骨形態(tài)發(fā)生蛋白4與乳腺癌骨轉(zhuǎn)移的相關(guān)性研究

李科

摘 要：目的 探討乳腺癌組織及癌旁正常乳腺組織中骨形態(tài)發(fā)生蛋白4的表達情況，分析BMP-4表達水平與乳腺癌骨轉(zhuǎn)移的相關(guān)性。方法 收集自2003年1月～2016年12月綿陽富臨醫(yī)院乳腺外科乳腺癌患者術(shù)后病理標(biāo)本，其中228例乳腺癌組織石蠟標(biāo)本，40例癌旁2 cm正常組織石蠟標(biāo)本作為對照。應(yīng)用免疫組織化學(xué)檢測BMP-4蛋白在癌組織和癌旁正常組織中的表達情況。結(jié)果 BMP-4在有骨轉(zhuǎn)移乳腺癌組織、無骨轉(zhuǎn)移乳腺癌組織及癌旁正常組織陽性表達率分別為11.90%（5/42），39.78%（74/186）， 45.00%（18/40）。發(fā)生骨轉(zhuǎn)移乳腺癌組織中BMP-4陽性表達率較無骨轉(zhuǎn)移的乳腺癌組織、癌旁正常組織明顯降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。結(jié)論 BMP-4表達水平降低與乳腺癌骨轉(zhuǎn)移相關(guān)，BMP-4陽性表達的患者較BMP-4陰性表達的患者骨轉(zhuǎn)移發(fā)生幾率低。

關(guān)鍵詞：BMP-4；乳腺腫瘤；骨轉(zhuǎn)移；免疫組織化學(xué)

中圖分類號：R737.9 文獻標(biāo)識碼：A DOI：10.3969/j.issn.1006-1959.2018.13.005

文章編號：1006-1959（2018）13-0017-04

Abstract：Objective To investigate the expression of bone morphogenetic protein-4 in breast cancer tissues and adjacent normal breast tissues，and to analyze the correlation between BMP-4 expression level and bone metastasis of breast cancer.Methods The postoperative pathological specimens of breast cancer patients from Mianyang Fulin Hospital in Mianyang from January 2003 to December 2016 were collected.Among them，228 specimens of breast cancer tissue and 40 paraffin specimens of 2 cm adjacent normal tissues were used as controls.Immunohistochemistry was used to detect the expression of BMP-4 protein in cancer tissues and adjacent normal tissues.Results The positive expression rates of BMP-4 in breast cancer tissues， bone metastasis-free breast cancer tissues and adjacent normal tissues were 11.90%（5/42），39.78% （74/186），and 45.00%（18/40），respectively.The positive expression rate of BMP-4 in breast cancer tissues with bone metastasis was significantly lower than that in breast cancer tissues without adjacent bone metastasis，and the difference was statistically significant（P<0.05）.Conclusion Decreased expression of BMP-4 is associated with bone metastasis in breast cancer，and patients with positive BMP-4 expression have a lower incidence of bone metastases than patients with negative BMP-4 expression.

Key words：BMP-4；Breast tumor；Bone metastasis；immunohistochemistry.

骨是乳腺癌常見轉(zhuǎn)移部位，晚期乳腺癌患者70%以上發(fā)生骨轉(zhuǎn)移，出現(xiàn)骨痛、高鈣血癥、脊髓壓迫、病理性骨折等并發(fā)癥，嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量，并且乳腺癌細(xì)胞以骨髓作為庇護所，逃避人體自身免疫攻擊和藥物化療，導(dǎo)致復(fù)發(fā)和其他臟器的轉(zhuǎn)移。了解骨轉(zhuǎn)移發(fā)生的高危因素，揭示發(fā)生骨轉(zhuǎn)移機制，從而采取個體化的治療措施，將可能減緩病情發(fā)展。骨形態(tài)發(fā)生蛋白4是轉(zhuǎn)化生長因子-β超家族的一部分，最初是從脫鈣骨基質(zhì)中提取出的具有誘導(dǎo)骨活性的作用多功能糖蛋白，后來發(fā)現(xiàn)其對多種細(xì)胞的增殖、分化、凋亡及胚胎干細(xì)胞更新具有調(diào)控作用，目前有少量文獻研究BMP-4與乳腺癌的關(guān)系，主要是動物模型實驗，發(fā)現(xiàn)高表達BMP-4的乳腺癌細(xì)胞較低表達的不容易出現(xiàn)骨轉(zhuǎn)移，有更好的預(yù)后，提示BMP-4可能作為癌轉(zhuǎn)移抑制蛋白，在乳腺癌轉(zhuǎn)移過程中發(fā)揮負(fù)性調(diào)節(jié)作用。目前未發(fā)現(xiàn)文獻報道直接檢測患者乳腺癌病理組織中的BMP-4的表達水平及其與乳腺癌骨轉(zhuǎn)移的關(guān)系。本項研究目的是為了找到更多預(yù)測乳腺癌骨轉(zhuǎn)移的影響因子，應(yīng)用免疫組化（SP）法檢測乳腺癌組織中BMP-4的表達水平，以癌旁2 cm正常組織作為對照，分析BMP-4表達水平與臨床病理因素及骨轉(zhuǎn)移的關(guān)系。

1 資料與方法

1.1一般資料 四川省綿陽富臨醫(yī)院乳腺外科2003年1月～2008年12月確診為乳腺癌的患者228例。

本次研究經(jīng)過醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)。骨轉(zhuǎn)移診斷符合下列條件：①有明確的乳腺癌病史；②臨床癥狀明顯：如骨痛、惡液質(zhì)、血清堿性磷酸酶升高；③骨掃描（骨ECT）示多發(fā)異常放射性濃聚伴或不伴稀疏或缺損區(qū)；單發(fā)異常放射性濃聚區(qū)，復(fù)查病灶數(shù)增多病變范圍擴大者；④X線或MRI診斷為骨轉(zhuǎn)移。納入標(biāo)準(zhǔn)：①病理組織HE染色或免疫組化確診為乳腺癌；②石蠟標(biāo)本大小滿足實驗要求并保存完整；③隨訪資料完整；④行乳腺癌改良根治術(shù)；⑤術(shù)后接受規(guī)范化治療（包括放、化療及內(nèi)分泌治療）。排除標(biāo)準(zhǔn)：①臨床病理資料不完整；②失訪；③術(shù)前行新輔助化療或術(shù)后未完成規(guī)范化治療。根據(jù)疾病分為兩組，無骨轉(zhuǎn)移組患者186例，男性2例，女性184例，年齡28～79歲，平均年齡（50.25±1.61）歲，病程12～60個月，平均病程（40.12±3.63）個月。骨轉(zhuǎn)移組患者42例，均為女性，年齡35～72歲，平均年齡（53.25±1.45）歲。病程12～60個月，平均病程（（35.96±3.41）個月。

1.2方法

1.2.1主要儀器 DF-620Y數(shù)控切條機、烘片機（HI1220）、倒置相差熒光顯微鏡（包埋機（德國EG1160）、普通光學(xué)顯微鏡（北京恒奧德科技有限公司SC-JBX-D）、DSP彩色攝像系統(tǒng)（TCR1060）、

1.2.2主要實驗試劑 二氨基聯(lián)苯胺（DAB）顯示試劑盒由天津博美科生物技術(shù)有限公司提供。BMP-4鼠抗人單克隆抗體由上海瑞齊生物科技有限公司提供。

1.2.3實驗步驟 取骨轉(zhuǎn)移乳腺癌組和無骨轉(zhuǎn)移乳腺癌組癌旁2 cm正常組織各20例，大小2.0 cm×2.0 cm×0.3 cm，常規(guī)石蠟包埋、切片。

1.3結(jié)果判斷 鏡下觀察，BMP-4陽性染色主要定位于細(xì)胞質(zhì)，偶爾可見細(xì)胞膜，呈棕黃色顆粒。在雙盲的情況下由兩位經(jīng)驗豐富的病理科醫(yī)師對每張照片全面觀察，每張切片選10個高倍視野（×400），每個視野記數(shù)100個腫瘤細(xì)胞。按陽性細(xì)胞占計數(shù)同類細(xì)胞的百分比，采用顏色和陽性細(xì)胞數(shù)積分綜合計量判定。①按染色強度記分為：無色為0分、淡黃色為1分、棕色為2分、深棕色為3分。②百分率：陽性細(xì)胞率≤5%為0分，陽性細(xì)胞率10%～25%為1分，陽性細(xì)胞率25%～50%為3分，陽性細(xì)胞率>50%記為3分；將①×②結(jié)果分級：0分為陰性（-），1～2分視為弱陽性（+），3～4分視為陽性（+ +），≥5分視為強陽性（+ + +）[12]。

1.4統(tǒng)計學(xué)分析 采用中文版SPSS 19.0統(tǒng)計分析軟件進行數(shù)據(jù)分析，計數(shù)資料組間比較分別采用？字2檢驗、Fisher's精確檢驗；等級資料組間比較采用秩和檢驗檢驗；運用Spearman進行相關(guān)分析； 以P<0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2結(jié)果

BMP-4在乳腺癌組織和癌旁正常組織陽性表達率分別為34.64%（79/228） 、45.00%（18/40），兩者比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（？字2=1.579，P=0.209>0.05）。將乳腺癌組織分為兩個組：發(fā)生骨轉(zhuǎn)移組（42例）和未發(fā)生骨轉(zhuǎn)移組（186例），與癌旁正常組織對照。BMP-4陽性表達率在骨轉(zhuǎn)移組、無骨轉(zhuǎn)移組、癌旁正常組分別為11.90%（5/42）、39.78%（74/186）、45.00%（18/40），骨轉(zhuǎn)移組與無骨轉(zhuǎn)移組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（？字2= 10.16，P=0.001<0.05）；骨轉(zhuǎn)移組與癌旁正常組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（？字2=11.11，P=0.001<0.05）；無骨轉(zhuǎn)移組與癌旁正常組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（？字2= 0.33，P=0.561>0.05），見表1。

對全部乳腺癌樣本中BMP-4的表達情況與骨轉(zhuǎn)移的發(fā)生情況進行相關(guān)分析發(fā)現(xiàn)：BMP-4表達陽性的乳腺癌患者中只有5（5/79）例出現(xiàn)骨轉(zhuǎn)移（6.31%），而BMP-4陰性表達的乳腺癌患者中有37例（37/149）發(fā)生骨轉(zhuǎn)移（24.83%）。Spearman相關(guān)分析結(jié)果顯示：BMP-4陽性表達與乳腺癌骨轉(zhuǎn)移呈負(fù)相關(guān)，（r=-2.27，P=0.001，P<0.05），差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。見表2。

3討論

乳腺癌是目前全球最常見的女性惡性腫瘤，遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移是乳腺癌患者死亡的主要原因，骨是乳腺癌常見的轉(zhuǎn)移部位之一。因此，弄清乳腺癌骨轉(zhuǎn)移的臨床病理過程，鑒別具有高轉(zhuǎn)移風(fēng)險的患者，以采取個體化的治療措施成為乳腺癌臨床治療亟需解決的問題。有資料顯示，骨形態(tài)發(fā)生蛋白4在乳腺癌的轉(zhuǎn)移中發(fā)揮重要調(diào)節(jié)作用。

骨形態(tài)發(fā)生蛋白4是轉(zhuǎn)化生長因子-β（transforming growth factor-β，TGF-β）超家族的成員。BMP-4基因定位于染色體14q22-q23， 基因全長為1.9KD，共編碼408個氨基酸，有2個編碼外顯子和3個5'端的非編碼外顯子，這3個啟動子具有不同啟動功能.BMP-4基因在人體不同的發(fā)育階段、不同的組織采用不同的啟動子，因而有不同的表達水平。BMP是分泌型多功能糖蛋白，通過旁分泌或自分泌發(fā)揮作用，而其結(jié)構(gòu)和功能高度保守，其羧基端有高度保守的結(jié)構(gòu)域，內(nèi)含7個半胱氨酸，其位置固定。BMP-4合成時首先是一個前體蛋白，約有100～125個氨基酸，包括一個前結(jié)構(gòu)域，一個氨基端信號肽及一個羧基端成熟肽。經(jīng)研究證實，BMP-4不但具有促進人體胚胎發(fā)育及調(diào)節(jié)細(xì)胞增值、分化、調(diào)亡的能力，而且在多種腫瘤的增殖、侵襲及轉(zhuǎn)移中發(fā)揮作用[1]。BMP-4在的表達具與組織特異性，文獻報道，BMP-4在促腎上腺皮質(zhì)激素瘤中的表達明顯降低，對促腎上腺皮質(zhì)腺瘤起抑制作用[2]；BMP-4在前列腺癌中過度表達，促進前列腺癌骨轉(zhuǎn)移[3]。在乳腺癌組織中的表達情況文獻報道較少。我們目前的實驗研究便是為了探查BMP-4在乳腺癌組織中的表達情況及與骨轉(zhuǎn)移的關(guān)系，為建立乳腺癌骨轉(zhuǎn)移新的預(yù)測模型和乳腺癌抗骨轉(zhuǎn)移藥物的研發(fā)提供新思路。

3.1BMP-4在乳腺組織中的表達 研究顯示，正常乳腺組織中BMP-4由乳腺的間充質(zhì)細(xì)胞分泌，對乳腺的發(fā)育和維持正常生理功能發(fā)揮調(diào)節(jié)作用，特別是維持乳腺胚胎干細(xì)胞的自我更新功能，25%正常乳腺組織中有BMP-4強表達，平均陽性表達率在30%～50%[4]。本實驗結(jié)果顯示，乳腺癌組織中BMP-4表達陽性率為34.64%（79/228）低于癌旁正常組織45.00%（18/40），差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。 Alarmo等[5]認(rèn)為BMP-4在乳腺正常組織和癌組織中可能作用不同。文獻報道體外乳腺癌細(xì)胞系BMP-4表達存在很大差異，郭丹等[6]發(fā)現(xiàn)MCF-7和MBA-MD-231細(xì)胞系高表達BMP-4，并認(rèn)為BMP-4具有抑制癌細(xì)胞增殖同時促進侵襲轉(zhuǎn)移的雙重作用； Cao等[7]在對4T1.1和4T1.2乳腺癌細(xì)胞系研究中發(fā)現(xiàn)BMP-4表達水平降低，BMP4能夠促使癌細(xì)胞失巢凋亡，減少炎癥細(xì)胞因子如粒細(xì)胞集落刺激因子等的表達和分泌，增加髓系來源抑制性細(xì)胞（Myeloid derived suppressor cells，MDSCs）衰減，BMP-4可能作為腫瘤轉(zhuǎn)移基因，具有抑制腫瘤轉(zhuǎn)移的能力。Rodriguez等[8]研究表明BMP-4的表達具有時間依賴性，在細(xì)胞的不同周期呈時相表達。綜合分析，BMP-4作為一種細(xì)胞因子的在乳腺組織中的表達，受到全身和局部多種因素的調(diào)節(jié)來發(fā)揮生理功能，乳腺癌是一種高度異質(zhì)性的疾病，癌微環(huán)境的不同，BMP-4的表達水平也不樣。本研究顯示乳腺癌組織中BMP-4的平均陽性表達率與癌旁正常組織表達相比沒有統(tǒng)計學(xué)意義，但進一步分層分析，發(fā)生骨轉(zhuǎn)移乳腺癌組織中BMP-4陽性表達率較之未發(fā)生骨轉(zhuǎn)移乳腺癌組織及癌旁正常組織明顯降低，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。提示BMP-4可能不主要參與原發(fā)乳腺癌的形成過程，而是在乳腺癌惡性病變形成以后的轉(zhuǎn)移過程中發(fā)揮重要作用，即乳腺癌組織中BMP-4表達水平低的癌細(xì)胞具有高轉(zhuǎn)移的生物學(xué)特性。

3.2 BMP-4與乳腺癌骨轉(zhuǎn)移 本實驗相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)BMP-4陽性表達與骨轉(zhuǎn)移兩者呈明顯負(fù)相關(guān)。骨轉(zhuǎn)移的第一步是癌細(xì)胞降解周圍基質(zhì)侵入到脈管系統(tǒng)，MMP-9（ matrix metalloproteinase-9）是乳腺癌的一種基質(zhì)金屬蛋白酶，癌細(xì)胞通過分泌MMP-9水解腫瘤細(xì)胞周圍基質(zhì)，達到浸潤和轉(zhuǎn)移的目的，研究發(fā)現(xiàn)BMP-4能夠抑制MMP-9的分泌，從而抑制腫瘤轉(zhuǎn)移[9]。同時BMP4可通過激活P38MAPK通路誘導(dǎo)癌細(xì)胞走向過早性衰老[10]。另外，BMP-4 可以抑制血管內(nèi)皮生長因子（vascularendothelialgrowthfactor-D， VEGF-D）驅(qū)動轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)引起的血管重塑，從腫瘤細(xì)胞和腫瘤基質(zhì)細(xì)胞水平抑制原發(fā)腫瘤的生長，抑制乳腺癌細(xì)胞失巢凋亡，降低乳腺癌轉(zhuǎn)移能力[11]。乳腺癌骨轉(zhuǎn)移，主要表現(xiàn)為溶骨性或混合性轉(zhuǎn)移，BMP-4具有較強的誘導(dǎo)骨基質(zhì)細(xì)胞定向分化為骨轉(zhuǎn)移的能力。BMP-4在乳腺癌中的表達降低或表達缺失，可能導(dǎo)致了乳腺癌骨轉(zhuǎn)移中成骨與溶骨的平衡紊亂[12]?？赏ㄟ^對乳腺癌組織中BMP-4表達的檢測，判斷乳腺癌骨轉(zhuǎn)移風(fēng)險的高低。并且BMP-4作為一種小分子糖蛋白，重組BMP-4是否可以作為一種藥物，用于抑制乳腺癌骨轉(zhuǎn)移，這需要進一步研究確定。

綜上所述，BMP-4表達水平降低與乳腺癌骨轉(zhuǎn)移存在明顯的負(fù)相關(guān)。通過術(shù)后病理組織免疫組化監(jiān)測BMP-4，可以鑒別具有高骨轉(zhuǎn)移風(fēng)險的乳腺癌患者，采取個體化的治療措施，提高患者的生存質(zhì)量和生存時間。然而本組實驗樣本量較小，研究方法單一，只是初步分析了BMP-4在乳腺癌中的表達情況與臨床病理因素及骨轉(zhuǎn)移的關(guān)系，對BMP-4在乳腺癌發(fā)生發(fā)展中究竟發(fā)揮哪些具體作用的研究，還需要更大的樣本，不同檢測的方法，更深入的研究。乳腺癌骨轉(zhuǎn)移是一個多基因參與、多步驟、多途徑的復(fù)雜過程，任何阻斷這一過程的方法都可以延緩骨轉(zhuǎn)移的發(fā)生。隨著對BMP-4信號通路的深入研究，BMP-4作為小分子糖蛋白，重組BMP-4有希望成為抗乳腺癌骨轉(zhuǎn)移的藥物。

參考文獻：

[1]Bosukonda A，Carlson WD.Harnessing the BMP signaling pathway to control the formation of cancer stem cells by effects on epithelial-to-mesenchymal transition[J].Biochemical Society Transactions，2017，45（1）：223.

[2]季立津，鹿斌，史虹莉.泌乳素瘤發(fā)病機制研究進展[J].醫(yī)學(xué)綜述，2016，22（1）：55-59.

[3]孫繼建，潘世杰.血清ALP、ICTP、sTf水平及癌組織BMP表達對前列腺癌骨轉(zhuǎn)移的預(yù)測價值[J].山東醫(yī)藥，2017，57（48）：79-81.

[4]Liu Y，Zhang RX，Yuan W，et al.Knockdown of Bone Morphogenetic Proteins Type 1a Receptor（BMPR1a）in Breast Cancer Cells Protects Bone from Breast Cancer-Induced Osteolysis by Suppressing RANKL Expression[J].Cellular Physiology &Biochemistry;，2018，45（5）：1759-1771.

[5]Zabkiewicz C，Resaul J，Hargest R，et al.Bone morphogenetic proteins，breast cancer，and bone metastases：striking the right balance[J].Endocrine-Related Cancer，2017，24（10）：R349-R366.

[6]Dan G，Huang J，Gong J.Bone morphogenetic protein 4 （BMP4）is required for migration and invasion of breast cancer[J].Molecular&Cellular; Biochemistry，2012，363（1-2）：179.

[7]Na YE，Jiping QI，He WU，et al.Research Progress of Bone Morphogenetic Protein 4[J].Medical Recapitulate，2017，23（5）：872-876.

[8]Alejandra RM，Emma-Leena A，Lilli S，et al.Analysis of BMP4 and BMP7 signaling in breast cancer cells unveils time-dependent transcription patterns and highlights a common synexpression group of genes[J].BMC Medical Genomics，2011，4（1）：80.

[9]Cyrdepauw C，Northey JJ，Tabariès S，et al.Chordin-Like 1 Suppresses Bone Morphogenetic Protein 4-Induced Breast Cancer Cell Migration and Invasion[J].Molecular&Cellular; Biology，2016，36（10）：1509.

[10]Pal A，Huang W，Li X，et al.CCN6 modulates BMP signaling via the Smad-independent TAK1 p38 pathway，acting to suppress metastasis of breast cancer[J].Cancer Research，2012，72（18）：4818-4828.

[11]Ampuja M，Alarmo E L，Owens P，et al.The impact of bone morphogenetic protein 4 （BMP4） on breast cancer metastasis in a mouse xenograft model[J].Cancer Letters，2016，375（2）：238-244.

[12]Ampuja M，Rantapero T，Rodriguezmartinez A，et al.Integrated RNA-seq and DNase-seq analyses identify phenotype-specific BMP4 signaling in breast cancer[J].Bmc Genomics，2017，18（1）：68.

收稿日期：2018-5-7；修回日期：2018-7-6

編輯/李樺