液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法快速測(cè)定蛇足石杉中的石杉?jí)A甲

李東芹，孫 玲

(華中農(nóng)業(yè)大學(xué)作物遺傳改良國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖北武漢 430070)

蛇足石杉，又名千層塔，為石杉科多年生蕨類植物，民間多用來治療跌打損傷、毒蛇咬傷和燒燙傷等。20世紀(jì)80年代，中國(guó)醫(yī)藥研究工作者從蛇足石杉中分離出強(qiáng)生物活性的石杉?jí)A甲，并引發(fā)其藥用價(jià)值的研究高潮[1]。石杉?jí)A甲是一種高效乙酰膽堿酯酶抑制劑，具有開發(fā)記憶效率的功能。臨床用于治療老年癡呆癥具有確切的療效[2-3]，還有文獻(xiàn)報(bào)道可用于重癥肌無力的治療[4-5]。由于人工合成很難得到純化學(xué)活性的石杉?jí)A甲，因此從石杉科植物中提取還是其主要來源。目前為止，石杉中石杉?jí)A甲基本都是用高效液相色譜法[6-8]來測(cè)定，液質(zhì)聯(lián)用法鮮見報(bào)道，有少量血槳中石杉?jí)A甲液質(zhì)分析的報(bào)道[9-10]。液相色譜法耗時(shí)長(zhǎng)、試劑用量大、靈敏度低、易受其他物質(zhì)干擾，對(duì)前處理工作要求較高，分析誤差大。受前人研究的啟發(fā)[11-12]，筆者建立了蛇足石杉中石杉?jí)A甲的液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜方法，樣品經(jīng)液相色譜分離后進(jìn)入質(zhì)譜儀，用石杉?jí)A甲的特征離子對(duì)243.2 > 210.1來進(jìn)行定量測(cè)定，為批量定量分析石杉?jí)A甲提供了更好的選擇。

1 材料與方法

1.1儀器API 4000 Qtrap 串聯(lián)三重四級(jí)桿線性離子阱質(zhì)譜儀(美國(guó)AB Sciex公司)；LC-20AD高效液相色譜儀(日本Shimadzu公司)；氮吹儀(OA-SYS，N-EVPTM111型)；Milli-pore 超純水儀(美國(guó)Millipore公司)。

1.2試材甲醇(色譜純)；超純水；石杉?jí)A甲(含量≥98%，Mw=242.3)；乙酸(色譜純)；1 mL醫(yī)用注射器；0.22 μm微孔濾頭(上海安普)。蛇足石杉采自安徽，為華中農(nóng)業(yè)大學(xué)植科院姚明鏡老師提供。

1.3試驗(yàn)方法

1.3.1樣品制備。精確稱量0.4 g左右的樣品，加氨水潤(rùn)濕后用適量體積氯仿萃取3～4次，每次約8 h。匯總萃取液，用氮吹儀吹干，用甲醇溶解后定容到25 mL。再用1 mL醫(yī)用注射器與0.22 μm過濾頭過濾后移入自動(dòng)進(jìn)樣器樣品瓶。

1.3.2標(biāo)準(zhǔn)溶液制備。精密稱取石杉?jí)A甲粉末1.4 mg，甲醇溶解后定容至50 mL，作為標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液。取適量的儲(chǔ)備液，用純甲醇逐步稀釋成濃度為70.000、35.000、17.500、8.750、4.375 μg/L 系列梯度的標(biāo)準(zhǔn)溶液，依次移入液相色譜自動(dòng)進(jìn)樣器樣品瓶。

1.3.3定量檢測(cè)條件。

1.3.3.1色譜條件。島津Shim-pack VP-ODS(150 L×2.0 mm，5 μm)色譜柱，樣品室溫度為室溫；流動(dòng)相：A為0.1%的乙酸水溶液，B為甲醇；流速為0.3 mL/min。梯度洗脫條件：A∶B，0 min 為 0∶100(V/V)，10 min為 20∶80(V/V)，10.01 min 為0∶100(V/V)，15 min為0∶100(V/V)，柱溫箱溫度為40 ℃，進(jìn)樣量為10 μL。

1.3.3.2質(zhì)譜條件。采用電噴霧(ESI)離子源，在正離子電離模式下選用多反應(yīng)離子監(jiān)測(cè)(MRM)掃描模式進(jìn)行測(cè)定。電噴霧電壓5 500 V；離子源溫度500 ℃；離子源輔助氣GS1/GS2氣流均為50 L/h。

2 結(jié)果與分析

2.1質(zhì)譜解析將濃度為100 μg/L的石杉?jí)A甲標(biāo)準(zhǔn)品通過針泵注射器直接進(jìn)入質(zhì)譜分析，先利用Q1全掃描確定石杉?jí)A甲的母離子為243.2(M+1)；再在一定能量下進(jìn)行二級(jí)質(zhì)譜分析(子離子掃描)，得到石杉?jí)A甲的碎片離子信息(圖1a)；選擇豐度較大的子離子210.1與母離子243.2組成多反應(yīng)監(jiān)測(cè)(MRM)離子對(duì)進(jìn)行定量分析。為了確保離子對(duì)243.3 >210.1 靈敏度高與信號(hào)穩(wěn)定，分別對(duì)解簇電壓(DP)、入口電壓(EP)、碰撞能量(CE)和碰撞出口電壓(CXP)等質(zhì)譜參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化，優(yōu)化后各參數(shù)分別為DP為70 V、EP為10 V、CE為40 V、CXP為13 V。

圖1b為石杉?jí)A甲在“1.3.3.2”質(zhì)譜條件下的選擇離子流圖，其色譜保留時(shí)間在1.46 min。

圖1 石杉?jí)A甲的二級(jí)質(zhì)譜圖(a)和總離子流圖(b)Fig.1 Secondary mass spectrum(a)and total ion current map(b)of Huperzine A

2.2標(biāo)準(zhǔn)曲線方程和檢出限將“1.3.2”項(xiàng)配制好的石杉?jí)A甲系列標(biāo)準(zhǔn)溶液按由稀到濃的順序依次放入自動(dòng)進(jìn)樣器樣品架，在“1.3.3”項(xiàng)試驗(yàn)條件下進(jìn)行聯(lián)機(jī)分析。以標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度為橫坐標(biāo)、色譜峰面積為縱坐標(biāo)，進(jìn)行線性回歸分析，得到線性方程為y=11 100x+2 490(r=0.998 9)，表明在濃度為4.375～70.000 μg/L線性良好。

將標(biāo)準(zhǔn)溶液逐步稀釋至11.750、0.875、0.438、0.146 μg/L，在“1.3.3”項(xiàng)試驗(yàn)條件下逐一分析，最終確定該方法的定量檢出限為0.438 μg/L，信噪比S/N為10。

2.3精密度試驗(yàn)將精確濃度為17.5 μg/L的標(biāo)準(zhǔn)溶液，重復(fù)進(jìn)樣5次，測(cè)定結(jié)果分別為18.2、18.1、17.9、17.7、18.4 μg/L。經(jīng)計(jì)算得5次測(cè)定結(jié)果的變異系數(shù)為1.5%，精密度良好。

2.4回收率試驗(yàn)精確稱量已知石杉?jí)A甲含量的蛇足石杉樣品，分別加入10、30、50 μg/L濃度水平的石杉?jí)A甲標(biāo)準(zhǔn)溶液，按“1.3.2”方法進(jìn)行樣品制備，每個(gè)濃度進(jìn)行3個(gè)樣本分析，與標(biāo)準(zhǔn)曲線同時(shí)測(cè)定，考察樣品回收率。結(jié)果發(fā)現(xiàn)(表1)，在這3個(gè)濃度下，石杉?jí)A的回收率為96.0%～102.3%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)為2.18%。

表1 石杉?jí)A甲的回收率及RSD

2.5方法應(yīng)用分別稱取蛇足石杉的全株、葉、莖、根，按“1.3.1”項(xiàng)方法進(jìn)行前處理，在“1.3.3”項(xiàng)試驗(yàn)條件下測(cè)定，通過線性方程分別計(jì)算得到其石杉?jí)A甲的含量分別為5.331 4、1.798 2、0.570 3、0.292 0 μg/g。

3 小結(jié)與討論

與以往常用的液相色譜檢測(cè)方法相比，該研究建立的液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法具有分析速度快、靈敏高、選擇性好等特點(diǎn)。它將色譜的高分離能力和質(zhì)譜的高靈敏檢測(cè)能力相結(jié)合，實(shí)現(xiàn)優(yōu)勢(shì)互補(bǔ)，因而大大提高了檢測(cè)的靈敏度和選擇性。樣品前處理操作簡(jiǎn)單，試劑用量少，既經(jīng)濟(jì)又環(huán)保。該方法可為開發(fā)和利用蛇足石杉這一藥用植物資源提供有力的技術(shù)支持和幫助。