羥基磷灰石碳納米管對(duì)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的毒性作用及多向分化的影響

宋國棟 郭小雙 宗憲磊

[摘要] 目的 制備羥基磷灰石修飾的多壁碳納米管（HA-MWCNTs），探索HA-MWCNTs對(duì)大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（BMSCs）的毒性作用及其多向分化能力的影響，為HA-MWCNTs在組織工程中的應(yīng)用提供試驗(yàn)依據(jù)。 方法 制備HA-MWCNTs，通過透視電鏡、X線衍射分析其微觀形態(tài)；取體重100～150 g的4周齡雌性SD大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，利用體外細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)，將第3代BMSCs與HA-MWCNTs或未修飾的多壁碳納米管（MWCNTs）共培養(yǎng)，通過MTT法及活死細(xì)胞檢測(cè)評(píng)估碳納米管對(duì)BMSCs的細(xì)胞毒性；通過誘導(dǎo)其脂向及骨向分化，評(píng)估碳納米管對(duì)BMSCs多向分化能力的影響。 結(jié)果 與對(duì)照組比較，Raw-MWCNTs對(duì)細(xì)胞增殖有明顯抑制作用（P < 0.05），而HA-MWCNTs對(duì)細(xì)胞增殖活力影響較?。≒ > 0.05）；活死細(xì)胞檢測(cè)提示HA-MWCNTs組死細(xì)胞率較低。HA-MWCNTs使 BMSCs骨向分化相關(guān)基因Cbfal/Runx2、BSP、OCN的信使RNA升高（P < 0.05），脂向分化相關(guān)基因aP2、脂蛋白脂酶的信使RNA降低（P < 0.05）。 結(jié)論 與MWCNTs比較，HA-MWCNTs對(duì)細(xì)胞的增殖影響較小，細(xì)胞毒性較低，生物相容性良好。HA-MWCNTs可促進(jìn)BMSCs骨向分化，抑制其脂向分化。其在骨組織工程領(lǐng)域中的應(yīng)用具有良好前景。

[關(guān)鍵詞] 羥基磷灰石；碳納米管；骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞；多向分化

[中圖分類號(hào)] R318.08 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A [文章編號(hào)] 1673-7210（2018）08（c）-0004-06

[Abstract] Objective To develop hydroxyapatite functionalized multi-walled carbon nanotubes （HA-MWCNTs）， and assess the toxicity of HA-MWCNTs on rat′s BMSCs and its influence on the multipotent differentiation of bone marrow derived mesenchymal stem cells （BMSCs）， thereby to provide experimental evidence for its utility in tissue engineering. Methods HA-MWCNTs were synthesized. Transmission electron microscope （TEM）， X-ray diffraction （XRD） were used to observe the microstructure； BMSCs were obtained from female SD rats of 4 weeks old which weighted between 100 to 150 grams. After cultured and expanded to the third passage， cells were co-cultured with HA-MWCNTs and unfunctionalized MWCNTs （MWCNTs）. MTT and live-dead cell assay were used to appraise the toxicity of MWCNTs on BMSCs. BMSCs were then induced and differentiated into adipocytic and osteoblastic cells and were used to assess the influence of MWCNTs on BMSCs′ multipotent differentiation. Results Compared to control group， BMSCs in MWCNTs group were significantly inhibited （P < 0.05）， while in HA-MWCNTs group， BMSCs were slightly inhibited， with no statistical difference （P > 0.05）， and the ratio of dead cells was less in HA-MWCNTs group. The mRNA level of osteogenesis （Cbfal/Runx2， BSP and OCN） was increased （P < 0.05） and the mRNA of adipogenesis （aP2 and LPL） was decreased （P < 0.05） in HA-MWCNTs group. Conclusion Compared with MWCNTs， HA-MWCNTs had slight influence on cell proliferation， trivial toxicity and favorable biocompatibility of BMSCs， meanwhile it could promote osteoblastic and inhibit adipocytic differentiation of BMSCs. HA-MWCNTs may supply a novel platform for applications of scaffold in bone tissue engineering.

[Key words] Hydroxyapatite； Carbon nanotube； Bone-marrow derived mesenchymal stem cell； Multipotent differentiation

腫瘤、創(chuàng)傷、先天性疾病導(dǎo)致的大范圍骨缺損是臨床上面臨的重大難題。骨缺損修復(fù)的方法有自體骨移植、異體骨移植、生物材料移植等方案[1]。自體骨作為骨缺損修復(fù)的金標(biāo)準(zhǔn)，具有生物相容性好、力學(xué)強(qiáng)度適宜等優(yōu)點(diǎn)；然而，取材有限和供區(qū)的繼發(fā)畸形極大地限制了其臨床應(yīng)用[2]。異體骨移植具有排異反應(yīng)和感染疾病的風(fēng)險(xiǎn)，在臨床中應(yīng)用較少[3]。利用具有優(yōu)良骨傳導(dǎo)性的生物材料修復(fù)骨缺損，是目前國內(nèi)外研究的熱點(diǎn)。

羥基磷灰石（hydroxyapatite，HA）是一種生物相容性較高的生物材料，具有優(yōu)良的骨傳導(dǎo)性[4-5]。大量實(shí)驗(yàn)已證實(shí)：將HA材料與骨髓間質(zhì)充質(zhì)干細(xì)胞（bone marrow derived mesenchymal stem cells，BMSCs）復(fù)合，是修復(fù)骨缺損的理想治療方法[6]。然而，HA韌性低、強(qiáng)度差的特點(diǎn)，限制了其在骨組織領(lǐng)域的應(yīng)用[4]。為改善上述缺點(diǎn)，有學(xué)者將HA與碳納米管（carbon nanotubes，CNTs）結(jié)合應(yīng)用于骨組織工程研究中，并發(fā)現(xiàn)復(fù)合材料的強(qiáng)度及骨誘導(dǎo)性大大增強(qiáng)[7]。CNTs是一種具有獨(dú)特的物理、化學(xué)和生物學(xué)性能的納米材料，不僅具有強(qiáng)度高、韌性佳的優(yōu)點(diǎn)，同時(shí)又具有良好的光學(xué)、磁學(xué)及電學(xué)性能[8]。它不僅可以將藥物靶向傳遞至特定組織，而且在紅外線照射下，能夠產(chǎn)熱殺滅病變細(xì)胞，為癌癥治療提供契機(jī)[9]。然而，在范德華力的作用下，CNTs極易在水或者有機(jī)溶劑中聚集成束。大量的實(shí)驗(yàn)證明CNTs具有較大的生物毒性，能夠?qū)M織和器官造成嚴(yán)重的破壞[10-11]。研究表明，HA-MWCNTs可以避免單一材料的缺點(diǎn)，起到增加復(fù)合材料強(qiáng)度及生物相容性的作用[12-14]。然而目前尚缺少HA-MWCNTs對(duì)細(xì)胞的毒性作用及多向分化潛能的相關(guān)研究。

為此，本實(shí)驗(yàn)擬探索羥基磷灰石修飾的多壁碳納米管（hydroxyapatite functionalized multi-walled carbon nanotubes，HA-MWCNTs）對(duì)BMSCs的毒性作用及多向分化能力的影響，為HA-MWCNTs在骨組織工程領(lǐng)域的應(yīng)用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物

4周齡的雌性SD大鼠6只（100～150 g），許可證號(hào)：SYXK（川）2013-119，動(dòng)物合格證號(hào)：01-3001，購自四川大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。動(dòng)物等級(jí)二級(jí)，預(yù)飼養(yǎng)2周。

1.2 藥品與試劑

多壁碳納米管（MWCNTs）：外徑10～20 nm，長度10～20 μm，純度≥95%（成都有機(jī)化學(xué)有限公司，中國科學(xué)院）；HA（成都科隆化學(xué)試劑有限公司）；活死細(xì)胞試劑盒、MTT、a-MEM培養(yǎng)基（GIBCO公司，美國）；堿性磷酸酶檢測(cè)試劑盒（武漢博士德生物試劑有限公司）；油紅O（成都寶信生物試劑有限公司）。

1.3 儀器與設(shè)備

X線衍射儀（XRD，Rigaku D/MAX2VA荷蘭）；透視電鏡（H-800，日本）；熒光倒置顯微鏡（尼康，日本）；ABI Prism 7500實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀（Applied Biosystems company，美國）；水平電泳儀（BL29-DYCP-31DN，中國）。

1.4 實(shí)驗(yàn)方法

1.4.1 HA-MWCNTs制備 利用原位化學(xué)沉淀法合成HA-MWCNTs。將氧化處理的MWCNTs加入SDS溶液中超聲分散2 h；加入到含有Ca（NO3）2·4H2O的生物礦化液中，調(diào)節(jié)pH值至10，超聲分散30 min；按照Ca、P的摩爾比為1.667，配置（NH4）2HPO4溶液，調(diào)節(jié)pH值至10，在劇烈攪拌下逐滴加入上述混合溶液中；將獲得的樣品靜置陳化2 d；用蒸餾水反復(fù)沖洗至濾液pH為7。利用透射電鏡檢測(cè)HA在MWCNTs表面的形成。用XRD測(cè)定HA-MWCNTs的各相成分。

1.4.2 細(xì)胞分離和培養(yǎng) 4周齡的雌性SD大鼠，斷頸處死，70%乙醇消毒30 min，取脛骨和股骨，去除骨上附著的軟組織和骨骺端。將分離的股骨和脛骨移入無菌平皿，用針管抽5 mL PBS將骨髓沖出，用200目濾網(wǎng)過濾，1500 r/min 25℃ 離心4 min（離心半徑9 cm）。將沉淀的細(xì)胞重懸于10 mL培養(yǎng)基中，2×106個(gè)細(xì)胞接種于90 mm培養(yǎng)皿中。接種后24～48 h換液，7～10 d傳代。培養(yǎng)至第三代的BMSCs備用。

1.5 測(cè)量指標(biāo)

1.5.1 MTT 將MWCNTs、HA-MWCNTs溶于a-MEM培養(yǎng)基中，配成10 μg/mL混合培養(yǎng)基。將第三代的BMSCs以每孔103～104個(gè)細(xì)胞接種于96孔培養(yǎng)板中，每孔體積200 μL。放入CO2孵箱，在37℃、5%CO2及飽和濕度下進(jìn)行培養(yǎng)。分別于1、3、5 d對(duì)細(xì)胞活力進(jìn)行評(píng)估。每孔加入MTT溶液（5 mg/mL）20 μL，37℃孵育4 h，終止培養(yǎng)，棄上清液。每孔加入150 μL二甲基亞楓，震蕩10 min后于490 nm波長測(cè)吸光度。

1.5.2 活死細(xì)胞檢測(cè) 將BMSCs與MWCNTs、HA-MWCNTs共培養(yǎng)72 h；運(yùn)用活死細(xì)胞試劑盒對(duì)細(xì)胞進(jìn)行染色，活細(xì)胞呈現(xiàn)綠色熒光，死細(xì)胞呈現(xiàn)紅色熒光。

1.5.3 BMSCs的成骨和成脂誘導(dǎo) 以5×106的細(xì)胞量接種于6孔板；培養(yǎng)基為含或不含30 μg/mL HA-MWCNTs的成骨或者成脂誘導(dǎo)培養(yǎng)基；2周后，行堿性磷酸酶（alkaline phosphatase，ALP）活性檢測(cè)及染色，茜素紅染色，油紅O染色，實(shí)時(shí)定量多聚酶鏈反應(yīng)（RT-PCR）和蛋白質(zhì)印跡檢測(cè)。

1.5.4 RT-PCR 使用TRIzol試劑從細(xì)胞中提取總RNA，將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，以cDNA為模板在ABI Prism 7500實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀上進(jìn)行擴(kuò)增；成骨向分化的目的基因?yàn)楹诵慕Y(jié)合因子（Cbfa1/Runx2）、骨涎蛋白（BSP）和骨鈣素（OCN），成脂向分化的目的基因?yàn)檫^氧化物酶體增生物激活受體γ2（PPARγ2）、脂肪酸結(jié)合蛋白2（aP2/ALBP）和脂蛋白酯酶（LPL），β-actin作為內(nèi)參。目的基因的引物設(shè)計(jì)序列見表1。

1.5.5 蛋白質(zhì)印跡分析 首先利用SDS-PAGE凝膠電泳技術(shù)分離提取蛋白質(zhì)，并將其轉(zhuǎn)移到聚偏氟乙烯（PVDF）膜上；將膜置入含3% BSA的0.05% TBS-Tween 20封閉液中（室溫，2 h），然后根據(jù)試劑盒說明加入適量的一抗（抗Cbfal/Runx2、PPARγ和GAPDH）室溫孵育2 h；用0.05% TBS-Tween 20洗滌PVDF膜3次，加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗，孵育2 h；化學(xué)發(fā)光法顯示目的條帶，定量分析光密度值。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 10.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，單因素的方差分析（One-way ANOVA），組間比較采用t檢驗(yàn)，以P < 0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 HA-WMCNTs官能團(tuán)檢測(cè)

透射電鏡顯示：HA晶體均勻的纏繞于MWCNTs表面，呈球狀，而非短棒狀結(jié)構(gòu)，這表明MWCNTs作為結(jié)晶中心，為HA在納米管表面的生長提供支持，見圖1。XRD顯示：在HA功能化的MWCNTs中，有羥基磷灰石組分的形成。HA組分的特異性峰值主要集中在25.9°、31.8°、39.7°，見圖2。

2.2 HA-MWCNTs的細(xì)胞毒性

MTT提示，與對(duì)照組比較，HA-MWCNTs和MWCNTs能夠抑制細(xì)胞的增殖，但HA-MWCNTs則對(duì)細(xì)胞的增殖活力沒有大的影響，表現(xiàn)出良好的生物相容性，見圖3?；钏兰?xì)胞檢測(cè)示，活細(xì)胞呈現(xiàn)綠色熒光，死細(xì)胞呈紅色熒光。MWCNTs組的死細(xì)胞比率較大，而HA-MWCNTs組死細(xì)胞較少，見圖4（封底）。

2.3 HA-MWCNTs對(duì)BMSCs分化的影響

成骨：與MWCNTs組比較，HA-MWCNTs組的ALP顆粒的陽性分布率較高，ALP活性較高。見圖5～6。

成脂：HA-MWCNTs組油紅O洗脫液的吸光度在第2周降低了27.9%（P < 0.05），與MWCNTs組比較，HA-MWCNTs組觀察到較少的脂滴形成。見圖7。

RT-PCR：檢測(cè)結(jié)果用mRNA表達(dá)的相對(duì)倍數(shù)表示，結(jié)果顯示，成骨或成脂誘導(dǎo)培養(yǎng)2周后，HA-MWCNTs組與MWCNTs組比較，Cbfal/Runx2增加了36%（P < 0.05），BSP增加了74%（P < 0.05），OCN增加了97%（P < 0.05）；而PPARγ2下調(diào)了26%（P < 0.05），aP2/ALBP下調(diào)了42%（P < 0.05），LPL下調(diào)了49%（P < 0.05），提示HA-MWCNTs組成骨相關(guān)基因（Cbfal/Runx2、BSP、OCN）的表達(dá)增加，成脂相關(guān)基因（PPARγ2、aP2/ALBP、LPL）的表達(dá)降低。見圖8。

蛋白質(zhì)印跡：成骨或者成脂誘導(dǎo)2周后，與MWCNTs組比較，HA-MWCNTs組細(xì)胞中Cbfal/Runx2的蛋白表達(dá)水平增加78%（P < 0.05）；而PPARγ的蛋白水平下調(diào)31%（P < 0.05）。見圖9。

3 討論

HA是一種具有高度生物活性的硬組織植入材料，在骨科領(lǐng)域被廣泛應(yīng)用，但是存在強(qiáng)度低、韌性差的缺點(diǎn)[4]。CNTs具強(qiáng)度高，韌性好，并且具有優(yōu)異的光、電、磁學(xué)性能，在生物力學(xué)領(lǐng)域具有較好的前景。將CNTs和HA復(fù)合能夠增強(qiáng)復(fù)合物的生物力學(xué)性能，同時(shí)提高其生物相容性[6，15]。研究表明，MWCNTs的加入不僅改變了HA的物理形貌，而且也增強(qiáng)了磷酸鈣水泥的機(jī)械強(qiáng)度，抗壓強(qiáng)度達(dá)到了16.3 MPa，超過了人體松質(zhì)骨的強(qiáng)度。目前已有較多研究報(bào)道了HA-MWCNTs的制備，及其物理、化學(xué)、生物學(xué)性能[4，7，15-18]。

Jing等[16]發(fā)現(xiàn)膠原/HA/MWCNTs復(fù)合物在體內(nèi)外均表現(xiàn)出優(yōu)良的骨誘導(dǎo)性及骨傳導(dǎo)性。Li等[7]發(fā)現(xiàn)HA-MWCNTs復(fù)合物具有較強(qiáng)的力學(xué)強(qiáng)度及粗糙的微觀結(jié)構(gòu)，有利于骨缺損創(chuàng)面中成骨細(xì)胞的黏附及生長，促進(jìn)成骨細(xì)胞的活性，從而增強(qiáng)骨再生。此外，Li等[7]的實(shí)驗(yàn)報(bào)道了碳納米管不僅能夠促進(jìn)脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞的骨向分化，而且在體內(nèi)能夠誘導(dǎo)異位骨的形成。這些實(shí)驗(yàn)結(jié)果為碳納米管在組織工程領(lǐng)域的應(yīng)用提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

本實(shí)驗(yàn)研究了HA-MWCNTs對(duì)大鼠BMSCs的毒性作用及多向分化的影響。結(jié)果表明：羥基磷灰石功能化的碳納米管溶解性高，細(xì)胞毒性較小。已有文獻(xiàn)報(bào)道：羥基磷灰石能夠促進(jìn)BMSCs的增殖和骨向分化。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：BMSCs在成骨或者成脂誘導(dǎo)2周后，HA-MWCNTs增加了細(xì)胞Cbfal/Runx2、BSP、OCN成骨相關(guān)因子的表達(dá)，而抑制了成脂相關(guān)基因PPARγ2、aP2/ALBP的表達(dá)。此結(jié)果與前期文獻(xiàn)報(bào)道的細(xì)胞的成骨和成脂相關(guān)基因是反向調(diào)節(jié)的結(jié)論一致[19-21]。

本實(shí)驗(yàn)的缺陷：①只使用一種HA-MWCNTs的濃度（30 μg/mL），尚無法反映HA-MWCNTs與BMSCs增殖、分化的量效關(guān)系；②只使用一個(gè)時(shí)間點(diǎn)（2周），數(shù)據(jù)尚不足以評(píng)估HA-MWCNTs與BMSCs多向分化的時(shí)間-效應(yīng)關(guān)系。故而，多劑量、多時(shí)間點(diǎn)的實(shí)驗(yàn)有待于進(jìn)一步實(shí)施。

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（收稿日期：2018-02-25 本文編輯：任 念）