冬蟲夏草對VDR沉默大鼠卵巢顆粒細(xì)胞CYP19表達(dá)的影響

秦忠 李文 管連城

【摘 要】 目的：探討冬蟲夏草對Vitamin D Receptor（VDR） 沉默大鼠卵巢顆粒細(xì)胞中CYP19mRNA表達(dá)的影響。方法：將大鼠卵巢顆粒細(xì)胞隨機(jī)分為6個組：1為空白對照組，2為基因沉默陰性對照組，3為VDR沉默組，4為VDR沉默+已烯雌酚組，5為VDR沉默+維生素D組，6為VDR沉默+蟲草含藥血清處理組。采用熒光定量PCR檢測法檢測各組大鼠卵巢顆粒細(xì)胞中CYP19mRNA表達(dá)。結(jié)果：與對照組、基因沉默陰性對照組相比，VDR沉默組CYP19mRNA表達(dá)明顯下調(diào)（P<0.05），VDR沉默+己烯雌酚組、VDR沉默+VD組、VDR沉默+冬蟲夏草含藥血清組與VDR沉默組比較，CYP19mRNA表達(dá)明顯上調(diào)（P<0.05）。結(jié)論：冬蟲夏草可以通過調(diào)節(jié)CYP19產(chǎn)生類維生素D樣作用，對大鼠的卵巢顆粒細(xì)胞分泌功能產(chǎn)生影響，同時通過調(diào)節(jié)維生素D軸對大鼠的卵巢產(chǎn)生保護(hù)作用。

【關(guān)鍵詞】 卵巢顆粒細(xì)胞；冬蟲夏草；CYP19；VDR沉默；維生素D

【中圖分類號】R285.5 【文獻(xiàn)標(biāo)志碼】 A 【文章編號】1007-8517（2018）09-0021-03

卵巢作為女性的生殖腺，在中樞神經(jīng)系統(tǒng)-下丘腦-垂體軸的調(diào)控之下，完成排卵和內(nèi)分泌的功能[1]。女性進(jìn)入圍絕經(jīng)期以后，卵泡數(shù)量逐漸減少，引起骨質(zhì)疏松、抑郁、心血管疾病等，嚴(yán)重影響婦女的身心健康和生活質(zhì)量[2]。目前西醫(yī)治療主要采用激素替代療法，長期應(yīng)用不良反應(yīng)較為突出。中醫(yī)藥補(bǔ)腎益精療法有其獨(dú)特優(yōu)勢，其機(jī)制有待進(jìn)一步闡明。近年對Vitamin D Receptor（VDR） 和1a-羥化酶基因沉默動物不斷深入研究發(fā)現(xiàn)，維生素D對生殖功能的影響發(fā)揮作用。VDRmRNA表達(dá)已被證實(shí)是在卵巢[3]，在混合卵巢細(xì)胞及凈化的卵巢顆粒細(xì)胞培養(yǎng)物中對性激素類固醇生成起重要作用[3]。芳香化酶在雌激素合成過程中具有重要作用，無論雄性或雌性小鼠，VDR敲除后性腺芳香化酶（P450arom）活性低下，CYP19表達(dá)明顯降低。

維生素D能直接調(diào)節(jié)CYP19基因表達(dá)，從而調(diào)控雌激素分泌[4]。維生素D通過25-羥基維生素D 1-羥化酶（CYP27B1）在肝臟和腎臟中的活性形式（1，25-二羥維生素D）進(jìn)行修飾，激活的維生素D通過維生素D受體（VDR）產(chǎn)生作用，這個系統(tǒng)在國外稱作維生素D軸[5]（ Vitamin D system），我國稱其為維生素D軸（Vitamin D axis）[6-13]。腎精虧損將導(dǎo)致生殖功能發(fā)生障礙。筆者中藥能使大鼠卵巢重量明顯增長。補(bǔ)腎法治療可以提高體內(nèi)雌激素水平，增強(qiáng)各激素靶器官的反應(yīng)性[14]。

冬蟲夏草是一種含有氨基酸、甘露醇、核苷、多糖、甾醇等多種活性成分的名貴中藥材，具有補(bǔ)腎填精、納氣平喘的功效。冬蟲夏草具有調(diào)節(jié)雌激素分泌作用[15]，腎精虧損將導(dǎo)致生殖功能發(fā)生障礙。筆者基于前期文獻(xiàn)及動物實(shí)驗(yàn)研究，探討冬蟲夏草對VDR沉默卵巢顆粒細(xì)胞CYP19mRNA表達(dá)的影響，揭示其對卵巢功能的保護(hù)作用并提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物 清潔級SD雌性36只，大鼠購買于重慶解放軍第三軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心，體重約150～180 g。許可證號：SCXK-（軍）20120011。

1.2 試劑及儀器 主要儀器：實(shí)時熒光定量PCR儀（Eppendorf，德國），電泳儀（Bio-rad，美國），凝膠成像儀穩(wěn)壓DNA電泳儀（Tianneng，美國），GDS8000凝膠掃描系統(tǒng)（UVP，美國），超凈工作臺（蘇州凈化設(shè)備公司），電熱壓力蒸汽消毒器（浙江紹興醫(yī)療器械總廠），高速臺式離心機(jī)（BACKMAN CS-15R，美國Beckman公司）。主要試劑：超純RNA提取試劑盒、HiFiScript cDNA第一鏈合成試劑盒、2×EsTaqMasterMix（含染料）（北京康為世紀(jì)生物科技有限公司）。

1.3 方法

1.3.1 顆粒細(xì)胞培養(yǎng) 3～4周健康雌性SD大鼠，麻醉后取雙側(cè)卵巢，在解剖顯微鏡下剝離周圍脂肪組織，PBS沖洗后剪碎，用0.2%膠原酶及與0.25%胰蛋白酶消化25～30 min，加入DMEM/F12終止消化，以1000 r /min轉(zhuǎn)速離心5min后去除上清液，過篩后接種于25 cm2培養(yǎng)瓶，加入含10%的胎牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)液，置于37℃+5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待培養(yǎng)的顆粒細(xì)胞（GC）密度適中進(jìn)行傳代。

1.3.2 大鼠卵巢顆粒細(xì)胞藥物模型構(gòu)建 將正常卵巢顆粒細(xì)胞及轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞分別接種于6孔細(xì)胞培養(yǎng)板，待細(xì)胞貼壁后進(jìn)行相應(yīng)處理。對照組、基因沉默陰性對照組、VDR沉默組按照常規(guī)培養(yǎng)的方式加入含15%血清的DMEM-F12完全培養(yǎng)基[16]。已烯雌酚組、維生素D組、蟲草素處理組分別于正常大鼠卵巢顆粒細(xì)胞中加入含已烯雌酚、維生素D、高劑量蟲草素的含藥血清的培養(yǎng)基，干預(yù)處理24 h后進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。VDR沉默+已烯雌酚組、VDR沉默+維生素D組、VDR沉默+蟲草素處理組分別于VDR沉默轉(zhuǎn)染后的卵巢顆粒細(xì)胞加入含已烯雌酚、維生素D、高劑量蟲草素的含藥血清的培養(yǎng)基，干預(yù)處理24 h后進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.3.3 實(shí)驗(yàn)分組 1：對照組；2：基因沉默陰性對照組；3：VDR沉默組；4：VDR沉默+已烯雌酚組；5：VDR沉默+維生素D組；6：VDR沉默+蟲草含藥血清處理組。采用熒光定量PCR檢測法檢測VDR沉默大鼠卵巢顆粒細(xì)胞CYP19 mRNA表達(dá)。

1.3.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 分析用SPSS 22.0統(tǒng)計(jì)軟件，計(jì)量資料用（x[TX-*3]±s）表示，比較6組間的連續(xù)變量用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD法，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與對照組、基因沉默陰性對照組相比，VDR沉默組CYP19mRNA表達(dá)明顯下調(diào)（P<0.05），VDR沉默+己烯雌酚組、VDR沉默+VD組、VDR沉默+冬蟲夏草含藥血清組與VDR沉默組比較，CYP19mRNA表達(dá)明顯上調(diào)（P<0.05）。

3 討論

中醫(yī)認(rèn)為腎藏精主生殖，生殖功能是通過腎中先天之精激發(fā)而產(chǎn)生的，卵巢功能低下就其本質(zhì)而言即為腎精不足，故而臨床對于卵巢功能低下的治療多從補(bǔ)腎填精入手。由于中醫(yī)與現(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究對象的同一性，現(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究證明維生素D缺乏影響卵巢的組織形態(tài)及性腺分泌功能，實(shí)驗(yàn)表明維生素D在調(diào)節(jié)卵巢活動中發(fā)揮重要作用。最新研究發(fā)現(xiàn)，維生素D不僅僅是維生素，還是一種激素，稱之為維生素D內(nèi)分泌系統(tǒng)[17]。該系統(tǒng)包括維生素D、代謝相關(guān)的酶以及維生素D作用的受體（VDR）[18]。除了鈣磷代謝外，維生素D在調(diào)控細(xì)胞有絲分裂，抑制多種組織細(xì)胞增殖、分化等方面都發(fā)揮較大作用。維生素D還有調(diào)節(jié)免疫、糖代謝、調(diào)控腎素血管緊張素醛固酮系統(tǒng)（RAS）等多種生物學(xué)作用，作用廣泛，在多個系統(tǒng)中發(fā)揮重大作用[8-9]。在下丘腦垂體軸的調(diào)控下，卵巢完成排卵和分泌性激素的功能。女性進(jìn)入圍絕經(jīng)期以后，卵泡數(shù)量逐漸減少，可能誘發(fā)心血管疾病以及骨質(zhì)疏松，嚴(yán)重影響婦女的身心健康和生活質(zhì)量。目前西醫(yī)治療主要采用激素替代療法，長期應(yīng)用有很多不良反應(yīng)。中醫(yī)藥補(bǔ)腎填精療法有其獨(dú)特優(yōu)勢，其療效在臨床已經(jīng)逐步得到驗(yàn)證，而其機(jī)制有待進(jìn)一步闡釋。近年對VDR和1a-羥化酶基因沉默動物不斷深入研究，可以發(fā)現(xiàn)維生素D對生殖功能的影響發(fā)揮作用。VDRmRNA表達(dá)已被證實(shí)是在卵巢，在混合卵巢細(xì)胞及凈化的卵巢顆粒細(xì)胞培養(yǎng)物中對性激素類固醇生成起作重要作用。本研究采用熒光定量PCR檢測法檢測冬蟲夏草對VDR沉默大鼠卵巢顆粒細(xì)胞中CYP19mRNA表達(dá)的影響，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與對照組、基因沉默陰性對照組相比，VDR沉默組CYP19mRNA表達(dá)明顯下調(diào)（P<0.05），VDR沉默+己烯雌酚組、VDR沉默+VD組、VDR沉默+冬蟲夏草含藥血清組與VDR沉默組比較，CYP19mRNA表達(dá)明顯上調(diào)（P<0.05）。從試驗(yàn)結(jié)果可以看出，冬蟲夏草具有一定的調(diào)節(jié)維生素D軸的功能。

4 結(jié)論

綜上所述，冬蟲夏草對卵巢顆粒細(xì)胞的保護(hù)與促進(jìn)作用與維生素D、己烯雌酚相似，動物實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí)冬蟲夏草對卵巢功能的保護(hù)作用通過維生素D軸發(fā)揮效應(yīng)，冬蟲夏草可以通過調(diào)節(jié)CYP19產(chǎn)生類維生素D樣作用，對大鼠的卵巢顆粒細(xì)胞分泌功能產(chǎn)生影響，同時通過調(diào)節(jié)維生素D軸對大鼠的卵巢產(chǎn)生保護(hù)作用。但導(dǎo)致卵巢功能低下的因素眾多，冬蟲夏草是否還可以通過其他機(jī)制來改善卵巢功能，還有待更進(jìn)一步的研究。

參考文獻(xiàn)

[1]姚曉. 腦內(nèi)催乳素釋放肽在電針調(diào)整去卵巢大鼠下丘腦—垂體—卵巢軸中的作用 [D].上海：復(fù)旦大學(xué)， 2004.

[2]關(guān)瑞錦， 胡錫衷， 林立芳， 等. 增齡與性激素變化規(guī)律的對照研究 [J]. 中國老年學(xué)， 1994（1）： 15-6.

[3]PARIKH G， VARADINOVA M， SUWANDHI P， et al. Vitamin D regulates steroidogenesis and insulin-like growth factor binding protein-1（IGFBP-1） production in human ovarian cells [J]. Hormone and metabolic research = Hormon- und Stoffwechselforschung = Hormones et métabolisme， 2010， 42（10）： 754.

[4]ENJUANES A， GARCIAGIRALT N， SUPERVIA A， et al. Regulation of CYP19 gene expression in primary human osteoblasts： effects of vitamin D and other treatments [J]. European Journal of Endocrinology， 2003， 148（5）： 519.

[5]COZZOLINO M， KETTELER M， ZEHNDER D. The vitamin D system： a crosstalk between the heart and kidney [J]. European journal of heart failure， 2010， 12（10）： 1031-41.

[6]柴藝匯，高潔，秦忠，等. 從類固醇激素生成探討維生素D軸與腎虛證相關(guān)性 [J]. 時珍國醫(yī)國藥， 2014（9）： 2286-7.

[7]陳偉，柴藝匯，王煥珍，等. 基于ARROWSMITH探討淫羊藿與維生素D軸功能的潛在相關(guān)性 [J]. 時珍國醫(yī)國藥， 2016（2）： 499-500.

[8]陳雨佳，康櫻，管連城，等. 維生素D軸：補(bǔ)腎治療慢性牙周炎的新靶點(diǎn) [J]. 亞太傳統(tǒng)醫(yī)藥， 2016（24）： 46-8.

[9]陳云志，陳家旭，秦忠，等. 從維生素D軸探討巴戟天抗抑郁癥的作用機(jī)制 [J]. 西部中醫(yī)藥， 2017（10）： 128-30.

[10]陳云志，管連城，高潔，等. 維生素D軸：中醫(yī)補(bǔ)腎方藥的潛在靶點(diǎn) [J]. 時珍國醫(yī)國藥， 2017（9）： 2210-2.

[11]管連城，高潔，柴藝匯，等. 基于Arrowsmith探討五味子與維生素D軸功能的潛在相關(guān)性 [J]. 遼寧中醫(yī)雜志， 2017（4）： 738-40.

[12]管連城，高潔，柴藝匯，等. 從雌激素生成探討維生素D軸與“腎藏精，主生殖”功能的相關(guān)性 [J]. 遼寧中醫(yī)雜志， 2017（8）： 1634-6.

[13]管連城，李文，陳偉，等. 人參與維生素D軸的潛在相關(guān)性研究 [J]. 中華中醫(yī)藥學(xué)刊， 2017（8）： 2078-80.

[14]李炳如， 佘運(yùn)初. 補(bǔ)腎藥對下丘腦—垂體—性腺軸功能影響 [J]. 中醫(yī)雜志， 1984（7）： 65-7.

[15]姚紅， 黃少華， 蘇子仁， 等. 葛根蟲草軟膠囊對大鼠實(shí)驗(yàn)性骨質(zhì)疏松的影響 [J]. 廣東藥學(xué)院學(xué)報(bào)， 2005（5）： 41-2，7.

[16]趙笛. 基于FOXO3a轉(zhuǎn)錄因子探討二仙湯對順鉑損傷大鼠卵巢顆粒細(xì)胞的保護(hù)機(jī)制 [D].北京：北京中醫(yī)藥大學(xué)， 2017.

[17]HOLICK M F. Vitamin D： A millenium perspective [J]. Journal of cellular biochemistry， 2003， 88（2）： 296-307.

[18]霍本剛， 何婭妮. 活性維生素D的再認(rèn)識——多種生物學(xué)功能 [J]. 腎臟病與透析腎移植雜志， 2009， 18（3）： 249-52.

（收稿日期：2018-03-19 編輯：陶希睿）