四逆湯對(duì)腎纖維化大鼠氧化應(yīng)激反應(yīng)的干預(yù)作用

王 艷，魏錦萍，裴妙榮

（1.山西中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院，山西晉中030619； 2.中國(guó)輻射防護(hù)研究院，山西太原030006）

腎纖維化是慢性腎臟疾病發(fā)展至終末期腎病的共同途徑，無(wú)論基礎(chǔ)疾病如何，慢性腎臟疾病一旦持續(xù)進(jìn)展終將導(dǎo)致腎纖維化，腎纖維化持續(xù)進(jìn)展的結(jié)果是腎功能進(jìn)行性不可逆轉(zhuǎn)的損害。近年來(lái)多成分、多靶點(diǎn)的復(fù)方中藥治療腎纖維化，作為延緩慢性腎臟疾病進(jìn)程的治療方法日益受到人們的重視。研究表明溫補(bǔ)腎陽(yáng)法對(duì)腎損傷有一定的治療作用［1］。本課題組在已結(jié)題的國(guó)家自然基金資助項(xiàng)目（30973712）研究中，發(fā)現(xiàn)組分配伍形式的四逆湯對(duì)甲減所致的腎損傷［2］具有良好的作用效果，為明確四逆湯是否對(duì)非甲減腎損傷具有治療作用，本研究采用腎纖維化為模型，以治療甲減藥效最佳劑量組來(lái)研究四逆湯對(duì)氧化應(yīng)激反應(yīng)的干預(yù)作用及對(duì)腎纖維化的治療效果。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 SD大鼠，56只，雌雄各半，體重200 g～220 g，SPF級(jí)。購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)：SCXK（京）2014-0013。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)藥品 附子、干姜、甘草，購(gòu)自北京同仁堂藥店，鑒定分別為毛茛科植物烏頭AconitumcarmichaeliDebx.的子根、姜科植物姜ZingiberOfficinale Rose.的根莖及豆科甘草屬植物甘Glycyrrhiza uralensisFisch.的根及根莖）。

1.1.3 實(shí)驗(yàn)試劑 氯化鈉，批號(hào)：20080604，天津市瑞金特化學(xué)品有限公司生產(chǎn)：甲醛溶液，批號(hào)：20110325，天津市東麗區(qū)大畢莊鎮(zhèn)歡坨工業(yè)園生產(chǎn)；乙醚，批號(hào)：20110327，天津市進(jìn)豐化工有限公司生產(chǎn)；尿素氮（BUN）測(cè)試盒、丙二醛（MDA）測(cè)試盒、超氧化物歧化酶（SOD）測(cè)試盒、還原型谷胱甘肽（GSH）、肌酐（GR）試劑盒均購(gòu)自南京建成生物工程研究所生產(chǎn)。腎衰寧，沈陽(yáng)東新藥業(yè)有限公司生產(chǎn)。

1.1.4 實(shí)驗(yàn)儀器 TV-1810紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)，北京普析通用儀器有限責(zé)任公司生產(chǎn)；UV-6100S型紫外可見(jiàn)光分光光度計(jì)，上海元析儀器有限公司生產(chǎn)；HH-6數(shù)顯恒溫水浴鍋，金壇市杰瑞爾電器有限公司生產(chǎn)；TG16-W離心機(jī)，湖南湘立科學(xué)儀器有限公司生產(chǎn)；DNM-9602酶標(biāo)分析儀，北京普朗新技術(shù)有限公司生產(chǎn)；DHC-9075A電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱，上海一恒科學(xué)儀器有限公司生產(chǎn)；FSH-Ⅱ型高速電動(dòng)勻漿器，江蘇金壇市環(huán)宇科學(xué)儀器廠生產(chǎn)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 藥物制備 四逆湯有效組分配伍溶液的制備：按照預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果采用附子∶干姜∶甘草=1∶1∶1 配伍組，即附子提取物 1.2 g、干姜提取物 0.75 g、甘草提取物3.9 g溶于100 mL水中得。附子草提取物、干姜草提取物、甘草提取物制備方法見(jiàn)參考文獻(xiàn)［3］。

1.2.2 分組及造模給藥 取56只大鼠，根據(jù)文獻(xiàn)方法［4］結(jié)扎單側(cè)輸尿管建立大鼠腎纖維化模型。以 10%水合氯醛（0.1 mL/100 g）腹腔注射麻醉，麻醉成功后，固定大鼠剃毛、消毒。在左側(cè)肋緣下做長(zhǎng)約1～1.5 cm的縱行切口，逐層剝離皮下筋膜，切開(kāi)肌肉，暴露腎盂，找到輸尿管，取中段結(jié)扎，關(guān)閉腹腔，逐層縫合，撒上青霉素粉末，并肌肉注射青霉素溶液（0.1 mL/100 g）。假手術(shù)組不結(jié)扎輸尿管，其余操作同手術(shù)組。造模2 w后，假手術(shù)組、模型對(duì)照組灌蒸餾水1 mL/100 g，四逆湯組灌四逆湯有效組分配伍藥物（0.585 g/kg），腎衰寧組給予腎衰寧藥物水溶液（0.432 g/kg）。

1.2.3 樣本采集 藥物干預(yù)后，將大鼠禁食、不禁水12 h，收集尿液，測(cè)定尿蛋白含量。腹主動(dòng)脈采血分離血清，測(cè)定血清BUN及Cr含量；取左側(cè)腎臟，剪取1/3稱重后置于離心管中用作勻漿用，用生理鹽水制備成10%勻漿液，測(cè)定腎組織MDA、SOD及GSH含量；剩余2/3用10%中性福爾馬林固定后HE染色，觀察病理?yè)p傷程度。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 四逆湯對(duì)腎纖維化大鼠尿蛋白、血清尿素氮及肌酐含量的影響

與假手術(shù)組比較，模型組尿蛋白及血清尿素氮、肌酐含量明顯升高（P＜0.05）；與模型對(duì)照組比較，四逆湯組及腎衰寧組可顯著降低模型組大鼠尿蛋白、血清尿素氮和肌酐水平（P＜0.05）。結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 四逆湯對(duì)腎纖維化大鼠尿蛋白及血清BUN及CR的影響（±s）

表1 四逆湯對(duì)腎纖維化大鼠尿蛋白及血清BUN及CR的影響（±s）

注：與假手術(shù)組比較，1）P＜0.05；與模型對(duì)照組比較，2）P＜0.05

?

2.2 四逆湯對(duì)腎纖維化大鼠腎臟組織MDA、SOD及GSH含量的影響

與假手術(shù)組比較，模型組MDA含量明顯升高（P＜0.05），SOD 含量明顯降低（P＜0.05），GSH 水平有所降低；與模型對(duì)照組比較，四逆湯組及腎衰寧組可顯著降低模型組大鼠腎組織MDA水平、升高 SOD水平（P＜0.05），在一定程度上升高 GSH 水平。結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 四逆湯對(duì)腎纖維化大鼠腎臟組織MDA、SOD及GSH含量的影響 （±s）

表2 四逆湯對(duì)腎纖維化大鼠腎臟組織MDA、SOD及GSH含量的影響 （±s）

注：與假手術(shù)組比較，1）P＜0.05；與模型對(duì)照組比較，2）P＜0.05

?

2.3 四逆湯對(duì)腎纖維化大鼠腎臟組織病理的影響

假手術(shù)組鏡下可見(jiàn)腎皮質(zhì)正常，腎小管排列有序，無(wú)炎性細(xì)胞浸潤(rùn)；模型對(duì)照組可見(jiàn)明顯的腎小球萎縮、數(shù)量減少，腎小管排列紊亂，集合管內(nèi)出現(xiàn)蛋白管型，髓質(zhì)嚴(yán)重萎縮。四逆湯組與模型對(duì)照組相比，萎縮程度減輕，腎小管排列比較整齊。結(jié)果見(jiàn)圖1。

3 討論

圖1 四逆湯對(duì)腎纖維化大鼠腎臟組織病理的影響

多數(shù)醫(yī)家認(rèn)為腎纖維化病機(jī)為本虛標(biāo)實(shí)，脾腎陽(yáng)虛為本，濕濁潴留為標(biāo)。四逆湯臨床應(yīng)用廣泛，對(duì)多種疾病均有顯著療效，四逆湯以辛甘大熱之附子為君，蕩滌內(nèi)外寒氣，溫補(bǔ)腎中陽(yáng)氣，干姜回守中陽(yáng)為臣，扶護(hù)后天，再使以甘草，正合辛甘化陽(yáng)之旨，因此用四逆湯治療腎纖維化符合本病病機(jī)。本研究發(fā)現(xiàn)，四逆湯可改善單側(cè)輸尿管結(jié)扎腎纖維化模型動(dòng)物的病理?yè)p傷程度，降低模型動(dòng)物24 h尿蛋白量及血清尿素氮和肌酐水平，說(shuō)明四逆湯對(duì)腎纖維化動(dòng)物有確切的治療作用。

腎組織損傷后可導(dǎo)致組織缺氧和氧化應(yīng)激損傷，而氧化應(yīng)激又可進(jìn)一步導(dǎo)致腎組織脂質(zhì)過(guò)氧化與炎癥反應(yīng)，刺激促纖維化因子從而加快腎纖維化進(jìn)程［4-5］。因此氧化應(yīng)激反應(yīng)在腎纖維化進(jìn)程中具有重要的作用，減輕氧化應(yīng)激發(fā)應(yīng)可減輕炎癥反應(yīng)和腎纖維化病程。MDA是脂質(zhì)過(guò)氧化代表產(chǎn)物之一，可反映氧化應(yīng)激的嚴(yán)重程度，其高低間接反應(yīng)機(jī)體細(xì)胞受自由基攻擊的嚴(yán)重程度。SOD、GSH是重要的抗氧化劑，其氧化活性代表了體內(nèi)抗氧化能力的高低。本研究表明，與假手術(shù)組相比，單側(cè)輸尿管結(jié)扎動(dòng)物模型組，MDA含量顯著升高，SOD及GSH含量顯著降低，說(shuō)明了腎纖維化氧化損傷的特點(diǎn)；四逆湯可降低腎纖維化模型動(dòng)物腎臟MDA水平，升高SOD及GSH水平，提示四逆湯對(duì)腎纖維化的氧化應(yīng)激損傷有干預(yù)作用，且其對(duì)腎纖維化的治療作用可能與其對(duì)氧化應(yīng)激損傷的干預(yù)作用有關(guān)。