碳酸氫鈉誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞凋亡機(jī)制研究

張巖 喬錄新 曾靜 徐軍 石英

[摘要] 目的 探討碳酸氫鈉（NaHCO3）對(duì)肝癌生長(zhǎng)的影響及其機(jī)制。 方法 5只7周齡裸鼠于無特定病原體（SPF）條件下的層流架中飼養(yǎng)，皮下注射肝癌細(xì)胞株HepG2細(xì)胞構(gòu)建肝癌模型，并通過腫塊內(nèi)局部注射5%NaHCO3，體內(nèi)研究肝癌腫塊生長(zhǎng)及組織壞死。Calcein/PI染色和流式細(xì)胞技術(shù)體外研究不同酸堿環(huán)境和NaHCO3作用下HepG2凋亡情況。蛋白印跡技術(shù)檢測(cè)NaHCO3作用下HepG2細(xì)胞凋亡調(diào)控蛋白Bax/bcl2表達(dá)水平。 結(jié)果 5只裸鼠肝癌5%NaHCO3局部注射4周，3只腫塊明顯縮小，1只腫塊長(zhǎng)大，1只小鼠實(shí)驗(yàn)過程中死亡。5%NaHCO3 3/4、1/2、1/4、1/8、1/16和0（對(duì)照）培養(yǎng)基體積占比，Calcein/PI染色顯示HepG2細(xì)胞凋亡率依次減低。流式細(xì)胞分析顯示5%NaHCO3 1/2、1/4、1/8、1/16體積占比和對(duì)照組細(xì)胞凋亡率也依次減低。Calcein/PI染色顯示培養(yǎng)基pH6.0、pH6.25、pH6.5、pH6.75、pH7.0、pH7.25、pH7.5、pH7.75、pH8.0的HepG2細(xì)胞凋亡率在pH7.0～7.25最低，隨著酸堿度的增加凋亡率逐漸增加。流式細(xì)胞分析培養(yǎng)基pH6.25、pH6.5、pH6.75、pH7.0、pH7.25和pH7.5組細(xì)胞凋亡率變化顯示類似結(jié)果。5%NaHCO3占1/4培養(yǎng)基體積比條件下HepG2細(xì)胞促凋亡的Bax mRNA和蛋白水平與對(duì)照相比較無明顯變化，而抑凋亡的bcl2 mRNA和蛋白水平明顯低于對(duì)照組。 結(jié)論 NaHCO3可通過改變肝癌組織內(nèi)環(huán)境酸堿度，繼而抑制凋亡功能蛋白blc2誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞凋亡。

[關(guān)鍵詞] 碳酸氫鈉；肝細(xì)胞癌；凋亡；治療

[中圖分類號(hào)] G735.7 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A [文章編號(hào)] 1673-7210（2018）08（b）-0009-04

[Abstract] Objective To explore the apoptotic mechanism of hepatocellular carcinoma （HCC） induced by sodium bicarbonate （SB）. Methods HepG2 cells were implanted the subcutaneous of 5 athymic mice （7-week age） to form hepatocarcinoma mouse model and the growth and necrosis of hepatocellular carcinoma was observed under the condition of local mass injection of 5% SB. The apoptosis of hepatocellular carcinoma cell line HepG2 was observed by Calcein/PI staining and flow cytometry at SB exposure and different pH gradients. The expression of Bax/bcl2 were also detected in HepG2 cells under SB exposure by real-time PCR and western blotting. Results Animal in vivo studies revealed that 5% SB local injection for 4 weeks could inhibit tumor growth and cause tumor necrosis in 3 of 5 hepatocarcinoma mice. One hepatocarcinoma mice died and another mice had an enlarged tumor. 5% SB was diluted to the volume ratio 3/4， 1/2， 1/4， 1/8， 1/16 and negative control by DMEM and Calcein/PI staining in vitro showed that HepG2 apoptosis mice decreased in turn. Flow cytometry showed the similar results in 5% SB volume ratio： 1/2， 1/4， 1/8 and 1/16. The medium DMEM was titrated to pH6.0， pH6.25， pH6.5， pH6.75， pH7.0， pH7.25， pH7.5， pH7.75 and pH8.0. The lowest rate of HepG2 apoptosis was at pH7.0 and pH7.25. As the increasing of acidity or alkalinity， the apoptosis rate of HepG2 increased gradually. Flow cytometry also showed the similar results. Compared with control， Bax mRNA and protein expression in SB exposed HepG2 cell were not changed， but bcl2 mRNA and protein expression were decreased. Conclusion SB can induce HCC apoptosis by changing the internal environmental pH and inhibiting the expression of apoptotic protein blc2.

[Key words] Sodium bicarbonate； Hepatocellular carcinoma； Apoptosis； Treatment

由于慢性乙型肝炎病毒感染人口基數(shù)較大，肝癌在中國有很高的發(fā)病率[1]。因此，對(duì)于肝癌的有效治療具有非常重要的意義[2-3]。目前肝癌治療手段主要為手術(shù)切除和介入治療[4]，而肝癌介入治療主要為肝動(dòng)脈栓塞化療和射頻消融[5-6]。有研究發(fā)現(xiàn)碳酸氫鈉可提高肝動(dòng)脈栓塞化療對(duì)肝癌的療效[7-8]，但確切機(jī)制尚不完全清楚。本研究通過體內(nèi)外研究方法探索碳酸氫鈉對(duì)肝癌生長(zhǎng)的影響及其可能機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物、細(xì)胞和實(shí)驗(yàn)材料

5只7周齡胸腺缺失小鼠（裸鼠）購自中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院，HepG2細(xì)胞株來自北京市肝病研究所。小鼠抗bcl2單克隆抗體購自Santa Cruz公司（USA）；兔抗bax多克隆抗體購自Abcam公司（Cambridge，UK）；碘化丙啶（propidium iodide，PI）、β-actin單克隆抗體購自Sigma公司（St. Louis，MO）；辣根過氧化物酶標(biāo)記抗小鼠和抗兔二抗購自Jackson公司（USA）；鈣黃綠素-AM（Calcein）購自Invitrogen公司（Eugene，OR）；DMEM培養(yǎng)基，青/鏈霉素購自Gibco公司；牛血清白蛋白（BSA）購自羅氏公司（IN， USA）；鼠FITC-IgG1/PE-IgG1單抗為Pharming公司產(chǎn)品；其他相關(guān)分析純?cè)噭┵徸試鴥?nèi)生產(chǎn)公司。實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組小鼠給予相同光照、室溫、飼料等飼養(yǎng)條件，并在無特定病原體（SPF）條件下的層流架中飼養(yǎng)。嚴(yán)格按照《首都醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)室實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用管理規(guī)定》使用實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物合格證號(hào)2012-0004。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)和Calcein/PI吸收試驗(yàn)

無菌條件下，使用含15%胎BSA和1%青/鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基將復(fù)蘇的HepG2細(xì)胞平鋪在12孔培養(yǎng)板，細(xì)胞濃度為1×104/cm2。并按照實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)加入特定的酸性或堿性液體，置于37℃、體積分?jǐn)?shù)為0.05 CO2恒濕培養(yǎng)箱溫育24 h進(jìn)行相關(guān)細(xì)胞和蛋白實(shí)驗(yàn)。Calcein/PI吸收試驗(yàn)通過細(xì)胞培養(yǎng)基中加入1 μg/mL Calcein-AM 37℃溫育30 min，再加入10 μg/mL PI溫育15 min，倒置熒光顯微鏡下觀察并計(jì)數(shù)存活和凋亡的神經(jīng)細(xì)胞。Calcein-AM染成活細(xì)胞，呈綠色；PI染凋亡/死亡細(xì)胞，為紅色，其中死亡細(xì)胞核固縮，凋亡細(xì)胞核大而松散。40倍物鏡下每個(gè)實(shí)驗(yàn)點(diǎn)取3個(gè)視野計(jì)數(shù)的平均數(shù)。通過熒光顯微鏡下細(xì)胞計(jì)數(shù)，并依據(jù)公式：PI/（PI+Calcein-AM）×100%計(jì)算凋亡細(xì)胞所占比例。

1.3 流式細(xì)胞技術(shù)

去除處理后的HepG2細(xì)胞培養(yǎng)基，加入1×PBS稀釋的儲(chǔ)存濃度為10 mg/mL的HE于二甲基亞砜（DMSO中儲(chǔ)存）（Polysciences， Warrington，PA），使終濃度為50 μg/mL。避光，37°C孵育10 min。最后用BDFACSDiva流式細(xì)胞儀對(duì)細(xì)胞進(jìn)行分析（BD FACS CantoTM Ⅱ）。HE在490 nm波長(zhǎng)處被激發(fā)，在620 nm波長(zhǎng)處可被檢測(cè)到。儲(chǔ)存10 000個(gè)細(xì)胞的數(shù)據(jù)，然后用CellQuest軟件進(jìn)行分析。

1.4 核酸提取和實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)

通過RNA提取試劑盒（Biomed Biology，北京）提取總RNA，應(yīng)用Superscript HI Rt-PCR首鏈合成系統(tǒng)試劑盒（Invitrogen），將提取的RNA反轉(zhuǎn)為cDNA，具體操作按照說明書進(jìn)行。采用Taqman探針法進(jìn)行實(shí)時(shí)定量PCR（qPCR）檢測(cè)Bax和blc2 mRNA水平。以甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）基因?yàn)閮?nèi)參。引物和探針由上海Invitrogen公司合成，具體實(shí)驗(yàn)步驟和引物探針見文獻(xiàn)[9]。依照相對(duì)于對(duì)照組基因拷貝增減的倍數(shù)等于2-△△CT的相對(duì)定量法計(jì)算實(shí)驗(yàn)組基因變化。使用儀器為美國TaqMan 7900 TqPCR檢測(cè)系統(tǒng)。

1.5 蛋白提取與蛋白印跡

HepG2細(xì)胞通過RIPA裂解液裂解，蛋白濃度通過BCA 蛋白檢測(cè)試劑盒檢測(cè)（Biomed Biology，北京）。蛋白質(zhì)印跡一抗用1×PBS+3% BSA（1∶1000）稀釋，二抗用1×PBS+3%脫脂牛奶（1∶1000）稀釋。12%聚丙烯酰胺凝膠蛋白（30 μg）上樣，30 V電壓轉(zhuǎn)膜（硝酸纖維素膜）過夜，5%脫脂牛奶封閉，一抗（抗小鼠bcl2和抗β-actin單克隆抗體與抗兔Bax多克隆抗體）37℃溫育1 h，二抗（對(duì)應(yīng)的辣根過氧化物酶標(biāo)記抗小鼠二抗和抗兔二抗）室溫1 h，暗室發(fā)光洗片并掃描成像。

1.6 肝癌動(dòng)物模型構(gòu)建與碳酸氫鈉處理

培養(yǎng)HepG2細(xì)胞，使得細(xì)胞濃度達(dá)到6×106/mL。取5只裸鼠皮下注射上述HepG2細(xì)胞0.2 mL，SPF條件下飼養(yǎng)2周見小鼠皮下種植HepG2細(xì)胞部位長(zhǎng)出實(shí)性腫塊，且逐漸長(zhǎng)大，考慮荷瘤成功。第3周開始隔日1次0.2 mL NaHCO3腫塊內(nèi)注射，連續(xù)4周。觀察腫塊生長(zhǎng)情況。

1.7 石蠟切片和HE染色

通過頸部脫臼處死實(shí)驗(yàn)小鼠并迅速解剖分離腫瘤組織，10%甲醛固定，乙醇脫水并予以二甲苯透明，石蠟包埋，用切片機(jī)切成6 μm厚薄片，45℃恒溫箱中烘干，將已入蒸餾水后的切片放入蘇木精水溶液中染色5 min，酸水及氨水中分色，各10 s，流水沖洗1 h后入蒸餾水5 min，入70%和90%酒精中脫水各10 min，入酒精伊紅染色液染色3 min，染色后的切片經(jīng)純酒精脫水，再經(jīng)二甲苯使切片透明，將已透明的切片滴上加拿大樹膠，蓋上蓋玻片封固。顯微鏡下讀片拍照。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用PASW statistics 18統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，兩組間比較采用t檢驗(yàn)，以P < 0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 局部注射碳酸氫鈉對(duì)肝癌腫塊生長(zhǎng)和肝癌組織壞死的影響

5%NaHCO3局部注射組5只小鼠4周觀察發(fā)現(xiàn)，3只腫塊明顯縮小，1只療效較差出現(xiàn)腫塊進(jìn)一步長(zhǎng)大，1只小鼠實(shí)驗(yàn)過程中死亡（圖1A）。針對(duì)肝癌組織的HE染色發(fā)現(xiàn)5%NaHCO3干預(yù)可引起腫塊組織壞死（圖1B）。

2.2 碳酸氫鈉對(duì)肝癌細(xì)胞凋亡的影響

5%NaHCO3被按照不同體積占比替換肝癌細(xì)胞株HepG2細(xì)胞培養(yǎng)基DMEM。在5%NaHCO3完全替換DMEM情況下，HepG2細(xì)胞迅速死亡。因此，實(shí)驗(yàn)所用5%NaHCO3所占DMEM培養(yǎng)基體積比依次為3/4， 1/2，1/4，1/8，1/16和0（對(duì)照）。HepG2細(xì)胞培養(yǎng)24 h后觀察細(xì)胞凋亡情況。研究發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞凋亡率與5%NaHCO3所占培養(yǎng)基體積比呈正相關(guān)，在NaHCO3（1/8）組對(duì)HepG2細(xì)胞生長(zhǎng)影響即明顯減弱。通過流式細(xì)胞進(jìn)一步分析細(xì)胞凋亡情況，因NaHCO3（3/4）組細(xì)胞幾乎全部死亡，故觀察NaHCO3（1/2）、NaHCO3（1/4）、NaHCO3（1/8）、NaHCO3（1/16）和對(duì)照組，其細(xì)胞凋亡率依次減低。見圖2（封三）。

2.3 不同pH值條件下肝癌細(xì)胞凋亡情況

由于HCO3-是調(diào)節(jié)人體體液酸堿平衡重要的堿性陰離子，假設(shè)NaHCO3通過形成腫瘤細(xì)胞外液堿性微環(huán)境誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞凋亡。由此，滴定HepG2細(xì)胞培養(yǎng)基DMEM酸堿度，形成pH6.0、pH6.25、pH6.5、pH6.75、pH7.0、pH7.25、pH7.5、pH7.75、pH8.0等不同pH值DMEM培養(yǎng)基。HepG2細(xì)胞分別在上述培養(yǎng)基中培養(yǎng)24 h后觀察細(xì)胞凋亡情況。Calcein/PI染色顯示pH7.0～7.25細(xì)胞凋亡率最低。隨著酸度或堿度的逐漸加大，細(xì)胞凋亡率逐漸增高。通過流式細(xì)胞進(jìn)一步分析細(xì)胞凋亡情況，因pH6.0、pH7.75和pH8.0組細(xì)胞死亡率極高，故觀察pH6.25、pH6.5、pH6.75、pH7.0、pH7.25和pH7.5組，其細(xì)胞凋亡情況和上述結(jié)果類似。見圖3（封三）。

2.4 碳酸氫鈉通過抑制凋亡調(diào)控蛋白bcl2的表達(dá)誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞凋亡

為了進(jìn)一步探索碳酸氫鈉所導(dǎo)致的肝癌細(xì)胞凋亡機(jī)制，取細(xì)胞凋亡調(diào)控兩個(gè)重要蛋白Bax/bcl2進(jìn)行研究，通過實(shí)時(shí)定量PCR和蛋白印跡方法觀察5%NaHCO3對(duì)Bax/bcl2 mRNA和蛋白表達(dá)水平的影響。研究發(fā)現(xiàn)5%NaHCO3占1/4培養(yǎng)基體積比條件下培養(yǎng)24 h的HepG2細(xì)胞促凋亡的Bax mRNA表達(dá)水平改變不明顯，而bcl2 mRNA表達(dá)水平明顯減低。進(jìn)一步蛋白研究顯示實(shí)驗(yàn)組Bax無明顯改變。抑凋亡的bcl2相對(duì)于β-actin平均蛋白表達(dá)水平明顯減低。見圖4。

3 討論

肝癌是肝細(xì)胞起源的惡性腫瘤，占世界男性惡性腫瘤發(fā)病第5位和女性第9位[10]。我國人群發(fā)生肝癌多數(shù)與慢性乙型肝炎病毒感染相關(guān)[11]。目前對(duì)于肝癌治療多數(shù)采用手術(shù)腫瘤切除、局部介入治療以及生物靶向治療等。介入治療往往聯(lián)合肝動(dòng)脈栓塞化療和經(jīng)皮肝穿刺肝癌射頻消融治療等[5，12]。有報(bào)道NaHCO3被用于肝動(dòng)脈栓塞化療的輔助治療。

腫瘤細(xì)胞的生理活動(dòng)離不開穩(wěn)定的細(xì)胞內(nèi)和組織間液的pH值。人體血液正常pH值為7.35～7.45，組織液pH值一般為7.0～7.5，而細(xì)胞漿的pH值是7.20～7.45[8]。不同組織液和細(xì)胞液pH值可以存在較大差異。細(xì)胞生命活動(dòng)過程中會(huì)產(chǎn)生多種酸性和/或堿性物質(zhì)影響身體內(nèi)環(huán)境的酸堿度，而另一方面正常人體存在著非常有效的酸堿調(diào)節(jié)系統(tǒng)用來維持機(jī)體的酸堿平衡，比如血液HCO3-/H2CO3的迅速調(diào)節(jié)作用，肺通過呼出二氧化碳排出體內(nèi)可揮發(fā)性酸，腎臟通過腎小球排出不可揮發(fā)性酸性代謝產(chǎn)物以及腎小管重吸收NaHCO3和電解質(zhì)來相對(duì)持久性調(diào)節(jié)機(jī)體酸堿平衡等[13-14]。

NaHCO3通過改變腫瘤細(xì)胞或組織局部酸堿度來抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)和正常功能活動(dòng)理論上是可行的[15-16]，因?yàn)槠渖L(zhǎng)和正常功能活動(dòng)所需要的酶的活性受到抑制，不能發(fā)揮其正常功能。本研究也證實(shí)NaHCO3改變肝癌組織細(xì)胞內(nèi)環(huán)境酸堿度，通過細(xì)胞凋亡功能蛋白抑制肝癌腫瘤生長(zhǎng)。

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（收稿日期：2018-04-18 本文編輯：李岳澤）