鏡（重慶光學(xué)儀器廠），YD-335石蠟切片機(jī)（浙江金華益迪醫(yī)療設(shè)備廠）。

2 方法

2.1 藥材處理 將采摘的新鮮油桐花曬干，再用粉碎機(jī)將其粉碎，裝在塑料袋中封存，備用。

2.2 油桐花水提物制備 精取油桐花粉末25g，裝入盛有250mL蒸餾水的圓底燒瓶，浸泡30min，酒精燈加熱回流2h，紗布過濾3次，合并3次濾液，并將紗布中殘留的液體壓出。將濾液倒入蒸發(fā)皿中，水浴鍋加熱濃縮。按照上述步驟依次提取濃縮制得不同濃度（0.1g·mL-1、0.3g·mL-1、0.6g·mL-1）油桐花水提物，即高、中、低劑量組。

2.3 分組及造模 實(shí)驗(yàn)大鼠適應(yīng)喂養(yǎng)一周，隨機(jī)分為6組，分別為正常組、模型組、陽性對照組、高劑量組、中劑量組、低劑量組，每組10只。按照“從左到右，從上到下”標(biāo)記，用剪刀剪去長毛后，20%硫化鈉脫毛。脫毛24h后稱重，腹腔注射10%水合氯醛，待其充分麻醉后，使用臺式超級控溫燙傷儀對大鼠進(jìn)行燙傷，設(shè)置溫度為120℃，探頭實(shí)際溫度為90℃，燙傷時(shí)間為18s。燙傷后用紗布覆蓋或升高室內(nèi)溫度以保持大鼠體溫恒定，防止大鼠麻醉燙傷后體溫過低而死亡。燙傷3d后，剪取正常組和造模組背部燒傷皮膚組織，放入4%多聚甲醛溶液固定，做HE染色，觀察模型是否成功，造模成功病理切片顯示炎性浸潤嚴(yán)重。如圖1所示。

2.4 給藥 用棉簽蘸取相應(yīng)藥物對各組燒傷大鼠創(chuàng)面進(jìn)行均勻涂抹（模型組除外，高、中、低劑量組每次均涂抹1mL左右，其中陽性對照組為市面上銷售的燒燙傷膏），每日1次，連續(xù)3周[7-9]。陽性對照組給藥劑量約為0.13g·kg-1，高劑量用0.6g·mL-1油桐花水提液，中劑量用0.3g·mL-1油桐花水提液，低劑量用0.1g·mL-1油桐花水提液。

2.5 標(biāo)本采集處理 于用藥3周對各組大鼠背部進(jìn)行圖片給采集。大鼠斷頭取血，收集血液，離心機(jī)3000 rpm離心10min，取血清，標(biāo)記好-80℃保存。剪取各組大鼠背部燒傷皮膚組織，放入4%多聚甲醛溶液固定，備用。

2.6 Elisa試劑盒檢測 取出板條，室溫均衡20min。標(biāo)準(zhǔn)品孔與樣本孔加樣。加入辣根過氧化物酶100μL。封閉反應(yīng)孔，37℃水浴鍋60min。棄液體，濾紙拍干。洗滌液洗滌5次。每孔加入底物A、B各50μL，37℃避光孵育15min。加終止液50μL，450nm波長測定各孔吸光度值。計(jì)算樣品實(shí)際濃度。

2.7 HE染色和免疫組化 4%多聚甲醛固定24h后按常規(guī)梯度酒精脫水，二甲苯透明，浸蠟，然后使用自動包埋機(jī)把組織包埋成蠟塊。切片后常規(guī)二甲苯脫蠟，經(jīng)各級濃度乙醇脫水，然后進(jìn)行蘇木素-伊紅HE染色或者用檸檬酸鹽緩沖液加入微波爐進(jìn)行抗原修復(fù)，PBS洗3次，每次2min。滴加封閉液，37℃恒溫箱30min。棄多余液體，不洗。滴加適當(dāng)稀釋的兔1gG（一抗）4℃過夜。PBS洗3次，每次2min。滴加二抗，37℃恒溫箱30min。PBS洗3次，每次2min。DAB顯色，鏡下觀察，適時(shí)終止。自來水充分沖洗返藍(lán)5min。蘇木素輕度復(fù)染，室溫30s。自來水沖洗2min，80%，95%，100% ，100% Ⅱ的乙醇脫水各1min；二甲苯 Ⅰ 2min，二甲苯 Ⅱ 2min透明。中性樹脂封片，檢視。

2.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 使用SPSS 19.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料用均數(shù)加減標(biāo)準(zhǔn)差（x±s ）表示，采用單因素方差分析方法，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P<0.01為差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)有意義。

3 結(jié)果

3.1 大鼠燒燙傷創(chuàng)面恢復(fù)結(jié)果 不同劑量組油桐花水提物對大鼠燒傷創(chuàng)面恢復(fù)有明顯效果，與模型組比較傷口直徑明顯減小。如圖2所示。

3.2 Elisa檢測 燒傷大鼠血清中Bcl-2、Bax表達(dá)情況見表1，與正常組比較，模型組血清中Bcl-2表達(dá)顯著降低（P<0.01），中劑量組、低劑量組血清中Bcl-2表達(dá)顯著升高（P<0.01），高劑量組與陽性對照組血清中Bcl-2表達(dá)無差異。與模型組比較，不同油桐花水提物劑量組及陽性對照組大鼠血清中Bcl-2表達(dá)水平顯著上調(diào)（P<0.01）。

3.3 HE染色 模型組與正常組比較有大量纖維組織增生及炎性細(xì)胞浸潤，皮下組織變性、壞死，模型制備成功。中劑量組和低劑量組基本無炎性細(xì)胞浸潤，高劑量組和陽性對照組細(xì)胞輕度浸潤。如圖3所示。

3.4 免疫組化 與正常組比較，模型組促凋亡因子Bax表達(dá)水平顯著升高。與模型組比較，油桐花水提物高、中、低劑量組促凋亡因子Bax表達(dá)水平下調(diào)。與模型組比較，油桐花水提物高、中、低劑量組抑凋亡因子Bcl-2表達(dá)水平上調(diào)。如圖4、5所示。

4 討論

燒傷是日常較為常見的意外傷害，一般因火焰燒傷、熱接觸傷、熱液燙傷、電燒傷等造成嚴(yán)重炎癥反應(yīng)和疼痛，給人們的日常生活帶來嚴(yán)重危害。中醫(yī)藥在治療燒燙傷方面具有歷史悠久、經(jīng)驗(yàn)豐富的優(yōu)勢[10-11]。Bcl-2家族是細(xì)胞凋亡研究的一大熱點(diǎn)，在細(xì)胞凋亡調(diào)控中發(fā)揮了重要作用。Bcl-2和Bax分別是Bcl-2家族中最主要的抑制凋亡和促進(jìn)凋亡蛋白[12]。Bcl-2/Bax比率是啟動細(xì)胞凋亡的“分子開關(guān)”，細(xì)胞凋亡程度常用Bcl-2/Bax比率表示[13]。當(dāng)Bax形成同源二聚體時(shí)誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡；Bax與Bcl-2形成同源二聚體時(shí)抑制細(xì)胞凋亡[14-15]。試驗(yàn)及臨床中常通過調(diào)節(jié)這兩種蛋白表達(dá)來達(dá)到治療的目的。油桐花為油桐（Vernicia fordii）所結(jié)的花，油桐又名桐子，為大戟科油桐屬落葉小喬木，主要分布于四川、貴州、云南等省區(qū)[2，16]。油桐性味澀、微寒、有毒，歸肺、心經(jīng)，具有清熱解毒，生肌的功效，油桐全株皆可入藥，在民間有將其用于促進(jìn)傷口愈合、消腫、鎮(zhèn)痛、止血、消毒、麻醉等作用，油桐全身都是寶[4，16]，其開發(fā)利用價(jià)值，還需人們不斷研究。

造模3天HE染色結(jié)果證明顯示燒燙傷炎性浸潤嚴(yán)重，造模成功。用藥干預(yù)后HE染色結(jié)果證明，模型組大鼠皮膚組織內(nèi)有大量炎性細(xì)胞浸潤，燒傷大鼠模型制備成功，且油桐花水提物高、中、低劑量組皮膚組織內(nèi)炎性細(xì)胞浸潤有不程度的緩解，對燒傷有一定療效。免疫組化檢測結(jié)果表明，燒傷大鼠模型組皮膚組織中Bax表達(dá)較高、Bcl-2表達(dá)較低，而油桐花干預(yù)組大鼠皮膚組織中Bax表達(dá)較低、Bcl-2表達(dá)較高。由此可推測出，油桐花水提物可通過上調(diào)燒傷皮膚組織抑凋亡因子Bcl-2表達(dá)及下調(diào)燒傷皮膚組織促凋亡因子Bax表達(dá)，從而抑制細(xì)胞凋亡發(fā)生，促進(jìn)燒傷創(chuàng)面愈合。Elisa檢測結(jié)果說明，與正常組比較，模型組血清中Bcl-2表達(dá)顯著降低。與模型組比較，不同油桐花水提物劑量組及陽性對照組均能顯著上調(diào)大鼠血清中Bcl-2表達(dá)水平，增強(qiáng)皮膚組織抑制細(xì)胞凋亡作用。同時(shí)，在Elisa檢測過程中，中劑量組和低劑量組Bax表達(dá)不穩(wěn)定，不做統(tǒng)計(jì)；但其余4組表達(dá)是穩(wěn)定可用的，正常組為（5.18±0.20）pg·mL-1、模型組為（3.75±0.09）pg·mL-1、陽性對照組為（6.03±0.57）pg·mL-1、高劑量組為（4.67±0.41）pg·mL-1，與模型組比較，正常組、高劑量組、陽性對照組血清中Bax表達(dá)有差異。油桐花水提物可以抑制燒傷大鼠血清中細(xì)胞凋亡，從而調(diào)節(jié)外周血中細(xì)胞凋亡，從而緩解大鼠燒燙傷。說明Bax、Bcl-2對燒燙傷形成與發(fā)展具有重要作用，油桐花水提物可通過上調(diào)燒燙傷大鼠中抑凋亡蛋白Bcl-2，從而調(diào)節(jié)Bcl-2/Bax比率，平衡Bax、Bcl-2含量，緩解燒燙傷病情。同時(shí)為后續(xù)進(jìn)一步研究油桐花不同溶劑提取物，如醇提，乙酸乙酯提取、氯仿提取等，篩選出最佳干預(yù)燒燙傷溶劑提取物奠定一定實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

綜上，油桐花水提物可抑制燒傷大鼠細(xì)胞凋亡，恢復(fù)創(chuàng)面燒燙傷，與陽性藥物燒燙傷膏作用相似，大鼠皮膚燒燙傷會導(dǎo)致皮膚組織中細(xì)胞凋亡升高。油桐花水提物可以通過抑制細(xì)胞凋亡，從而促進(jìn)創(chuàng)面愈合，緩解燒燙傷病情。

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（收稿日期：2018-05-18 編輯：程鵬飛）