苦參不同炮制品生物總堿含量測定及HPLC指紋圖譜研究

常楚瑞 陸平祝 龍慶德 冉啟軍 王曉麗 許德勇

【摘 要】 目的：對苦參不同炮制品的生物總堿含量進(jìn)行測定，并建立苦參生物堿HPLC指紋圖譜。方法：采用紫外分光光度法進(jìn)行苦參生物堿含量測定，采用高效液相色譜法，以Inertsil NH2（5 μm，4.6 mm×250 mm）為色譜柱，乙腈-無水乙醇-3%磷酸（84∶10∶6）為流動相，流速為1.0mL/mim，檢測波長為210 nm，柱溫為30 ℃。并利用中藥色譜指紋圖譜相似度評價(jià)系統(tǒng)A版軟件進(jìn)行圖譜對比。結(jié)果：麩制品生物總堿含量最高，為3.955%；炒炭品生物總堿含量最低，為2.604%；各炮制品共有峰的相對保留時(shí)間RSD<1.50%，峰面積RSD>26.0%，苦參炮制品指紋圖譜相似度在0.231%～0.962%。結(jié)論：苦參中主要生物堿成分差異不大，但其量有變化，炮制品的品質(zhì)不一致，此方法較全面地反映苦參不同炮制品的差異，可用于評價(jià)苦參炮制品的質(zhì)量。

【關(guān)鍵詞】 苦參；苦參生物堿；炮制；指紋圖譜；質(zhì)量控制

【中圖分類號】R284.1 【文獻(xiàn)標(biāo)志碼】 A【文章編號】1007-8517（2018）04-0014-04

Abstract：Objective Determination of different biologicalcontent of Matrine alkaloids， and establish the HPLC fingerprint of alkaloids in Sophora flavescens Ait.Methods Determination of alkaloids content by UV spectrophotometry，use the method of HPLC，a Inertsil NH2 （5μm， 4.6 ×250mm） phase column was used with mobile phase consisited of acetonitrle-anhydrod alcohol- 3% acid solution phosphorie （84∶10∶6） at a flow rate ofthe mL/min. the wavelength of detector was hanol： 3% phosphoric acid as mobile phase， the flow rate is 1.0mL/mim， the detection wavelength is 210nm，the column temperature is nm.the column at 30℃.The experimental data were analyzed by computer aided similarity evaluation software.Results Bran products total alkaloids content was the highest for 3.955%， content of total alkaloids was the lowest which was 2.604%.There are various processed products peak relative retention time RSD<1.50%，and relative retention peak area RSD>26.0%，Sophora processed products fingerprint similarity in 0.231%～0.962%. Conclusion The main alkaloids in Sophora little difference，but its content has changed and inconsistent quality.This method is more comprehensive response to the difference between different Sophora processed products can be used to evaluate the quality of processed products Sophora.

Keywords：Sophora flavercens Ait.； Sophora alkaloids； Processing； Fingerprint； Quality control

苦參是豆科植物苦參Sophora flavercens Ait.的干燥根[1] 。一般在春天和秋天采挖，去除掉苦參的根頭及小支根，洗干凈，干燥后趁鮮切片。可用于熱痢、黃疸尿閉、便血、赤白帶下、陰腫陰癢、皮膚瘙癢、濕疹、外治滴蟲性陰道炎等病癥，是我國的常用傳統(tǒng)中藥材。由于中藥材大多都是生藥，多附有泥土或其他異物，或有異味、有毒性、潮濕等不宜于保存，經(jīng)過一定的炮制處理，可以達(dá)到使藥物純凈、矯味、降低毒性和干燥而不變質(zhì)，加強(qiáng)藥物效用的目的，減除毒性或副作用，便于儲存和便于服用[2-4]。筆者對苦參藥材的不同炮制方法進(jìn)行研究并測定苦參生物堿含量，采用高效液相色譜法對苦參藥材提取物的5種不同生物堿進(jìn)行分離及用中藥色譜指紋圖譜相似度評價(jià)系統(tǒng)A版軟件進(jìn)行圖譜對比，為苦參不同炮制原理及炮制品質(zhì)量評價(jià)提供合理的依據(jù)。

1 儀器與材料

1.1 儀器 METTLERTOLEDO電子天平（梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司）；AS系列超聲波清洗機(jī)（天津奧特賽恩斯儀器有限公司）；Q-250B高速多功能粉碎機(jī)（上海冰都電器有限公司）；HH-Z數(shù)顯恒溫水浴鍋（常州奧華儀器有限公司）；DROGON移液槍（上海恒奇有限公司）；Agilent1200高效液相色譜儀（LC-2010c），G1314B VWD檢測器，“中藥色譜指紋圖譜相似度評價(jià)系統(tǒng)”（A版）數(shù)據(jù)處理軟件。

1.2 藥品和試劑 苦參根采購于藥材市場，經(jīng)貴州醫(yī)科大學(xué)藥用植物與生藥學(xué)教研室常楚瑞副教授鑒定為苦參Sophora flavercens Ait.的干燥根；苦參堿（批號：110805-200508）、氧化苦參堿（批號：110780-201007）、槐定堿標(biāo)準(zhǔn)品（批號：110784-200804）購自中國食品藥品檢定研究院；槐果堿（批號：Z25A16L17029）、氧化槐果堿（批號：Z18S6B3547）標(biāo)準(zhǔn)品購自上海源葉生物科技有限公司；乙腈、乙醇為色譜純，水為自制超純水；甲醇、磷酸、三氯甲烷等試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 對照品溶液的制備 精密稱取槐果堿、苦參堿、氧化苦參堿、槐定堿、氧化槐果堿對照品，用甲醇溶解并制成含槐果堿0.02288 mg/mL、苦參堿0.0832 mg/mL、氧化苦參堿0.4912 mg/mL、槐定堿0.1044 mg/mL、氧化槐果堿0.3762 mg/mL的對照品儲備液。

2.2 炮制方法 S1生品：取苦參藥材150 g，用粉碎機(jī)打成細(xì)粉，過3號篩（60目）后封存。

S2炒黃品：取苦參生品150 g，置于熱鍋中，用文火炒至較原色加深時(shí)，取出稱量得143.4 g，打成細(xì)粉，過3號篩（60目）后封存?zhèn)溆谩?/p>

S3炒焦品：稱取150 g苦參生品，置于熱鍋中，用文火加熱，不斷翻炒，炒至藥物表面焦褐色并具有焦香氣，取出稱量得135.8 g，打成粉末，過3號篩（60目）后封存。

S4炒炭品：稱取150 g苦參置于熱鍋中，用武火加熱，不斷翻動，炒至表面焦黑色，內(nèi)部焦褐色時(shí)，取出稱量得123.0 g，打成粉末，過3號篩（60目）后封存。

S5醋炙品：按照苦參：醋（5∶1，g/v），取苦參150 g，加醋拌勻，悶透，待醋被吸進(jìn)盡后，取出稱量得200.0 g，置于熱鍋內(nèi)，用文火炒至微干，取出干燥，打成細(xì)粉，過3號篩（60目）后封存。

S6酒炙品：按照苦參：酒（3∶1，g/v），取150 g苦參片加酒攪拌，使藥材全部悶透，待酒被吸進(jìn)盡后，取出稱量得190.4 g，置于熱鍋中炒干，打成細(xì)粉，過3號篩（60目）后封存。

S7麩炒品：按照苦參：麩皮片（1∶4，g/g），稱取200 g麩皮，撒于熱鍋中，加熱至冒煙時(shí)，放入50 g苦參片，迅速翻動，炒至藥材表面顏色變深時(shí)，溢出焦香氣，取出篩去麩皮后稱量得45.8 g，打成細(xì)粉，過3號篩（60目）后封存。

S8蒸炙品：取150 g苦參片置于蒸制容器里隔水加熱，蒸6 h后取出干燥，打成細(xì)粉，過3號篩（60目）后封存。

2.3 供試品溶液的配制 分別取苦參的不同炮制品約0.3 g，精密稱重后加到具塞錐形瓶中，精密加入濃氨試液1 mL，加入三氯甲烷20 mL。塞上瓶塞，進(jìn)行超聲處理（功率250 w，頻率33 kHZ）30 min，取出冷卻至室溫，補(bǔ)足重量至20mL，搖勻，過濾，精密量濾液5 mL，經(jīng)2 g的無水硫酸鈉過濾，取續(xù)濾液在85℃水浴鍋蒸干，用甲醇溶解定容到10 mL，備用。

2.4 紫外分光光度法測定苦參炮制品生物總堿含量與分析

2.4.1 線性考察 用微量進(jìn)樣器精密吸取苦參堿對照品溶液0、100、150、200、250、300 μL分別加入25 mL具塞試管中，85℃水浴蒸干，加入溴麝香草酚藍(lán)緩沖液6 mL（pH=7.6）+CHCl36 mL，振搖，分層，以對照品溶液0 mL加入溴麝香草酚藍(lán)緩沖液6 mL（pH=7.6）+CHCl36 mL試管為空白，在416 nm波長處測定其吸光度。求出回歸方程。結(jié)果得到苦參總堿濃度A與吸光度X關(guān)系曲線的回歸方程A=0.05629X-0.00356，相關(guān)系數(shù)r2=0.9993。結(jié)果表明本實(shí)驗(yàn)苦參堿在2.55～6.8 μg/mL有良好的線性關(guān)系。

2.4.2 精密度實(shí)驗(yàn) 分別取苦參堿對照品100 μL加到5個(gè)25 mL具塞試管中，同2.4.1項(xiàng)下方法進(jìn)行測定其吸光度，連續(xù)測得5次，結(jié)果平均RSD為0.68%。

2.4.3 重復(fù)性實(shí)驗(yàn) 精密稱定同一樣品苦參粉末 6份分別為：0.3003、0.3006、0.3009、0.3004、0.3005 g，同2.3項(xiàng)下提取苦參生物總堿，同2.4.1項(xiàng)下方法進(jìn)行測定其吸光度，生物總堿平均含量為0.3430 mg/g，RSD為0.97%。

2.4.4 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn) 精密稱定供試品的溶液，每隔30 min測定一次，持續(xù)4 h，生物總堿平均含量為0.3421 mg/g，計(jì)算得其RSD為1.9%，表明供試品溶液在4 h內(nèi)穩(wěn)定性好。

2.5 炮制品苦參生物堿含量測定 吸取苦參總堿提取物100 μL，按照2.4.1測定吸光度，樣品結(jié)果見表1。 從表1得出苦參炮制品中各生物總堿含量大小為：炒炭品<醋炙品<蒸制品<炒黃品<炒焦品<生品<酒炙品<麩炒品，說明苦參不同炮制方法對苦參藥材提取物的生物總堿有影響，且麩炒品的苦參生物總堿含量最高，酒炙品次之。

2.6 苦參炮制品HPLC指紋圖譜方法學(xué)考察

2.6.1 色譜條件 Agilent1200 Inertsil NH2色譜柱（5 μm，4.6×250 mm）；流動相-乙腈-無水乙醇-3%磷酸（84∶10∶6）；檢測波長為210 nm；流速為1.0 mL/mim；柱溫：30℃；進(jìn)樣量：20 μL。

2.6.2 精密度試驗(yàn) 取供試品溶液20 μL，按照2.2.1色譜條件，連續(xù)進(jìn)樣5次，結(jié)果5個(gè)主要色譜峰的相對保留時(shí)間及相對峰面積RSD均不大于1.39%，符合色譜峰指紋圖譜要求，精密度良好。

2.6.3 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取供試品溶液20 μL，按照2.2.1色譜條件，分別在0、2、4、8、10 h檢測指紋圖譜，結(jié)果5個(gè)主要色譜峰的相對保留時(shí)間及相對峰面積的RSD均不大于2.47%，符合色譜峰指紋圖譜要求，表明10 h內(nèi)供試品溶液穩(wěn)定性好。

2.6.4 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一炮制品5份，精密稱定0.3002、0.3007、0.3004、0.3001、0.3006 g按照2.3供試品方法制備溶液，按照2.6.1色譜條件，結(jié)果5個(gè)主要色譜峰的相對保留時(shí)間及相對峰面積的RSD均不大于1.97%，符合色譜峰指紋圖譜要求，表明該方法穩(wěn)定、重現(xiàn)性好。

2.6.5 苦參炮制品HPLC指紋圖譜構(gòu)建與分析 幾種苦參炮制品按“2.3”的方法制備供試品溶液，測定指紋圖譜，圖2為某一樣品（酒炙品）在60 min的HPLC圖譜，共有11個(gè)峰，色譜分離度較好。將幾種苦參炮制品的指紋圖譜數(shù)據(jù)按照中位數(shù)對照圖譜生成方法導(dǎo)入“中藥色譜指紋圖譜相似度評價(jià)系統(tǒng)”，參照圖譜為S1，選取時(shí)間窗寬度為0.3 min，采用中位數(shù)法計(jì)算，選定5個(gè)特征峰進(jìn)行多點(diǎn)校正，自動匹配，生成的對照圖譜R，通過圖譜的比較，確定11個(gè)色譜峰為共有峰，圖3為不同炮制品的HPLC指紋圖譜。

不同炮制品的5個(gè)生物堿的相對保留時(shí)間和相對峰面積為表2、表3，5個(gè)對照品HPLC圖譜見圖4和不同苦參炮制品HPLC指紋圖譜見圖3。炒炭品1號峰為槐果堿和2號峰為苦參堿的峰面積較大，且出現(xiàn)了g1和g2的色譜峰；以及炒焦品的3號峰為氧化槐果堿和5號峰為氧化苦參堿的峰面積較大。表明炮制品中炒炭品1號（槐果堿）和2號（苦參堿）含量均增加；炒焦品中3號（氧化槐果堿）和5號峰（氧化苦參堿）含量均增加，共有峰的相對保留時(shí)間RSD均小于1.50%，符合指紋圖譜要求。峰面積RSD為27%～154.52%，炮制品間5種生物堿的量有較大變化。

將生品和幾種苦參炮制品的指紋圖譜數(shù)據(jù)按照平均數(shù)對照圖譜生成方法導(dǎo)入“中藥色譜指紋圖譜相似度評價(jià)系統(tǒng)”，自動匹配成功后生成對照圖譜（見圖2），進(jìn)行相似度評價(jià)，將S1定為1.000，得出不同苦參炮制方法的指紋圖譜相似度見表4。炮制品中炒炭品相似度為0.385%，其它炮制品相似度均大于0.720%，說明各批次間炮制品相似度差異較大。

3 討論

采用紫外分光光度法進(jìn)行總生物堿含量測定，苦參生物總堿含量結(jié)果顯示麩炒品含量最高，認(rèn)為苦參用輔料麩皮炒后利于生物堿的提取，炒炭品比生品含量低，可能由于溫度過高又會使它生物堿含量被破壞。

不同苦參炮制品HPLC指紋圖譜中，S4炒焦品出現(xiàn)g1和g2峰，認(rèn)為炒炭品有些化學(xué)成分會增加，具體出現(xiàn)了哪些化學(xué)成分的變化，尚有待進(jìn)一步研究。

在HPLC指紋圖譜研究過程中，各色譜圖基線相對平穩(wěn)，各個(gè)炮制品色譜峰分離良好，并且各峰面積較為適宜。本文考察了苦參炮制品指紋圖譜研究，利用指紋圖譜相似度評價(jià)系統(tǒng)軟件進(jìn)行對比分析各個(gè)炮制品間的圖譜比較，其中炒炭品相似度相對較小。結(jié)果表明苦參生品及7種炮制品之間指紋圖譜存在一定差異，主要表現(xiàn)在化學(xué)成分含量的增加或者減少，說明苦參不同炮制方法對其含主要化學(xué)成分只有量變無質(zhì)變影響。因此，本試驗(yàn)可以為苦參炮制工藝的優(yōu)化提供參考依據(jù)。

綜上，苦參生品及7種炮制品之間指紋圖譜存在一定差異，主要表現(xiàn)在化學(xué)成分含量的增加或者減少。參中主要生物堿成分差異不大，但其量有變化，炮制品的品質(zhì)不一致，此方法較全面地反應(yīng)苦參不同炮制品的差異，可用于評價(jià)苦參炮制品的質(zhì)量。

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