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    植物乳桿菌LPL-1產(chǎn)細(xì)菌素發(fā)酵培養(yǎng)基優(yōu)化

    2018-09-17 06:53:48李平蘭
    關(guān)鍵詞:酵母粉吐溫氮源

    王 瑤 李 琪 李平蘭

    (1.中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)北京食品營(yíng)養(yǎng)與人類健康高精尖創(chuàng)新中心, 北京 100083;2.中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與營(yíng)養(yǎng)工程學(xué)院, 北京 100083)

    0 引言

    乳酸細(xì)菌素是乳酸菌在轉(zhuǎn)錄翻譯過(guò)程中通過(guò)核糖體機(jī)制合成,并分泌到菌體體外的一類具有抑菌活性的蛋白質(zhì),細(xì)菌素具有無(wú)抗藥性、無(wú)毒副作用及易被人體降解的特點(diǎn),因此不僅是一種天然的食品防腐保鮮劑[1-2],而且具有取代抗生素的潛力[3]。目前已經(jīng)報(bào)道了許多新的細(xì)菌素及產(chǎn)生菌(如植物乳桿菌LPL-1的植物乳桿菌素LPL-1[4]、動(dòng)物雙歧桿菌B04的bifidocin A[5]與類植物乳桿菌L-ZS9的paraplantaricin L-ZB1[6]等),但其細(xì)菌素的產(chǎn)量嚴(yán)重制約了其工業(yè)化生產(chǎn)及應(yīng)用。

    植物乳桿菌(Lactobacillusplantarum)是食品發(fā)酵工業(yè)中常見(jiàn)的益生菌,已經(jīng)被廣泛應(yīng)用于奶制品、肉制品及果蔬發(fā)酵食品中[7-9]。產(chǎn)細(xì)菌素的植物乳桿菌不僅具有益生特性,而且具有抑菌特性,因此在食品發(fā)酵與食品防腐保鮮領(lǐng)域具有應(yīng)用潛力。

    植物乳桿菌LPL-1(LactobacillusplantarumLPL-1)不僅是一株新的菌種,而且所產(chǎn)細(xì)菌素為新的IIa類細(xì)菌素,有作為天然食品生物防腐劑的巨大應(yīng)用潛力[4],然而菌體自身所產(chǎn)細(xì)菌素的產(chǎn)量比較低,其合成不僅受到自身誘導(dǎo)肽的調(diào)控,而且與培養(yǎng)基的組成及培養(yǎng)條件有關(guān)[10]。本文以植物乳桿菌LPL-1為研究對(duì)象,通過(guò)單因素試驗(yàn)、Plackett-Burman試驗(yàn)及響應(yīng)面法優(yōu)化植物乳桿菌素LPL-1的培養(yǎng)基組分,獲得該菌種產(chǎn)生細(xì)菌素的最佳培養(yǎng)基組成,為該菌種產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)細(xì)菌素提供一定的實(shí)踐基礎(chǔ)。

    1 材料與方法

    1.1 菌種、培養(yǎng)基及試劑

    植物乳桿菌LPL-1分離自發(fā)酵魚(yú),指示菌單增李斯特菌(Listeriamonocytogenes)ATCC 54002由實(shí)驗(yàn)室保存。MRS培養(yǎng)基(葡萄糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)2%、酵母粉質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.4%、蛋白胨質(zhì)量分?jǐn)?shù)1%、牛肉膏質(zhì)量分?jǐn)?shù)1%、吐溫-80體積比1 mL/L、磷酸氫二鉀質(zhì)量濃度2 g/L、乙酸鈉質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.5%、硫酸鎂質(zhì)量濃度0.2 g/L、硫酸錳質(zhì)量濃度0.1 g/L、檸檬酸氫二銨質(zhì)量濃度2 g/L、蒸餾水體積1 L)各組成成分購(gòu)自西隴科學(xué)股份有限公司。

    1.2 細(xì)菌素提取

    按照1%接種量將植物乳桿菌LPL-1接種至100 mL MRS培養(yǎng)基,37℃靜止培養(yǎng)24 h,8 000 r/min離心15 min收集上清液,按照培養(yǎng)基與-20℃預(yù)冷丙酮體積比1∶3進(jìn)行配比,-20℃放置1 h取出,8 000 r/min離心15 min收集沉淀,后用-20℃預(yù)冷的丙酮等體積洗滌脫水,8 000 r/min離心15 min收集沉淀,沉淀室溫(20℃)干燥用于計(jì)算酶活力。

    1.3 抑菌活性的檢測(cè)

    采用牛津杯雙層平板擴(kuò)散法測(cè)定細(xì)菌素的酶活性[11]。將提取的細(xì)菌素進(jìn)行2倍稀釋,取樣100 μL進(jìn)行抑菌試驗(yàn),觀察不到抑菌圈出現(xiàn)的最高稀釋度定義為1個(gè)活力單位,其倒數(shù)即是原液的細(xì)菌素相對(duì)抑菌效價(jià),單位為AU/mL。

    相對(duì)抑菌效價(jià)標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作:將已知相對(duì)抑菌效價(jià)的細(xì)菌素稀釋為80%、60%、40%與20%,分別取100 μL進(jìn)行抑菌試驗(yàn),以對(duì)應(yīng)抑菌圈直徑為橫坐標(biāo),相對(duì)抑菌效價(jià)對(duì)數(shù)為縱坐標(biāo),繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

    1.4 單因素試驗(yàn)

    選擇不同碳源、氮源、刺激因子、磷酸鹽緩沖液及二價(jià)離子作為影響抑菌活性的主要因素,通過(guò)單因素試驗(yàn)選擇Plackett-Burman(PB)試驗(yàn)的影響因素與水平。

    1.4.1碳源

    分別采用2%的葡萄糖、蔗糖、α-半乳糖、乳糖、可溶性淀粉及麥芽糖作為MRS培養(yǎng)基碳源成分,培養(yǎng)溫度37℃,培養(yǎng)時(shí)間24 h。發(fā)酵結(jié)束后按照1.2節(jié)與1.3節(jié)中方法進(jìn)行細(xì)菌素的提取與活性驗(yàn)證。

    1.4.2氮源

    分別采用1%的酵母粉、胰蛋白胨、蛋白胨、牛肉膏、大豆蛋白胨及硝酸鈉作為MRS培養(yǎng)基氮源成分,培養(yǎng)溫度37℃,培養(yǎng)時(shí)間24 h。發(fā)酵結(jié)束后按照1.2節(jié)與1.3節(jié)中方法進(jìn)行細(xì)菌素的提取與活性驗(yàn)證。

    1.4.3刺激因子

    分別采用1 mL/L 的吐溫(Tween)-20、吐溫-60、吐溫-80、聚乙二醇(PEG)-1000、PEG-4000與PEG-8000作為MRS培養(yǎng)基刺激因子,培養(yǎng)溫度37℃,培養(yǎng)時(shí)間24 h。發(fā)酵結(jié)束后按照1.2節(jié)與1.3節(jié)中方法進(jìn)行細(xì)菌素的提取與活性驗(yàn)證。

    1.4.4緩沖液

    分別采用2 g/L的K2HPO4、KH2PO4、Na2HPO4與NaH2PO4作為MRS培養(yǎng)基緩沖成分,培養(yǎng)溫度37℃,培養(yǎng)時(shí)間24 h。發(fā)酵結(jié)束后按照1.2節(jié)與1.3節(jié)中方法進(jìn)行細(xì)菌素的提取與活性驗(yàn)證。

    1.4.5二價(jià)離子

    分別采用0.2 g/L的MgSO4、MnSO4、ZnSO4、FeSO4與CuSO4作為MRS培養(yǎng)基緩沖成分,培養(yǎng)溫度37℃,培養(yǎng)時(shí)間24 h。發(fā)酵結(jié)束后按照1.2節(jié)與1.3節(jié)中方法進(jìn)行細(xì)菌素的提取與活性驗(yàn)證。

    1.5 Plackett-Burman試驗(yàn)

    根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果,利用Design-Expert 10.0設(shè)計(jì)Plackett-Burman試驗(yàn)(N=12)。具體設(shè)計(jì)及相應(yīng)區(qū)間如表1所示,根據(jù)各因素的貢獻(xiàn)率與P值確定主要影響因素。

    表1 Plackett-Burman試驗(yàn)設(shè)計(jì)Tab.1 Design of Plackett-Burman experiment

    1.6 最陡爬坡試驗(yàn)

    根據(jù)Plackett-Burman試驗(yàn)分析的顯著性、貢獻(xiàn)率及效應(yīng)值設(shè)計(jì)試驗(yàn)的方向與步長(zhǎng)。最陡爬坡試驗(yàn)具體設(shè)計(jì)方案如表2所示。

    表2 最陡爬坡試驗(yàn)設(shè)計(jì)Tab.2 Design of the steepest grade test

    1.7 Box-Behnken響應(yīng)面試驗(yàn)

    由最陡爬坡試驗(yàn)的拐點(diǎn)確定響應(yīng)面試驗(yàn)的中心點(diǎn)及相應(yīng)區(qū)間,采用Design-Expert 10.0軟件設(shè)計(jì)試驗(yàn)方案,優(yōu)化葡萄糖、酵母粉質(zhì)量分?jǐn)?shù)與吐溫-80體積比,以相對(duì)抑菌效價(jià)為響應(yīng)值進(jìn)行17組試驗(yàn),具體設(shè)計(jì)方案如表3所示。模型對(duì)酶活力進(jìn)行二次多元回歸擬合,生成等高線圖與響應(yīng)面曲線圖,獲得最佳發(fā)酵參數(shù),對(duì)模型進(jìn)行方差分析,確定其可信度。

    表3 Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)Tab.3 Design of Box-Behnken experiment

    1.8 模型的驗(yàn)證

    利用響應(yīng)面模型優(yōu)化的最佳條件進(jìn)行發(fā)酵試驗(yàn),比較模型預(yù)測(cè)值與試驗(yàn)值,驗(yàn)證模型的有效性。

    1.9 數(shù)據(jù)處理與分析

    每個(gè)試驗(yàn)重復(fù)3次,取平均值。采用SPSS 23.0進(jìn)行單因素方差分析與顯著性差異分析,Design-Expert 10.0進(jìn)行Plackett-Burman與Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 單因素試驗(yàn)

    2.1.1碳源

    碳源是菌體代謝與生長(zhǎng)的主要元素,不同碳源對(duì)植物乳桿菌LPL-1產(chǎn)植物乳桿菌素LPL-1的影響如圖1所示(圖中不同字母表示差異顯著,下同)。Lb.plantarumLPL-1可以利用多種碳源,方差結(jié)果顯示不同種類的碳源對(duì)細(xì)菌素的活性具有顯著性影響(P<0.05)。以葡萄糖為碳源時(shí),所獲得細(xì)菌素相對(duì)抑菌效價(jià)達(dá)到286.67 AU/mL,明顯高于其它碳源。由于不同碳源的結(jié)構(gòu)不同,Lb.plantarumLPL-1對(duì)蔗糖、半乳糖、乳糖、淀粉與麥芽糖利用率比較低,因此確定葡萄糖為L(zhǎng)b.plantarumLPL-1產(chǎn)植物乳桿菌素LPL-1的最佳碳源。

    圖1 碳源對(duì)植物乳桿菌LPL-1產(chǎn)乳桿菌素LPL-1的影響Fig.1 Influence of carbon source on activity of plantaricin LPL-1 from Lb. plantarum LPL-1

    不同類型乳酸菌利用碳源的差異性比較大,如戊糖乳桿菌31-1[12]、植物乳桿菌ST23LD[13]與酸乳片球菌C20[14]的最佳碳源分別為乳糖、山梨醇與麥芽糖。本文的最優(yōu)碳源是葡萄糖,導(dǎo)致菌體利用不同碳源的原因可能是菌體來(lái)源、所處的生長(zhǎng)環(huán)境及內(nèi)部代謝途徑的不同。

    2.1.2氮源

    氮源是微生物合成的主要因素,可以分為有機(jī)氮源與無(wú)機(jī)氮源。有機(jī)氮源被微生物酶解為小分子物質(zhì),被菌體吸收轉(zhuǎn)化后進(jìn)一步合成代謝,最終形成菌體所必需的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì);無(wú)機(jī)氮源不僅可以調(diào)節(jié)外部環(huán)境的pH值,而且可以參與菌體的代謝,但是其利用速率比較快[15]。本文利用有機(jī)氮源與無(wú)機(jī)氮源不同組合,測(cè)定菌體產(chǎn)乳桿菌素 LPL-1的活性,結(jié)果如圖2所示,有機(jī)氮源比無(wú)機(jī)氮源更能促進(jìn)乳桿菌素LPL-1的產(chǎn)生,有機(jī)氮源降解的營(yíng)養(yǎng)成分有可能促進(jìn)了細(xì)菌素合成蛋白的表達(dá)。方差結(jié)果顯示,酵母粉與胰蛋白胨更能促進(jìn)細(xì)菌素的合成,但是兩者之間差異不顯著,復(fù)合氮源的使用可以更大提高細(xì)菌素的活性,因此采用不同氮源比例(胰蛋白胨與酵母粉質(zhì)量比)1∶1、1∶2、2∶1進(jìn)行復(fù)配,結(jié)果如圖3所示。

    圖2 氮源對(duì)植物乳桿菌LPL-1產(chǎn)乳桿菌素LPL-1的影響Fig.2 Influence of nitrogen source on activity of plantaricin LPL-1 from Lb. plantarum LPL-1

    圖3 氮源質(zhì)量比對(duì)植物乳桿菌LPL-1產(chǎn)乳桿菌素LPL-1的影響Fig.3 Influence of nitrogen ratio on activity of plantaricin LPL-1 from Lb. plantarum LPL-1

    由圖3可知,氮源比例為2∶1時(shí),乳桿菌素LPL-1相對(duì)抑菌效價(jià)最高,因此,確定最優(yōu)氮源比例為2∶1,并以此為基礎(chǔ)進(jìn)行Plackett-Burman與響應(yīng)面試驗(yàn)。

    2.1.3刺激因子

    刺激因子主要是表面活性劑類的物質(zhì),它可以影響細(xì)胞膜的通透性[16],進(jìn)而影響細(xì)菌素的合成與分泌,不同種類的刺激因子對(duì)乳桿菌素LPL-1的影響如圖4所示,不同刺激因子對(duì)細(xì)菌素的產(chǎn)生差異性明顯(P<0.05),吐溫-80為刺激因子時(shí),細(xì)菌素的相對(duì)抑菌效價(jià)達(dá)到310.83 AU/mL,明顯高于其它刺激因子(P<0.05),因此確定吐溫-80為最佳刺激因子。

    圖4 刺激因子對(duì)植物乳桿菌LPL-1產(chǎn)乳桿菌素LPL-1的影響Fig.4 Influence of surfactants on activity of plantaricin LPL-1 from Lb. plantarum LPL-1

    GARVER等[17]初步證實(shí)了吐溫-80對(duì)細(xì)菌素影響的重要性;莊緒亮等[18]研究了吐溫-80對(duì)Nisin產(chǎn)生的影響,確定了吐溫-80對(duì)細(xì)菌的產(chǎn)生具有刺激作用;本文同樣初步證明了吐溫-80對(duì)植物乳桿菌素活性的影響。

    2.1.4二價(jià)離子

    二價(jià)離子通常作為酶反應(yīng)活性中心的輔基,對(duì)菌體蛋白質(zhì)的轉(zhuǎn)錄翻譯具有重要影響[19],不同種類的二價(jià)離子對(duì)細(xì)菌素活性的影響如圖5所示,不同離子對(duì)細(xì)菌素的產(chǎn)生差異性明顯(P<0.05),硫酸鎂與硫酸錳對(duì)細(xì)菌素活性影響明顯,因此確定其為最佳影響因子。

    圖5 二價(jià)離子對(duì)植物乳桿菌LPL-1產(chǎn)乳桿菌素LPL-1的影響Fig.5 Influence of divalentions on activity of plantaricin LPL-1 from Lb. plantarum LPL-1

    2.1.5緩沖液

    在培養(yǎng)基體系中,緩沖液主要起到穩(wěn)定pH值作用[20],促進(jìn)菌體生長(zhǎng),同時(shí)磷又是菌體內(nèi)糖類、蛋白質(zhì)與能量等主要營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的組成元素,因此本文分析了不同緩沖體系對(duì)細(xì)菌素活性的影響,結(jié)果如圖6所示,磷酸氫二鉀為細(xì)菌素發(fā)酵最佳緩沖液,方差分析結(jié)果顯示,緩沖液之間對(duì)該細(xì)菌素的活性影響差異并不顯著(P>0.05),在后期的Plackett-Burman試驗(yàn)中,選擇磷酸氫二鉀作為考察因素進(jìn)行重復(fù)驗(yàn)證。

    圖6 緩沖液對(duì)植物乳桿菌LPL-1產(chǎn)乳桿菌素LPL-1的影響Fig.6 Influence of buffer on activity of plantaricin LPL-1 from Lb. plantarum LPL-1

    2.2 Plackett-Burman試驗(yàn)

    以單因素試驗(yàn)為基礎(chǔ),根據(jù)Plackett-Burman試驗(yàn)的貢獻(xiàn)率與顯著性確定主要影響因素,為后續(xù)的Box-Behnken響應(yīng)面試驗(yàn)奠定基礎(chǔ)。以葡萄糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)(A)、酵母粉質(zhì)量分?jǐn)?shù)(B)、吐溫-80體積比(C)、硫酸錳質(zhì)量濃度(D)、硫酸鎂質(zhì)量濃度(E)與磷酸氫二鉀質(zhì)量濃度(F)為考察因素(A~F為編碼值),設(shè)置-1與1的不同水平(表4、5),以相對(duì)抑菌效價(jià)為響應(yīng)值(表4),利用Design-Expert 10.0進(jìn)行設(shè)計(jì)與分析,結(jié)果如表4與表5所示。根據(jù)Design-Expert 10.0數(shù)據(jù)分析,模型方差P<0.05,說(shuō)明數(shù)據(jù)模型具有可信度,葡萄糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)(A)、酵母粉質(zhì)量分?jǐn)?shù)(B)與吐溫-80體積比(C)貢獻(xiàn)率最高,并且具有顯著性差異,因此,選擇以上3個(gè)因素進(jìn)行最陡爬坡試驗(yàn)確定中心點(diǎn),同時(shí)磷酸氫二鉀質(zhì)量濃度為正效應(yīng),硫酸鎂質(zhì)量濃度為負(fù)效應(yīng),硫酸錳質(zhì)量濃度為正效應(yīng),因此,選擇磷酸氫二鉀質(zhì)量濃度3 g/L,硫酸鎂質(zhì)量濃度0.2 g/L、硫酸錳質(zhì)量濃度0.3 g/L,其余因素按照培養(yǎng)基初始比例進(jìn)行添加,牛肉膏質(zhì)量分?jǐn)?shù)1%、乙酸鈉質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.5%、檸檬酸氫二銨質(zhì)量濃度2 g/L。

    表4 Plackett-Burman試驗(yàn)結(jié)果Tab.4 Results of Plackett-Burman experiment

    表5 Plackett-Burman試驗(yàn)效應(yīng)分析Tab.5 Effect analysis of Plackett-Burman experiment

    2.3 最陡爬坡試驗(yàn)

    根據(jù)Plackett-Burman試驗(yàn)結(jié)果設(shè)計(jì)主要因素的最陡爬坡試驗(yàn),葡萄糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)、酵母粉質(zhì)量分?jǐn)?shù)、吐溫-80體積比為顯著因素。根據(jù)這3個(gè)因素的取值高低水平、效應(yīng)值,以細(xì)菌素相對(duì)抑菌效價(jià)為響應(yīng)值,設(shè)定這3個(gè)因素的變化方向及步長(zhǎng)。最陡爬坡試驗(yàn)結(jié)果呈現(xiàn)先增高后降低的趨勢(shì),在3號(hào)試驗(yàn)點(diǎn)(表2)處出現(xiàn)最高點(diǎn),該點(diǎn)處葡萄糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2%、酵母粉質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.5%、吐溫-80體積比為1 mL/L,此時(shí)植物乳桿菌LPL-1產(chǎn)細(xì)菌素相對(duì)抑菌效價(jià)達(dá)到最大,最大值為583.23 AU/mL。該點(diǎn)即為下一步Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)的中心點(diǎn)。

    2.4 Box-Behnken響應(yīng)面試驗(yàn)

    利用Design-Expert 10.0軟件對(duì)葡萄糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)、酵母粉質(zhì)量分?jǐn)?shù)、吐溫-80體積比設(shè)計(jì)三因素三水平的Box-Behnken試驗(yàn),試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表6。對(duì)Box-Behnken試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行方差分析,由表7可知,所選擇的回歸模型的P值小于0.05,表明整體模型對(duì)試驗(yàn)結(jié)果具有顯著的影響,具有可信度;而失擬項(xiàng)的P值為0.299,大于0.05,失擬項(xiàng)檢驗(yàn)不顯著,說(shuō)明未知因素對(duì)試驗(yàn)結(jié)果的影響較小,殘差主要由隨機(jī)誤差引起,模型選擇適當(dāng);該模型的相關(guān)系數(shù)R=0.983 8,校正相關(guān)系數(shù)0.963 0,信噪比大于4,表明模型可信度很高。細(xì)菌素相對(duì)抑菌效價(jià)Y對(duì)葡萄糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)、酵母粉質(zhì)量分?jǐn)?shù)和吐溫-80體積比的多元二次回歸方程為

    表6 Box-Behnken試驗(yàn)結(jié)果Tab.6 Results of Box-Behnken experiment

    Y=784.458+89.629 2A+24.669 4B+30.500 6C-25.151 7AB-0.153 076AC+21.458BC-274.751A2-223.076B2-326.02C2

    注:** 表示P<0.01。

    圖7 Box-Behnken試驗(yàn)的響應(yīng)面三維圖和等高線圖Fig.7 Response surface three-dimensional diagrams and counter maps of Box-Behnken experiments

    2.5 響應(yīng)面立體分析及等高線圖

    由回歸方程所做的響應(yīng)面立體圖與等高線圖如圖7所示,主要反映了葡萄糖、酵母粉與吐溫-80之間的相互作用,通過(guò)方程可知,二次項(xiàng)系數(shù)為負(fù)值,表明方程具有最大值。利用Design-Expert 10.0分析計(jì)算,最適發(fā)酵培養(yǎng)基為葡萄糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)2.08%、酵母粉質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.51%與吐溫-80體積比1.02 mL/L,由于胰蛋白胨與酵母粉的最優(yōu)質(zhì)量比為2∶1,因此胰蛋白胨質(zhì)量分?jǐn)?shù)確定為1.02%,此時(shí)最大相對(duì)抑菌效價(jià)為793.21 AU/mL。

    2.6 回歸模型的驗(yàn)證

    為了驗(yàn)證回歸方程的準(zhǔn)確性,利用優(yōu)化后培養(yǎng)基的條件(葡萄糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)2.08%、酵母粉質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.51%、胰蛋白胨質(zhì)量分?jǐn)?shù)1.02%、牛肉膏質(zhì)量分?jǐn)?shù)1%、吐溫-80體積比1.02 mL/L、磷酸氫二鉀質(zhì)量濃度3 g/L、乙酸鈉質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.5%、硫酸鎂質(zhì)量濃度0.2 g/L、硫酸錳質(zhì)量濃度0.3 g/L、檸檬酸氫二銨質(zhì)量濃度2 g/L、蒸餾水體積1 L)進(jìn)行3次重復(fù)性驗(yàn)證,細(xì)菌素的平均相對(duì)抑菌效價(jià)為(752.11±4.98) AU/mL,與預(yù)測(cè)值的擬合率達(dá)到94.7%,表明預(yù)測(cè)值與實(shí)際值具有良好的擬合性,優(yōu)化后培養(yǎng)基可用,同時(shí)優(yōu)化后細(xì)菌素相對(duì)抑菌效價(jià)(752.11 AU/mL)比優(yōu)化前(286.67 AU/mL)提高了1.62倍,說(shuō)明本試驗(yàn)優(yōu)化的培養(yǎng)基明顯提高了細(xì)菌素的產(chǎn)量。

    3 結(jié)束語(yǔ)

    在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上,利用Plackett-Burman試驗(yàn)確定了主要影響因素為葡萄糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)、酵母粉質(zhì)量分?jǐn)?shù)與吐溫-80體積比,最陡爬坡試驗(yàn)確定了中心點(diǎn),響應(yīng)面Box-Behnken試驗(yàn)建立了二次多項(xiàng)式回歸模型,最終確定發(fā)酵培養(yǎng)基為:葡萄糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)2.08%、酵母粉質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.51%、胰蛋白胨質(zhì)量分?jǐn)?shù)1.02%、牛肉膏質(zhì)量分?jǐn)?shù)1%、吐溫-80體積比1.02 mL/L、磷酸氫二鉀質(zhì)量濃度3 g/L、乙酸鈉質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.5%、硫酸鎂質(zhì)量濃度0.2 g/L、硫酸錳質(zhì)量濃度0.3 g/L、檸檬酸氫二銨質(zhì)量濃度2 g/L、蒸餾水體積1 L。在此條件下細(xì)菌素相對(duì)抑菌效價(jià)(752.11 AU/mL)比優(yōu)化前(286.67 AU/mL)提高了1.62倍。

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