草魚(yú)肌肉中呋喃唑酮代謝物AOZ檢測(cè)能力 驗(yàn)證樣品的制備研究

田娟娟，甘金華，彭 婕，李晉成，劉 歡

(1.上海海洋大學(xué)水產(chǎn)與生命學(xué)院，上海 201306；2.中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院，北京 100141； 3.農(nóng)業(yè)部水產(chǎn)品質(zhì)量安全控制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100141； 4.中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院長(zhǎng)江水產(chǎn)研究所，武漢 430223)

呋喃唑酮(Furazolidone，F(xiàn)ZD)屬于硝基呋喃類抗菌劑的范疇，在水產(chǎn)養(yǎng)殖中曾被廣泛應(yīng)用于治療魚(yú)類疾病或細(xì)菌引起的其它疾病[1]。FZD的代謝產(chǎn)物 3-氨基-2-惡唑烷酮 (3-amino-2-oxazolidinone，AOZ)半衰期較長(zhǎng)，具有致畸胎和致突變的副作用，且能誘發(fā)癌癥[2-4]。美國(guó)、歐盟等其他國(guó)家和地區(qū)均禁止FZD作為獸藥使用[2,5,6]。我國(guó)農(nóng)業(yè)部公告規(guī)定禁止在食用動(dòng)物上使用FZD等硝基呋喃類藥物(193號(hào)令[7])，但實(shí)際養(yǎng)殖、運(yùn)輸、暫存等生產(chǎn)和流通過(guò)程中，仍有大量違規(guī)使用FZD的行為。AOZ等硝基呋喃類藥物代謝物仍然是水產(chǎn)品質(zhì)量安全的重點(diǎn)監(jiān)管對(duì)象，從近年來(lái)國(guó)家認(rèn)監(jiān)委、農(nóng)業(yè)部等部門(mén)組織開(kāi)展的水產(chǎn)品藥物殘留檢測(cè)能力驗(yàn)證看，AOZ等硝基呋喃類代謝物是每年必考的指標(biāo)之一。

能力驗(yàn)證是評(píng)估實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)能力的重要手段和途徑，而能力驗(yàn)證樣品的成功研制保證了該項(xiàng)目的順利進(jìn)行。能力驗(yàn)證樣品制備一般有兩種方法，自然機(jī)體污染法和空白基質(zhì)加標(biāo)法。前者是是將藥物直接飼喂或藥浴動(dòng)物，得到含有藥物的陽(yáng)性樣品，后者是將藥物標(biāo)準(zhǔn)溶液添加至空白樣品中[8]。兩種方法得到的樣品在檢測(cè)難易程度上存在很大差別，前者目標(biāo)檢測(cè)物是與動(dòng)物體內(nèi)的蛋白相結(jié)合，存在“內(nèi)化”的情況，后者是目標(biāo)檢測(cè)物僅附著在考核樣品表層。自然機(jī)體污染法制備的能力驗(yàn)證樣品更接近于真實(shí)樣品，更能反映出檢測(cè)人員的監(jiān)測(cè)水平。采用自然機(jī)體污染法制備樣品時(shí)，樣品中目標(biāo)物殘留濃度要在適當(dāng)水平，如果目標(biāo)物殘留濃度過(guò)高，分析時(shí)易污染儀器設(shè)備，可能達(dá)不到區(qū)分各實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)能力的目的；如果目標(biāo)物殘留濃度過(guò)低，分析變異系數(shù)大，增加實(shí)驗(yàn)室操作難度，不易出現(xiàn)具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的結(jié)果[9]。有研究表明，在以活體動(dòng)物為基礎(chǔ)的能力驗(yàn)證樣品制備上，影響因素很多，包括給藥方式、給藥濃度、水溫、養(yǎng)殖時(shí)間等養(yǎng)殖條件、養(yǎng)殖品種、規(guī)格等因素[10-12]，但是關(guān)于如何控制上述因素以實(shí)現(xiàn)能力驗(yàn)證考核樣品需要的藥物殘留濃度還鮮有報(bào)道。因此，本文研究了水溫、藥浴時(shí)間等因素對(duì)草魚(yú)肌肉中呋喃唑酮代謝物殘留濃度的影響，并以肌肉基質(zhì)中殘留濃度為8 μg/kg和25 μg/kg為目標(biāo)，確定草魚(yú)基質(zhì)中呋喃唑酮代謝物殘留檢測(cè)能力驗(yàn)證樣品的養(yǎng)殖試驗(yàn)條件，為后續(xù)水產(chǎn)品中呋喃唑酮代謝物AOZ殘留檢測(cè)能力驗(yàn)證樣品的制備提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

草魚(yú)(購(gòu)于湖北省武漢市洪山區(qū)茅店社區(qū)萬(wàn)達(dá)菜市場(chǎng)，不同批次)，隨機(jī)取樣，經(jīng)HPLC-MS檢測(cè)，未檢出呋喃唑酮代謝物；活躍狀態(tài)良好，規(guī)格大小均一(900～1 100g/尾)。給藥前暫養(yǎng)于消毒后的水箱中，水溫(25±1)℃，不間斷增氧，不投餌，每天換1次水，暫養(yǎng)1～2 d，剔除不健康、受傷的草魚(yú)(有明顯傷痕)后用于實(shí)驗(yàn)。

呋喃唑酮原料藥(梯希愛(ài)(上海)化成工業(yè)發(fā)展有限公司，純度>98%，實(shí)際純度97.74%)；AOZ標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)(德國(guó)Dr.Ehrenstorfer公司，純度99%)；AOZ-D4同位素內(nèi)標(biāo)(德國(guó)Dr.Ehrenstorfer公司，純度99%)；乙腈(色譜純，美國(guó)J.T.Baker公司)；甲醇(色譜純，美國(guó)J.T.Baker公司)；乙酸乙酯(色譜純，美國(guó)J.T.Baker公司)；醋酸銨(分析純，美國(guó)J.T.Baker公司)；二甲亞楓(Tedia 公司)；2-硝基苯甲醛(EU)；K2HPO4(分析純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，純度≥99%)；鹽酸(優(yōu)級(jí)純，信仰市化學(xué)試劑廠)。

1.2 儀器與設(shè)備

高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀(Thermo公司)；分析天平(Mettler Toledo)；旋渦混合器(北方同正，型號(hào)HQ-60-Ⅱ)；高速冷凍離心機(jī)(上海安亭科學(xué)儀器廠，GL-20B)；氮吹儀(上海川翔生物科技有限公司，KD200)；飛利浦?jǐn)嚢杵鳎凰幵〕貫榉叫尾Ａ逑?，?guī)格尺寸分別為長(zhǎng)135.7 cm×寬57 cm×高54 cm；長(zhǎng)69 cm×寬57 cm×高54 cm；

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 養(yǎng)殖條件的確定

1.3.1.1 藥浴時(shí)間的確定

藥浴初始濃度為97.98 μg/L，藥浴池中水溫保持在(25±1)℃，一次放入草魚(yú)35尾，以空氣泵持續(xù)增氧，連續(xù)藥浴24 h后100 %換水。樣品采集點(diǎn)分別為藥后2、4、8、10、12、16、18、24、28、32、48 h，每個(gè)時(shí)間點(diǎn)隨機(jī)取草魚(yú)3尾，3尾作為一個(gè)樣品。每個(gè)時(shí)間捕撈的草魚(yú)立即處死，去皮，取其背部肌肉，搗碎勻漿，裝入PE自封袋中，于-20 ℃冷凍保存，以備檢測(cè)分析AOZ殘留量，同一樣品平行測(cè)定3次，取其平均值作為各時(shí)間點(diǎn)肌肉中AOZ的殘留濃度。

1.3.1.2 藥浴溫度的確定

兩組試驗(yàn)水溫分別保持在(25±1)℃和(20±1)℃，高溫組和低溫組各放草魚(yú)35尾，以空氣泵持續(xù)增氧，連續(xù)藥浴24 h后100 %換水。呋喃唑酮藥浴初始濃度、采樣點(diǎn)等操作均與樣品中AOZ含量的檢測(cè)“1.3.1.1 ”保持一致。

1.3.2 草魚(yú)肌肉中AOZ含量(y)與藥浴初始濃度(x)相關(guān)性研究及驗(yàn)證

1.3.2.1y與x關(guān)系的建立

呋喃唑酮初始藥浴濃度為97.87 μg/L，藥浴池中水溫保持在25 ℃左右，以空氣泵持續(xù)增氧，一次放入5尾。達(dá)到最佳藥浴時(shí)間后，立即捕撈處死，去皮，取其背部肌肉，搗碎勻漿，裝入PE自封袋中，于-20 ℃冷凍保存，以備檢測(cè)分析AOZ殘留量，同一樣品平行測(cè)定3次，取其平均值作為該時(shí)間點(diǎn)肌肉中AOZ的殘留濃度。根據(jù)得出的藥浴最佳時(shí)間時(shí)對(duì)應(yīng)草魚(yú)體內(nèi)AOZ含量y值，已知初始藥浴濃度x=97.87 μg/L，建立y=kx的線性關(guān)系。

1.3.2.2y與x關(guān)系的驗(yàn)證

根據(jù)上述建立的關(guān)系式y(tǒng)=kx，即可算出預(yù)期得到藥后草魚(yú)肌肉中AOZ含量8 μg/kg和25 μg/kg分別對(duì)應(yīng)的呋喃唑酮初始藥浴濃度分別為36.29 μg/L和113.54 μg/L，藥浴池中水溫保持在25 ℃左右，藥浴時(shí)間10 h，以空氣泵持續(xù)增氧，每個(gè)藥浴池每次放入8～9條規(guī)格統(tǒng)一的草魚(yú)。隨機(jī)采集兩個(gè)水族箱中藥浴時(shí)間為最佳時(shí)間10 h的草魚(yú)各6尾，立即處死，去皮，取其背部肌肉，搗碎勻漿，裝入PE自封袋中，于-20 ℃冷凍保存，以備檢測(cè)分析AOZ殘留量，同一樣品平行測(cè)定3次，取其平均值作為該時(shí)間點(diǎn)肌肉中AOZ的殘留濃度。高濃度組和低濃度組殘留分別經(jīng)過(guò)6個(gè)批次的平行實(shí)驗(yàn)，驗(yàn)證上述建立的關(guān)系式y(tǒng)=kx的正確性。

1.3.3 能力驗(yàn)證樣品的制備

根據(jù)上述條件建立的養(yǎng)殖實(shí)驗(yàn)條件，制備草魚(yú)肌肉中AOZ含量約為10.0 μg/kg的能力驗(yàn)證樣品，藥浴濃度為45 μg/L，藥浴時(shí)間10 h，藥浴溫度25 ℃。從市場(chǎng)直接購(gòu)買(mǎi)的活草魚(yú)，暫養(yǎng)1～2 d后，剔除受傷不健康的草魚(yú)，隨機(jī)取樣檢測(cè)確定為陰性樣品后，按照上述條件建立的養(yǎng)殖實(shí)驗(yàn)條件進(jìn)行藥浴、捕殺，取其背部肌肉部分，充分混合均勻，制成魚(yú)糜。然后對(duì)制得的魚(yú)糜進(jìn)行分裝，每份樣品約10.0 g，共140份，-20 ℃冷凍保存，以備進(jìn)一步做均勻性和穩(wěn)定性檢驗(yàn)。

1.3.4 均勻性和穩(wěn)定性檢驗(yàn)

樣品均勻性和穩(wěn)定性按照“能力驗(yàn)證樣品均勻性和穩(wěn)定性評(píng)價(jià)指南(CNAS-GL03)”要求進(jìn)行。

1.3.4.1 均勻性檢驗(yàn)

從制備的能力驗(yàn)證樣品中各隨機(jī)抽取10份樣品進(jìn)行均勻性檢測(cè)，每份樣品重復(fù)測(cè)定2次，分析樣品中AOZ的含量。檢測(cè)結(jié)果用單因素方差分析(Anova)來(lái)判斷樣品的均勻性。

1.3.4.2 穩(wěn)定性檢驗(yàn)

本實(shí)驗(yàn)對(duì)能力驗(yàn)證樣品進(jìn)行了短期穩(wěn)定性和長(zhǎng)期穩(wěn)定性檢測(cè)。評(píng)估穩(wěn)定性研究的數(shù)據(jù)的第一步是檢查數(shù)據(jù)中是否有任何觀察到的趨勢(shì)。對(duì)于微小的不穩(wěn)定性問(wèn)題，由于內(nèi)在動(dòng)力學(xué)機(jī)理未知，因此線性擬合是一個(gè)合適的模型，穩(wěn)定性研究的基本模型可表示為[13]：

y=β0+β1x+ε

式中：β0和β1—回歸系數(shù)；ε—隨機(jī)誤差分量；x—時(shí)間；y—樣品中AOZ含量。

斜率的估計(jì)值b1可按下式計(jì)算：

截距的估計(jì)值b0可按下式計(jì)算：

直線的標(biāo)準(zhǔn)偏差S：

斜率的標(biāo)準(zhǔn)偏差S(b1)：

在置信水平為95%時(shí)，如果│b1│

1.3.4.2.1 短期穩(wěn)定性

短期穩(wěn)定性進(jìn)行30 d，按照先密后疏的原則，選取0、3、7、15、30 d 5個(gè)時(shí)間點(diǎn)進(jìn)行測(cè)定。每次測(cè)定隨機(jī)抽取3份樣品，平行測(cè)定2次，進(jìn)行樣品的短期穩(wěn)定性分析。

1.3.4.2.2 長(zhǎng)期穩(wěn)定性

樣品長(zhǎng)期存放在-20 ℃冰箱中保存，長(zhǎng)期穩(wěn)定性為期6個(gè)月，每個(gè)月測(cè)定1次。穩(wěn)定性每次測(cè)定隨機(jī)抽取3份樣品，平行測(cè)定2次，進(jìn)行樣品的短期穩(wěn)定性分析。

1.4 AOZ殘留量檢測(cè)方法

樣品中AOZ殘留量分析方法按照農(nóng)業(yè)部783號(hào)公告-1-2006《水產(chǎn)品中硝基呋喃類代謝物殘留量的測(cè)定液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法》進(jìn)行[14]。

1.5 數(shù)據(jù)分析統(tǒng)計(jì)

分析草魚(yú)肌肉中AOZ殘留量與藥浴初始濃度的相關(guān)性。采用軟件SPSS 20.0對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析(Anova，P<0.05)。

2 結(jié)果與分析

2.1 標(biāo)準(zhǔn)樣品曲線及回收率

標(biāo)準(zhǔn)曲線范圍為0.5～100 ng/mL，高濃度樣品選取0.5、1、5、10、20、50、100 ng/mL 7個(gè)濃度梯度；低濃度樣品選取0.5、1、2、5、10、20 ng/mL 6個(gè)濃度梯度制備標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到的線性方程分別為y=0.222 6x+0.035 6，y=0.223 8x- 0.047 8，相關(guān)系數(shù)r2均大于0.999。每次檢測(cè)均設(shè)草魚(yú)空白及質(zhì)控樣品，AOZ在空白草魚(yú)基質(zhì)中的回收率均為80%～110%，在方法規(guī)定的70%～110%范圍，說(shuō)明了檢測(cè)結(jié)果的可靠性。

2.2 養(yǎng)殖條件的確定

2.1.1 藥浴時(shí)間的確定

草魚(yú)肌肉中AOZ殘留量每個(gè)采樣點(diǎn)平均值隨藥浴時(shí)間變化趨勢(shì)如圖1所示。

圖1 不同藥浴時(shí)間下草魚(yú)肌肉中呋喃唑酮代謝物 AOZ含量的變化Fig.1 Changes of the content of furazolidone metabolites AOZ in the muscle of grass carp under different bath time

圖1 中可知，在給藥后0～8 h是藥物吸收的過(guò)程，草魚(yú)肌肉中AOZ殘留隨著時(shí)間的延長(zhǎng)而迅速升高，8～18 h藥物吸收和消除達(dá)到一個(gè)動(dòng)態(tài)平衡的過(guò)程，殘留濃度變化趨勢(shì)相對(duì)平緩，之后18～24 h藥物殘留濃度又進(jìn)一步升高，24 h時(shí)殘留量達(dá)到峰值，24 h后全部換水后，藥物殘留進(jìn)入消除階段，隨著時(shí)間的推移AOZ殘留濃度逐漸降低。

2.1.2 藥浴溫度對(duì)草魚(yú)肌肉中AOZ殘留的影響

通過(guò)在20 ℃和25 ℃兩種不同水溫條件下進(jìn)行藥浴實(shí)驗(yàn)，檢測(cè)不同藥浴時(shí)間下呋喃唑酮在草魚(yú)肌肉中的殘留量見(jiàn)圖2。由圖2可知，20 ℃條件下草魚(yú)肌肉中AOZ的含量明顯低于25 ℃條件下肌肉中AOZ含量，2～8 h 25 ℃條件下草魚(yú)對(duì)藥物的吸收速率明顯高于20 ℃條件下的吸收速率，在25 ℃的條件下，8 h后藥物吸收和消除達(dá)到動(dòng)態(tài)平衡，24 h達(dá)到峰值，峰值濃度為(24.98±1.54)μg/kg。在20 ℃條件下，需10 h后藥物吸收和消除才達(dá)到動(dòng)態(tài)平衡，24 h并未出現(xiàn)峰值(24 h后100%換水)，說(shuō)明在高溫魚(yú)體代謝藥物富集作用更快，低溫條件下較慢，低溫條件下達(dá)到峰值需要更長(zhǎng)的時(shí)間。

圖2 不同溫度下草魚(yú)肌肉中呋喃唑酮代謝物AOZ殘留量Fig.2 Residual amount of furazolidone metabolite AOZ in muscle of grass carp at different temperatures

2.3 y與x的相關(guān)性及驗(yàn)證

根據(jù)實(shí)驗(yàn)藥浴初始濃度x=97.87 μg/L，10 h后捕殺，經(jīng)檢測(cè)草魚(yú)肌肉中AOZ含量y=21.57 μg/kg，確定y與x的關(guān)系為y=0.22x。對(duì)線性方程y=0.22x進(jìn)行6～7個(gè)批次的平行驗(yàn)證，檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)表1和表2。

表1 低濃度各批次草魚(yú)肌肉中AOZ殘留測(cè)定數(shù)據(jù)(n=3)Tab.1 Each batch of low concentrations of residual measurement data(n=3)

續(xù)表1

表2 高濃度各批次草魚(yú)規(guī)格與肌肉中AOZ殘留測(cè)定數(shù)據(jù)(n=3)Tab.2 Each batch of high concentrations of residual measurement data(n=3)

表3 批間差異計(jì)算結(jié)果(n=6)Tab.3 Interval difference calculation results(n=6)

由表1、2可知，在嚴(yán)格控制魚(yú)體規(guī)格、藥浴時(shí)間、水溫的條件下，實(shí)際檢測(cè)草魚(yú)肌肉中AOZ低濃度殘留和高濃度殘留濃度值與預(yù)期得到的值存在一定偏差，但是差別不大。根據(jù)表中計(jì)算的RSD值反應(yīng)樣品的批間、批內(nèi)差異性知批內(nèi)相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差小于10%，批間相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差小于15%(表3)，說(shuō)明樣品批間和批內(nèi)差異性較小，從而驗(yàn)證關(guān)系式y(tǒng)=0.22x的可行性。

2.4 均勻性和穩(wěn)定性檢測(cè)結(jié)果分析

2.4.1 均勻性檢測(cè)結(jié)果

樣品的均勻性采用單因子方差統(tǒng)計(jì)分析進(jìn)行評(píng)定，樣品均勻性檢測(cè)數(shù)據(jù)和統(tǒng)計(jì)分析見(jiàn)表4、5。

根據(jù)方差分析的原理，通過(guò)對(duì)組間與組內(nèi)的均方(MS)比值F與統(tǒng)計(jì)檢驗(yàn)臨界值Fcrit比較，如果F值小于Fcrit，則認(rèn)為各組測(cè)量值之間無(wú)系統(tǒng)性差異。由表5方差分析結(jié)果表明，F(xiàn)值均小于臨界值Fcrit(9，10)=3.02，P>0.05，表明樣品間不存在顯著性差異，即樣品是均勻性的。

表4 AOZ能力驗(yàn)證樣品的均勻性檢測(cè)數(shù)據(jù)(n=2)Tab.4 Homogeneity of AOZ proficiency testing samples detected data (n=2)

表5 樣品均勻性檢驗(yàn)單因子方差分析結(jié)果Tab.5 Result of one-way analysis of variance for AOZ homogeneity

2.4.2 穩(wěn)定性檢測(cè)結(jié)果

2.3.2.1 短期穩(wěn)定性

表6是短期穩(wěn)定測(cè)得肌肉中AOZ含量的數(shù)據(jù)及平均值，將相關(guān)數(shù)據(jù)帶入上述公式計(jì)算得到b1、b0、S、S(b1)，線性擬合具體分析結(jié)果見(jiàn)表7。查表t0.95,3=3.182，│b1│=0.014 4，t0.95,3·S(b1)=0.040 9，故│b1│

表7 AOZ能力驗(yàn)證樣品短期穩(wěn)定數(shù)據(jù)穩(wěn)定性分析結(jié)果Tab.7 The result analysis of short-term stability of AOZ proficiency sample

2.3.2.2 長(zhǎng)期穩(wěn)定性

表8 AOZ能力驗(yàn)證樣品長(zhǎng)期穩(wěn)定性檢驗(yàn)結(jié)果(n=6)Tab.8 Long-term stability test results of AOZ proficiency testing samples(n=6)

表9 AOZ能力驗(yàn)證樣品長(zhǎng)期穩(wěn)定性結(jié)果分析Tab.9 The result analysis of long-term stability of AOZ proficiency sample

表8 是AOZ能力驗(yàn)證樣品長(zhǎng)期穩(wěn)定檢測(cè)數(shù)據(jù)及平均值，將相關(guān)數(shù)據(jù)帶入上述公式計(jì)算得到b1、b0、S、S(b1)，線性擬合具體分析結(jié)果見(jiàn)表 9。由表 9 可知，│b1│=0.040 3，t0.95，3·S(b1)=0.380 8，故│b1│

3 討論

3.1 藥浴時(shí)間對(duì)草魚(yú)肌肉中AOZ殘留的影響

由圖1可知，隨著藥浴時(shí)間的延長(zhǎng)，AOZ殘留量逐漸升高，24 h出現(xiàn)峰值，8～18 h出現(xiàn)殘留變化相對(duì)平緩的階段，考慮到盡量減少藥浴時(shí)間與實(shí)驗(yàn)結(jié)果的穩(wěn)定性，最終確定選擇藥浴時(shí)間10 h。并且該曲線的變化趨勢(shì)與余孔捷等[15]報(bào)道的喹諾酮類多殘留自然基體標(biāo)準(zhǔn)樣品制備中藥浴時(shí)間確定的趨勢(shì)圖也是一致的。

3.2 溫度對(duì)草魚(yú)肌肉中AOZ殘留的影響

通過(guò)研究不同溫度對(duì)草魚(yú)肌肉中AOZ殘留影響,結(jié)果表明，20 ℃條件下，AOZ在草魚(yú)肌肉中富集分布較慢，25 ℃條件下富集分布較快。該結(jié)論與Grasset J等[16]研究不同溫度條件下(9、20、28 ℃)金屬(鎘、鎳)在黃鱸腎臟中富集的濃度隨溫度的升高而升高以及與Bj?rklund等[17]報(bào)道的不同溫度5、10、16 ℃下土霉素在虹鱒血清中達(dá)到峰值的時(shí)間分別為24、12和1 h的結(jié)論都是一致的。Roberts等[18]認(rèn)為通常水溫每升高1 ℃，魚(yú)類的代謝和消除速度將提高10%。Clarke等[19]人研究發(fā)現(xiàn)，熱帶(30 ℃)生活的魚(yú)類代謝率大約是極地(0 ℃)生活魚(yú)類的6倍。Whitney等[20]研究溫度(23 ℃、30 ℃)對(duì)鯊魚(yú)代謝率的影響結(jié)論也證明了魚(yú)體代謝速率隨溫度的升高而加快。以上研究均表明，溫度對(duì)水生動(dòng)物的代謝有很大影響，水溫是給藥時(shí)應(yīng)當(dāng)考慮的一個(gè)重要因素。本研究想達(dá)到預(yù)期殘留的濃度，20 ℃的水溫條件下需要的藥浴時(shí)間更長(zhǎng)，綜合考慮，最后確定最佳藥浴溫度為25 ℃。

3.3 y與x相關(guān)性驗(yàn)證

對(duì)低濃度組數(shù)據(jù)運(yùn)用SPPS 20.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行單樣本t檢驗(yàn)(參考值為8 μg/kg)得到t值為2.419，P=0.052>0.05，表明在ɑ=0.05顯著水平時(shí)，低濃度組數(shù)據(jù)不存在顯著性差異；對(duì)高濃度組數(shù)據(jù)進(jìn)行單樣本t檢驗(yàn)(參考值為25 μg/kg)得到t值為0.604，P=0.572>0.05，表明在ɑ=0.05顯著水平時(shí)，高濃度組數(shù)據(jù)不存在顯著性差異。經(jīng)t檢驗(yàn)，高、低濃度殘留組兩組數(shù)據(jù)均不存在顯著性差異，說(shuō)明實(shí)際得到的數(shù)據(jù)與預(yù)期設(shè)定數(shù)值8 μg/kg、25 μg/kg不存在顯著性差異，進(jìn)而說(shuō)明了關(guān)系式y(tǒng)=0.22x的可行性。

3.4 均勻性與穩(wěn)定性

能力驗(yàn)證樣品的一致性對(duì)進(jìn)行能力驗(yàn)證至關(guān)重要。在實(shí)施能力驗(yàn)證計(jì)劃時(shí)，組織方應(yīng)確保能力驗(yàn)證中出現(xiàn)的不滿意結(jié)果不歸咎于樣品之間或樣品本身的變異性。因此，對(duì)于能力驗(yàn)證樣品的檢測(cè)特性量，特別是以活體動(dòng)物制備的能力驗(yàn)證樣品，必須進(jìn)行均勻性檢驗(yàn)和穩(wěn)定性檢驗(yàn)[21]。由上述分析結(jié)果可知，制備樣品內(nèi)和樣品間的均勻性無(wú)顯著性差異，在6個(gè)月內(nèi)穩(wěn)定性合格，滿足能力驗(yàn)證的要求。

4 結(jié)論

本文以草魚(yú)為基質(zhì)，研究了能力驗(yàn)證樣品制備中溫度、時(shí)間與草魚(yú)肌肉中最終藥物殘留的濃度關(guān)系，結(jié)果顯示在魚(yú)體規(guī)格900～1100 g之間，水溫25 ℃，藥浴10 h的條件下初始藥浴濃度x與草魚(yú)肌肉中AOZ殘留濃度y之間的關(guān)系為y=0.22x，并且經(jīng)過(guò)多次驗(yàn)證，也證明了此關(guān)系式的正確性。并且運(yùn)用建立起的關(guān)系式y(tǒng)=0.22x，制備出殘留量為10 μg/kg左右的能力驗(yàn)證樣品，并對(duì)樣品的均勻性和穩(wěn)定性進(jìn)行評(píng)價(jià)，經(jīng)檢測(cè)樣品均勻性和穩(wěn)定性良好，符合能力驗(yàn)證樣品的要求。