響應(yīng)面法優(yōu)化白刺花總黃酮提取工藝研究

陽敬　蘭慧　左強(qiáng)

【摘 要】 目的：優(yōu)選白刺花中總黃酮的最佳提取工藝。方法：采用響應(yīng)面分析法優(yōu)化，以總黃酮提取率為評(píng)價(jià)指標(biāo)，在考察單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，選取乙醇濃度、加液量、提取溫度和提取時(shí)間為自變量，利用Design-Expert軟件分析優(yōu)化出白刺花中總黃酮的最佳提取工藝條件。結(jié)果：優(yōu)化所得白刺花中總黃酮的最佳提取工藝條件為：乙醇濃度為72%，加液量為21倍，提取溫度為71℃，提取時(shí)間為133 min。結(jié)論：響應(yīng)面優(yōu)化所得到的最佳提取工藝準(zhǔn)確、穩(wěn)定，是提取白刺花中總黃酮的可行方法。

【關(guān)鍵詞】 白刺花；總黃酮；提取工藝；響應(yīng)面法

【中圖分類號(hào)】R284.2 【文獻(xiàn)標(biāo)志碼】 A 【文章編號(hào)】1007-8517（2018）12-0013-08

Abstract：Objective Optimize the extraction technology of total flavonoids from Sophora davidii（Franch.）Skeels. Methods Response surface models was used to optimize the extraction technology of total flavonoids from Sophora davidii（Franch.）Skeels.The total flavonoids were extracted using ultrasonic assisted ethanol extraction.On the basis of single factor， the concentration of ethanol， the amount of liquid added， the extraction temperature and the extraction time were the independentvariables.Design-Expert response surface methodology was employed for selecting the optimum extraction process by the indexes of the contents of total flavonoids from Sophora davidii（Franch.）Skeels. Results Total flavonoids from Sophora davidii（Franch.）Skeels of optimum extraction conditions were as follows，72% of the ethanol concentration，21 times of the amount of liquid added，extraction temperature of 71℃，extraction time 133min. Conclusion The extraction process obtained by response surface methodology was stable and reasonable，accurate and reliable. It was a feasible method to extract the total flavonoids from Sophora davidii（Franch.）Skeels.

Keywords：Sophora davidii（Franch.）Skeels； Total Flavonoids； Extraction Process； Response Surface Methodology

白刺花又名苦豆花、白花，為豆科小灌木植物，在南方各地的山坡、田埂及丘陵地帶均有大量分布，有的荒地上甚至成為其主要的植被分布[1]。云南多數(shù)地區(qū)有食用其花的習(xí)俗，為云南紅河州彝族、白族、苗族、哈尼族等少數(shù)民族習(xí)用[2]。白刺花具有清熱利濕、消積通便、殺蟲止癢的功效，用于腹痛腹脹、食積蟲積、痢疾；帶下陰癢；疥癩瘡癬[3]；其花有清熱解暑作用，可用于暑熱煩渴等[4]。當(dāng)?shù)匕傩沼闷渑莶栾嬘?，在降脂降糖上具有一定效果，但未見文獻(xiàn)報(bào)道白刺花有降血脂及降血糖的作用。白刺花含黃酮及生物堿，有抗炎、抗過敏的作用[5]?；诎状袒ǖ母鞣N優(yōu)勢(shì)特點(diǎn)，筆者欲將野生白刺花的葉、花開發(fā)為保健速溶茶，通過試驗(yàn)研究，優(yōu)化出白刺花總黃酮的最佳提取方法，為白刺花保健速溶茶的開發(fā)提供依據(jù)。

1 儀器與材料

1.1 儀器 A580型雙光束紫外可見分光光度計(jì)（翱藝儀器有限公司） ；ML204分析天平（上海亞榮儀器有限公司）；FA2004電子天平（上海舜宇恒平科學(xué)儀器有限公司） ；101型電熱鼓風(fēng)干燥箱北京市永光明醫(yī)療儀器有限公司） ；HH-4 型恒溫水浴鍋（常州潤(rùn)華電器有限公司） ；DLF-18型流水式中藥粉碎機(jī)（溫州頂歷醫(yī)療器械有限公司） ；RE-3000A 型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器（上海亞榮儀器有限公司） 。

1.2 材料 蘆丁對(duì)照品（批號(hào)：20160427，上海金穗生物科技有限公司） ；白刺花采自紅河州豆科小灌木植物白刺花的花；無水乙醇、氫氧化鈉、硝酸鋁、亞硝酸鈉均為分析純，購(gòu)于天津市致遠(yuǎn)化學(xué)有限公司。

2 方法與結(jié)果

2.1 含量測(cè)定方法

2.1.1 對(duì)照品溶液的制備[6] 精密稱取干燥的蘆丁對(duì)照品10 mg，置于50 mL量瓶中，加甲醇適量，至水浴鍋上微熱使蘆丁溶解，冷卻后，在甲醇至刻度，搖勻，即得每1 mL含蘆丁0.2 mg的對(duì)照品溶液。

2.1.2 測(cè)定波長(zhǎng)的選擇 取對(duì)照品溶液2 mL于25 mL容量瓶中，加水至6 mL，加5% NaNO2溶液1 mL，搖勻，放置6 min，再加10%Al（NO3）3 溶液1 mL搖勻，再放置6 min，加1 mol / L氫氧化鈉溶液10 mL，再加水至刻度，搖勻，放置15 min，于波長(zhǎng)400～600 nm 范圍內(nèi)掃描，500 nm波長(zhǎng)處有一最大吸收峰，故選擇500 nm為測(cè)定波長(zhǎng)。

2.1.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 精密吸取蘆丁對(duì)照品溶液0、1、2、3、4、5 mL，分別置于25 mL量瓶中，按“2.1.2”項(xiàng)下方法，選擇500 nm波長(zhǎng)，用相應(yīng)的試劑作空白，測(cè)定每種溶液的吸光度，以吸光度Y做橫坐標(biāo)，濃度X做縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，見表1及圖1?；貧w方程得Y= 21.725X -0.0012，r2=0.9998，結(jié)果顯示，蘆丁在 0.008～0.04 mg/mL內(nèi)具有良好線性關(guān)系。

2.1.4 供試品溶液的制備 將白刺花原料粉碎，過60目篩，按實(shí)驗(yàn)設(shè)定的條件進(jìn)行提取，提取液減壓抽濾，濾液定容，即得供試品溶液。

2.1.5 樣品中總黃酮的含量測(cè)定 精密量取2 mL供試品溶液置于25 mL容量瓶中，按“2.1.2”項(xiàng)方法測(cè)定吸光度，計(jì)算總黃酮提取率。

總黃酮的提取率（%）=c×V1×V3×100V2×m

式中：C 為提取總黃酮的質(zhì)量濃度，mg/mL；V1 為測(cè)量液定容體積，25 mL；V2為測(cè)量時(shí)量取的體積，2 mL；V3為提取液定容體積，100 mL；m為稱取樣品的質(zhì)量，5000 mg。

2.2 單因素考察

2.2.1 加液量對(duì)白刺花中總黃酮提取率的影響 固定乙醇濃度60%，提取時(shí)間1.5 h，提取溫度 80 ℃ 等實(shí)驗(yàn)因素，考查5、10、15、20、25倍加液量下總黃酮的變化。由圖2可知，在加液量為20倍以前，白刺花總黃酮的提取率隨加液量倍數(shù)的增大而增大，但加液量達(dá)到20倍后，總黃酮的提取率呈下降趨勢(shì)，即20倍的加液量的提取率達(dá)到高峰，因此加液量為20倍時(shí)較為合適。20倍加液量后總黃酮提取率呈下降趨勢(shì)可能是溶劑體積較大，非黃酮類成分溶解度增大而大量溶出，從而導(dǎo)致白刺花的總黃酮提取率的下降。

2.2.2 提取時(shí)間對(duì)白刺花中總黃酮提取率的影響 固定加液量為20倍，乙醇濃度為 60% ，提取溫度為 80 ℃等試驗(yàn)因素，考察提取時(shí)間分別為1、1.5、2、2.5、3 h時(shí)白刺花中總黃酮的提取率。由圖3可知，在提取時(shí)間為2 h 時(shí)白刺花總黃酮提取率最高，繼續(xù)延長(zhǎng)提取時(shí)間，提取率會(huì)降低，在提取時(shí)間為3 h時(shí)提取率最低，故選提取時(shí)間為2 h為最優(yōu)提取時(shí)間。圖上還反應(yīng)出提取時(shí)間太長(zhǎng)，都會(huì)使白刺花中總黃酮被破壞，以致提取率下降。

2.2.3 乙醇濃度對(duì)白刺花中總黃酮提取率的影響 固定加液量為20倍，提取時(shí)間為2 h，提取溫度為80 ℃，考查乙醇濃度分別為40%乙醇、50%乙醇、60%乙醇、70%乙醇、80%乙醇時(shí)白刺花中總黃酮的提取率。由圖4可知，隨著乙醇濃度加大，提取液的極性越接近提取物的極性，提取率不斷提高，當(dāng)乙醇濃度為70%時(shí)，白刺花中總黃酮的提取率達(dá)到最高，70%后再增大乙醇濃度提取率將降低，是因?yàn)橐掖紳舛忍撸状袒ㄖ写既苄噪s質(zhì)及色素等成分溶出增多。因此70%的乙醇濃度為最優(yōu)乙醇濃度。

2.2.4 提取溫度對(duì)白刺花中總黃酮提取率的影響 固定加液量為20倍，提取時(shí)間2 h，乙醇濃度為70%等實(shí)驗(yàn)因素，考查提取溫度分別為40 ℃、50 ℃、60 ℃、70 ℃、80 ℃、90 ℃時(shí)白刺花中總黃酮的提取率。由圖5可知，溫度升高，提取率在增高，當(dāng)溫度達(dá)到70 ℃ 時(shí)，白刺花中總黃酮提取率最高，當(dāng)溫度增大到80 ℃時(shí)，總黃酮提取率有所下降，當(dāng)溫度增大到90 ℃時(shí)，總黃酮提取率下降明顯。因此選擇溫度為70 ℃為白刺花總黃酮提取最優(yōu)溫度。

2.3 響應(yīng)面法優(yōu)化白刺花中總黃酮提取工藝 在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，選擇乙醇濃度（A）、加液量（B）、提取溫度（C） 和提取時(shí)間（D），利用 Design-Expert 8.0.6軟件中的 Box-Behnken 軟件優(yōu)化白刺花中總黃酮提取條件。以白刺花總黃酮提取率為響應(yīng)值，進(jìn)行響應(yīng)面分析試驗(yàn)[7-8]，以 A、B、C、D 為自變量，以總黃酮提取率為響應(yīng)值（Y） 進(jìn)行實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，各因素水平設(shè)計(jì)見表2。白刺花Box-Behnken中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)和結(jié)果見表3。

采用Design-Expert 8.0.6軟件分析試驗(yàn)結(jié)果，以總黃酮提取率為響應(yīng)值，對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行二次多項(xiàng)式回歸擬合，得回歸方程為：

Y=0.92+0.018A+0.023B+7.500E-003C+0.035D+0.021AB-2.500E-003AC+0.016AD+0.034BC+7.750E-003BD-7.500E-003CD-0.093A2-0.075B2-0.043C2-0.043D2

使用Design-Expert 8.0.6軟件回歸分析對(duì)方程及各因子進(jìn)行方差分析。由表4可知，以白刺花的總黃酮提取率為響應(yīng)值，回歸方程顯著性檢測(cè) P﹤0.0001，表明所得二次方程模型極顯著，而失擬項(xiàng)的P值為0.9986，不顯著，R2=0.9921，表明回歸方程模型與實(shí)際實(shí)驗(yàn)擬合性比較好，實(shí)驗(yàn)誤差較小，說明采用響應(yīng)面法優(yōu)化白刺花中總黃酮提取工藝是可行的，具有參考性[9]，其中各影響因素對(duì)白刺花總黃酮提取率的影響順序?yàn)椋禾崛r(shí)間>加液量>乙醇濃度> 提取溫度。

表4中一次項(xiàng)乙醇濃度、加液量、提取時(shí)間的 P 值都小于 0.0001，說明都對(duì)白刺花總黃酮的提取率有極顯著的影響，提取溫度的P值為0.0064，小于0.01，表明其對(duì)白刺花總黃酮的提取率有高度顯著的影響； 交互項(xiàng)BC對(duì)白刺花總黃酮提取率的影響極顯著，AD對(duì)白刺花中總黃酮提取率的影響高度顯著，其余不顯著； 二次項(xiàng) A2、B2、C2、D2均達(dá)到極顯水平說明各因素對(duì)白刺花中總黃酮的提取率存在交互影響，而不是簡(jiǎn)單的線性關(guān)系[10]

將表3中的試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行響應(yīng)面的曲面分析，在影響因素中選擇其中兩個(gè)交互的因素對(duì)白刺花中總黃酮的提取率的影響進(jìn)行分析，把其他因素固定為零。根據(jù)回歸方程，考察各影響因素響應(yīng)曲面的形狀，分析各因素對(duì)白刺花中總黃酮提取率的影響，結(jié)果如圖6～11所示。

根據(jù)Design-Expert 8.0.6軟件響應(yīng)曲面優(yōu)化原理，3D曲面圖的坡度越大，說明響應(yīng)值對(duì)于操作條件的改變影響越大； 反之曲面圖坡度越小，操作條件改變對(duì)響應(yīng)值的影響也就越小[11-12] 。圖 6～11反映了乙醇濃度、加液量、提取溫度 和提取時(shí)間四個(gè)因素交互作用對(duì)白刺花中總黃酮提取率的影響，其中乙醇濃度及加液量（圖6）、乙醇濃度及提取時(shí)間（圖8）、提取溫度及加液量（圖9）交互作用3D曲面圖坡度較大，表明這三組對(duì)白刺花中總黃酮提取率的交互作用明顯。

通過響應(yīng)面分析優(yōu)化，用Design-Expert 8. 0. 6軟件對(duì)回歸方程進(jìn)行計(jì)算，得到白刺花中總黃酮的最佳工藝條件為：乙醇濃度 71.59% ，加液量為21.15倍，提取溫度為71.32 ℃，提取時(shí)間2.22 h；在此條件下模型預(yù)測(cè)總黃酮提取率為0.93118% ?？紤]到在實(shí)際操作中，設(shè)備等各條件有限，對(duì)最佳工藝條件修正為：乙醇濃度 72% ，加液量為21倍，提取溫度為71 ℃，提取時(shí)間為133 min。

2.4 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn) 根據(jù)所修正的條件進(jìn)行了3次平行驗(yàn)證試驗(yàn)，結(jié)果白刺花中總黃酮的平均提取率為0.9273%，與模型相對(duì)誤差為0.42%，說明實(shí)驗(yàn)結(jié)果與模型擬合較好，利用響應(yīng)面優(yōu)化法優(yōu)化所得到的提取工藝參數(shù)準(zhǔn)確可靠。

3 討論

白刺花中黃酮類化合物含量豐富，具有非常好的藥用、食用、保健作用價(jià)值和開發(fā)利用前景。本研究以干燥的白刺花的花粗粉為原料，以乙醇為提取溶劑，在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，用 Design-Expert 8.0.4 軟件對(duì)白刺花提取工藝參數(shù)進(jìn)行響應(yīng)面試驗(yàn)優(yōu)化。結(jié)果表明最佳的提取工藝條件為：乙醇濃度 72%，加液量為21倍，提取溫度為71 ℃，提取時(shí)間為133 min。優(yōu)化所得到的最佳提取工藝是提取白刺花中總黃酮的有效途徑，為開發(fā)保健速溶茶提供可靠的依據(jù)。

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（收稿日期：2018-04-06 編輯：程鵬飛）