長(zhǎng)豐鰱卵巢發(fā)育后期的肝臟、卵巢營(yíng)養(yǎng)成分及 脂肪酸變化

全書月，李 忠，梁宏偉，羅相忠，王 丹，鄒桂偉

(1.中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院長(zhǎng)江水產(chǎn)研究所，武漢，430223； 2.華中農(nóng)業(yè)大學(xué)水產(chǎn)學(xué)院，武漢，430070)

魚類卵巢中的成熟卵粒含有仔魚在卵黃營(yíng)養(yǎng)階段所需的營(yíng)養(yǎng)，可以在仔魚攝食外源性營(yíng)養(yǎng)之前，保證內(nèi)環(huán)境均衡和發(fā)育[1]。針對(duì)魚類營(yíng)養(yǎng)構(gòu)成的相關(guān)研究多有報(bào)道[2-4]，劉玉芳[5]對(duì)鰱(Hypophthalmichthysmolitrix)脂類和脂肪酸組成進(jìn)行了考察，分析其營(yíng)養(yǎng)價(jià)值；羅永康[6]對(duì)鰱肌肉和內(nèi)臟中脂肪酸的組成進(jìn)行了分析，發(fā)現(xiàn)其內(nèi)臟和肌肉中含有較高的二十碳五烯酸(eicosapentaenoic acid，EPA)和二十二碳六烯酸(docosahexaenoci acid，DHA)；朱邦科等[7]對(duì)鰱早期發(fā)育階段魚體脂肪酸構(gòu)成變化進(jìn)行了分析，發(fā)現(xiàn)多不飽和脂肪酸(polyunsaturated fatty acid，PUFA)中以DHA、EPA和花生四烯酸(Arachidonic acid，AA)為主。脂類是魚類生長(zhǎng)發(fā)育過程中的重要營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)[8]，是魚類卵黃的主要構(gòu)成物。脂類既是生物體的能源物質(zhì)，也是構(gòu)成組織器官生物膜的重要成分[9-11]?；谀戏仅勇腰S積累過程，張耀光等[12]將卵子發(fā)生的時(shí)相劃分為卵原細(xì)胞期、卵黃發(fā)生前期、卵黃發(fā)生期、卵黃成熟期等4個(gè)時(shí)期。朱云林等[13]觀察尼羅羅非魚卵母細(xì)胞分期時(shí)發(fā)現(xiàn)，性腺發(fā)育至Ⅲ期卵母細(xì)胞開始積累卵黃物質(zhì)；且性腺發(fā)育至Ⅳ期初，卵黃開始充滿卵母細(xì)胞。卵黃來源分為內(nèi)源性和外源性兩種途徑：內(nèi)源性卵黃發(fā)生是指由卵母細(xì)胞自身細(xì)胞質(zhì)合成的卵黃顆粒沉積而成的卵黃物質(zhì)，卵母細(xì)胞中的高爾基體、線粒體、核糖體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)等細(xì)胞器參與該過程；外源性卵黃發(fā)生是指由卵母細(xì)胞外的組織(如肝臟)合成的卵黃蛋白前體—卵黃蛋白原(vitellogenin，Vtg)經(jīng)血液運(yùn)輸?shù)綖V泡細(xì)胞，隨后合成卵黃蛋白(vitellin，Vn)并被加工成卵黃顆粒[14]。

長(zhǎng)豐鰱是中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院長(zhǎng)江水產(chǎn)研究所培育的鰱新品種[15]，具有生長(zhǎng)快、體型好和成活率高的優(yōu)點(diǎn)，深受廣大生產(chǎn)者和消費(fèi)者的喜愛，但存在繁殖力不高的問題，為弄清長(zhǎng)豐鰱的繁殖性能，提高繁殖力，本研究對(duì)長(zhǎng)豐鰱雌性親魚肝臟和卵巢的營(yíng)養(yǎng)成分和脂肪酸成分進(jìn)行了測(cè)定和分析，研究其在卵巢發(fā)育后期中卵黃物質(zhì)的積累變化，為進(jìn)一步了解繁殖期長(zhǎng)豐鰱卵巢和肝臟營(yíng)養(yǎng)狀況，明確親魚的營(yíng)養(yǎng)程度，尤其是其脂肪和必需脂肪酸水平，以此來推測(cè)親魚的繁殖性能[16-17]，以期為長(zhǎng)豐鰱親魚培育提供參考。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

根據(jù)鰱的性腺發(fā)育規(guī)律，于2017年3-5月在長(zhǎng)江水產(chǎn)研究所潛江長(zhǎng)豐鰱繁育基地采集健康雌性長(zhǎng)豐鰱親魚，隨機(jī)選取4齡親魚各3尾，每隔7 d取樣一次，連續(xù)取樣6周，共18個(gè)樣品。測(cè)量體長(zhǎng)均值為63.5 cm、體重均值為4 800 g，解剖后取肝臟及卵巢，迅速置于-20 ℃冰箱冷凍保存。

依據(jù)卵巢的大小、形狀、色澤等不同對(duì)性腺成熟度進(jìn)行劃分[18]。本研究中，所取卵巢分期處于Ⅳ期初、Ⅳ期中、Ⅳ期末、Ⅴ期和產(chǎn)卵。按照取樣時(shí)間先后定為發(fā)育階段1、2、3、4、5、6； 其中，每個(gè)發(fā)育階段所對(duì)應(yīng)的性腺分期，如表1所示。

表1 每個(gè)發(fā)育階段所對(duì)應(yīng)的性腺分期Tab.1 Gonad staging at each developmental stage

注：CL1：發(fā)育階段1；CL2：發(fā)育階段2；CL3：發(fā)育階段3；CL4：發(fā)育階段4；CL5：發(fā)育階段5；CL6：發(fā)育階段6。

1.2 測(cè)定方法

1.2.1 水分、灰分、粗蛋白、粗脂肪含量檢測(cè)

按照不同發(fā)育階段，取每條魚肝臟和卵巢分別攪碎混勻后取混合樣品50 g，在-20 ℃條件下短暫保存，用凱氏定氮法測(cè)定粗蛋白的含量，索氏抽提法測(cè)定粗脂肪含量，水分和灰分分別采用烘干法(100±5)℃和馬弗爐灼燒法(550±15)℃測(cè)定。

1.2.2 脂肪酸檢測(cè)

脂肪酸分別為不同發(fā)育階段3條魚混合卵巢和肝臟樣品，中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院油料作物研究所測(cè)試中心測(cè)定，并出具檢測(cè)報(bào)告。

1.2.3 數(shù)據(jù)分析

利用Microsoft Office 2007、SPSS 22.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，Duncan多重比較進(jìn)行單因素方差分析，顯著性差異為P<0.05。

2 結(jié)果

2.1 卵巢組織學(xué)切片觀察

第Ⅳ時(shí)相的細(xì)胞處于生長(zhǎng)期的初級(jí)卵母細(xì)胞。卵細(xì)胞內(nèi)卵黃物質(zhì)不斷沉積，卵徑可達(dá)770-960 μm(表2)。根據(jù)卵黃顆粒沉積的程度，Ⅳ時(shí)相又劃分為早、中、晚3個(gè)時(shí)期。

Ⅳ時(shí)相早期的主要形態(tài)特征為卵母細(xì)胞直徑約778 μm，細(xì)胞質(zhì)外圍出現(xiàn)卵黃顆粒、卵黃泡，在質(zhì)膜內(nèi)緣出現(xiàn)皮層泡。細(xì)胞核體積變小，形狀變得不規(guī)則(圖1-1)。

Ⅳ時(shí)相中期的主要形態(tài)特征為卵母細(xì)胞直徑約864 μm，卵黃顆粒充滿核外空間，接近細(xì)胞核的卵黃顆粒和卵黃泡體積較大，部分卵黃顆粒開始融合成卵黃小板；卵膜周圍卵黃泡較小，其中積累的卵黃物質(zhì)為紫紅色。細(xì)胞核中位或偏位，體積進(jìn)一步變小(圖1-2、圖1-3)。

Ⅳ時(shí)相晚期的主要形態(tài)特征為卵母細(xì)胞直徑約952 μm，卵黃物質(zhì)充滿細(xì)胞質(zhì)，卵黃顆粒融合成卵黃小板，多為橢圓形。細(xì)胞核體積變小，發(fā)生偏位并逐步移向動(dòng)物極，細(xì)小的核仁分布于細(xì)胞核中。放射帶厚度增大(圖1-4)。

第Ⅴ時(shí)相的卵母細(xì)胞為次級(jí)卵母細(xì)胞。卵母細(xì)胞體積達(dá)到最大，細(xì)胞直徑約1 064 μm。卵黃顆粒融合成板狀卵黃的趨勢(shì)更明顯；細(xì)胞核移至動(dòng)物極，核膜消失，濾泡膜破裂，卵粒跌入卵巢腔，成為游離卵(圖1-5、圖1-6)。

表2 長(zhǎng)豐鰱卵巢發(fā)育后期卵母細(xì)胞直徑Tab.2 The oocyte diameter of Changfeng silver carp in the late ovarian development period /μm

注：卵母細(xì)胞直徑均為3次樣品重復(fù)；CL1：發(fā)育階段1；CL2：發(fā)育階段2；CL3：發(fā)育階段3；CL4：發(fā)育階段4；CL5：發(fā)育階段5；CL6：發(fā)育階段6。

圖1 長(zhǎng)豐鰱卵巢組織切片觀察Fig.1 Histological observations for ovary of Changfeng silver carp注： 1：發(fā)育階段1，Ⅳ期初卵巢(×40)；2：發(fā)育階段2，Ⅳ期中卵巢(×40)；3：發(fā)育階段3，Ⅳ期中卵巢(×40)； 4：發(fā)育階段4，Ⅳ期末卵巢(×40)；5：發(fā)育階段5，Ⅴ期卵巢(×40)；6：發(fā)育階段6，產(chǎn)卵卵巢(×40). O：卵母細(xì)胞；N：細(xì)胞核；Nu：核仁；YG：卵黃顆粒；YP：卵黃小板；PO：初級(jí)卵母細(xì)胞；ZR：放射帶；CA：皮層泡

2.2 卵巢和肝臟的營(yíng)養(yǎng)成分

測(cè)定了雌性長(zhǎng)豐鰱親本卵巢發(fā)育后期卵巢中水分、蛋白質(zhì)、脂肪、灰分的含量。隨著性腺發(fā)育，卵巢組織中水分含量逐漸增加，尤其發(fā)育階段6(即產(chǎn)卵階段)水分顯著增多(P<0.05)，所占比例范圍為61.39%～70.06%；卵巢組織中蛋白質(zhì)含量在前5個(gè)發(fā)育階段逐漸增加，在發(fā)育階段6顯著減少(P<0.05)，即蛋白質(zhì)含量在Ⅳ期-Ⅴ期過程中逐漸上升，在產(chǎn)卵階段含量顯著下降，所占比例范圍為21.28%～27.18%；卵巢中脂肪含量在前5個(gè)發(fā)育階段逐漸增多，在發(fā)育階段6顯著降低(P<0.05)，即脂肪含量在Ⅳ期-Ⅴ期過程中逐漸上升，在產(chǎn)卵階段含量顯著下降，所占比例范圍是3.32%～5.66%；卵巢中的灰分含量穩(wěn)定不變。(表3)

隨著性腺發(fā)育，長(zhǎng)豐鰱肝臟中水分含量平穩(wěn)增長(zhǎng)，所占比例范圍為76.56%～80.52%；肝臟組織中粗蛋白含量基本穩(wěn)定不變；肝臟中粗脂肪含量逐漸下降，尤其是產(chǎn)卵階段顯著下降(P<0.05)，所占比例范圍為0.97%～2.47%；肝臟中的灰分含量基本穩(wěn)定不變。(表3)

表3卵巢發(fā)育后期卵巢和肝臟的營(yíng)養(yǎng)成分
Tab.3Thenutrientsinovaryandliverduringthelateovariandevelopmentperiod/%

注：水分，灰分，粗蛋白，粗脂肪均為3次樣品重復(fù)；CL1：發(fā)育階段1；CL2：發(fā)育階段2；CL3：發(fā)育階段3；CL4：發(fā)育階段4；CL5：發(fā)育階段5；CL6：發(fā)育階段6。

2.3 卵巢和肝臟的脂肪酸組成

測(cè)定長(zhǎng)豐鰱卵巢發(fā)育后期卵巢和肝臟組織中脂肪酸的組成及相對(duì)含量。從表4中可知，卵巢和肝臟中主要有21種脂肪酸。其中，有7種飽和脂肪酸(saturated fatty acid，SFA)，分別是C14∶0、C15∶0、C16∶0、C17∶0、C18∶0、C20∶0、C22∶0；7種單不飽和脂肪酸(monounsaturated fatty acid，MUFA)，分別是C14∶1、C15∶1、C16∶1、C17∶1、C18∶1、C20∶0、C24∶1；7種多不飽和脂肪酸(polyunsaturated fatty acid，PUFA)，分別是C18∶2、C18∶3、C20∶2、C20∶3、C20∶4、C20∶5、C22∶6。

不同發(fā)育階段的卵巢中主要脂肪酸有C16∶0、C16∶1、C18∶0、C18∶1、C20∶5和C22∶6，其中C16∶0、C18∶1和C22∶6所占比例較大。不同發(fā)育階段的高度不飽和脂肪酸含量無顯著區(qū)別，所占比例范圍是26.4%-29.1%；但是，二十二碳六烯酸(DHA)含量總體上呈上升趨勢(shì)；花生四烯酸(AA)含量在性腺發(fā)育的前5個(gè)發(fā)育階段呈下降趨勢(shì)，在發(fā)育階段6含量上升，即AA含量在性腺發(fā)育的Ⅳ期、Ⅴ期過程中呈下降趨勢(shì)，在產(chǎn)卵階段含量上升；花生五烯酸(EPA)含量在性腺發(fā)育的前4個(gè)發(fā)育階段呈上升趨勢(shì)，隨后呈下降趨勢(shì)，即EPA含量在性腺發(fā)育Ⅳ期過程中呈上升趨勢(shì)，在Ⅴ期-產(chǎn)卵過程中含量下降。

不同發(fā)育階段的肝臟中主要脂肪酸有C16∶0、C16∶1、C18∶0、C18∶1、C20∶4和C22∶6，其中C16∶0、C18∶0和C18∶1所占比例較大。高度不飽和脂肪酸含量在性腺發(fā)育的前5個(gè)發(fā)育階段呈下降趨勢(shì)，在發(fā)育階段6含量增多；且在高度不飽和脂肪酸中，二十二碳六烯酸(DHA)、花生四烯酸(AA)、花生五烯酸(EPA)含量在性腺發(fā)育的前5個(gè)發(fā)育階段呈下降趨勢(shì)，在發(fā)育階段6含量上升，即DHA、AA，EPA含量在性腺發(fā)育的Ⅳ期、Ⅴ期過程中呈下降趨勢(shì)，在產(chǎn)卵階段含量上升。

表4 卵巢發(fā)育后期卵巢和肝臟的脂肪酸組成Tab.4 Fatty acid in ovary and liver during the late ovarian development period %

續(xù)表4

注：脂肪酸檢出限0.05%，各脂肪酸檢出結(jié)果為相對(duì)含量，測(cè)量2次樣品，取平均值；CL1：發(fā)育階段1；CL2：發(fā)育階段2；CL3：發(fā)育階段3；CL4：發(fā)育階段4；CL5：發(fā)育階段5；CL6：發(fā)育階段6。

3 討論

3.1 卵巢和肝臟的營(yíng)養(yǎng)成分分析

長(zhǎng)豐鰱卵巢發(fā)育后期中卵巢和肝臟的營(yíng)養(yǎng)成分占總重量的比例關(guān)系為：水分>蛋白質(zhì)>脂肪>灰分。魚類的生化構(gòu)成主要包含水分、灰分、蛋白質(zhì)、脂肪、碳水化合物等。其中碳水化合物、蛋白質(zhì)和脂肪是生物體內(nèi)能量的主要物質(zhì)載體，但魚體內(nèi)的碳水化合物含量大約僅占0.5%，在研究中不作為重點(diǎn)研究指標(biāo)[19]。

肝臟和卵巢間結(jié)果比較：肝臟中的水分含量>卵巢中的水分含量，平均值分別是79.03%和64.70%；肝臟中的粗蛋白含量<卵巢中的粗蛋白含量，平均值分別為13.79%和25.35%；肝臟中的脂肪含量<卵巢中的脂肪含量，平均值分別為1.52%和4.56%，可見性腺發(fā)育過程中親魚脂肪和蛋白質(zhì)的儲(chǔ)存主要集中在卵巢[20]。

隨著性腺發(fā)育，卵巢中水分含量尤其在產(chǎn)卵階段水分顯著增多(P<0.05)，卵細(xì)胞吸水。卵巢內(nèi)的蛋白質(zhì)、脂肪含量在Ⅳ期-Ⅴ期過程中逐漸上升，在產(chǎn)卵階段含量顯著下降(P<0.05)，主要是由于卵細(xì)胞吸水，粗蛋白和脂肪的相對(duì)含量降低，絕對(duì)含量不變。肝臟中的粗脂肪含量顯著下降(P<0.05)。研究表明，魚類在卵巢發(fā)育過程中，卵黃物質(zhì)首先在肝臟中合成，然后轉(zhuǎn)移至卵巢[21]，卵巢內(nèi)積累大量卵黃物質(zhì)，脂類便是卵黃物質(zhì)積累的主要成分之一。脂肪等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)在卵巢內(nèi)大量蓄積，使卵巢內(nèi)充滿卵黃顆粒，可為受精卵及胚胎的后續(xù)發(fā)育提供能量和物質(zhì)保障[22]。

3.2 卵巢和肝臟中脂肪酸組成與分析

長(zhǎng)豐鰱肝臟和卵巢脂肪酸相對(duì)含量的不同是由組織間生理功能的差別所決定的。肝臟作為消化器官，有儲(chǔ)存并向其他組織供給營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的功能，其組織內(nèi)的脂肪酸構(gòu)成容易受食物中脂肪酸組成的影響[23]。對(duì)于長(zhǎng)豐鰱卵巢來說，營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的積累和構(gòu)成不但要滿足卵細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)和新陳代謝的需要，還要滿足胚胎發(fā)育以及仔魚成長(zhǎng)的需要，所以各種脂肪酸之間合理組成的意義越發(fā)重要。

特殊脂肪酸對(duì)胚胎發(fā)育過程中系統(tǒng)的發(fā)生和發(fā)育有著重要作用，如高度不飽和脂肪酸DHA和EPA對(duì)魚類的繁殖、生長(zhǎng)和發(fā)育都有十分重要的作用[24-25]。繁殖季節(jié)長(zhǎng)豐鰱卵巢中DHA含量相當(dāng)高，這與劉玉芳[10]測(cè)得鯉魚卵巢中的情況相似。此階段卵巢中DHA含量大于肝臟中DHA含量，表明長(zhǎng)豐鰱親魚在性腺發(fā)育過程中，可能優(yōu)先從肝臟中使用DHA，并選擇性的在卵巢中蓄積。長(zhǎng)豐鰱卵巢中DHA含量占總脂肪酸含量的比例較高為12.9%～15.5%，而EPA含量占總脂肪酸含量的比例為6.0%～6.8%，低于DHA含量。許多淡水魚類能將EPA轉(zhuǎn)化成DHA[26]，DHA含量高于EPA可能與這種轉(zhuǎn)化有關(guān)。長(zhǎng)豐鰱卵巢中HUFA含量高于肝臟，尤其是DHA、AA和EPA，這是由于卵巢中富集豐富的HUFA營(yíng)養(yǎng)可為卵子和胚胎的發(fā)育提供相應(yīng)的營(yíng)養(yǎng)[27]。HUFA在卵巢中選擇性的積累規(guī)律，在多種魚類[28-29]及貝類中均得到相應(yīng)證實(shí)[30]。

肝臟是魚類脂類和脂肪酸合成的主要器官，肝細(xì)胞通過從食物中攝取磷脂、中性脂肪等，并對(duì)脂肪酸進(jìn)行一系列的分解和合成，進(jìn)而促進(jìn)脂肪酸代謝[31]。C16∶0是脂肪酸合成過程中優(yōu)先被合成的脂肪酸之一，因此肝臟中的C16∶0含量很高。本研究中，C16∶0在肝臟中的含量最高為24.6%～33.3%。有研究表明，單不飽和脂肪酸作為能源物質(zhì)最先被利用[32]。卵巢發(fā)育后期長(zhǎng)豐鰱雌性親魚卵巢和肝臟中單不飽和脂肪酸含量豐富，占總脂肪酸含量分別為38.5%～43.1%和33.0%～40.7%。C18∶1在卵巢和肝臟的不飽和脂肪酸中含量最高，占總脂肪酸的含量分別為16.2%～19.8%和20.0%～26.1%，可能是主要的供能物質(zhì)[33]。

Watanabe等對(duì)真鯛(Chrysophrys major)的研究表明，魚類的營(yíng)養(yǎng)狀況是影響親魚繁殖性能的重要因素[34]。雌魚卵巢的脂類含量及其脂肪酸的構(gòu)成，對(duì)其繁殖能力以及受精后的胚胎發(fā)育具有重要影響[35]。了解親魚卵巢和肝臟的脂肪酸構(gòu)成，對(duì)于確定親魚強(qiáng)化餌料或仔魚開口餌料中脂肪酸營(yíng)養(yǎng)水平具有一定的指導(dǎo)作用。