乳腺癌化療耐藥的分子機制

林慧，吉麗銀，符策崗

(1中南大學湘雅醫(yī)學院附屬海口醫(yī)院乳腺甲狀腺血管外科，?？?570208；2上海市第六人民醫(yī)院?？诠强婆c糖尿病醫(yī)院，?？?570000)

乳腺癌是女性最常見的癌癥之一，且發(fā)病率逐年升高。早期的乳腺癌（腫瘤局限在乳房中或擴散到腋窩淋巴結(jié)時）被認為是可以治愈的，在發(fā)達國家5年存活率超過85%[1]。遺憾的是，即使近年來新的治療方法層出不窮，如乳腺癌生物學相關(guān)治療、個性化治療以及降低和減少化學療法的不利影響等都對乳腺癌的治療有一定的幫助，但由于化療耐藥的存在、復發(fā)或者發(fā)現(xiàn)時乳腺癌已經(jīng)轉(zhuǎn)移到各種器官，部分患者的5年生存率依然很低（28%）[1]。

1 乳腺癌的分類

乳腺癌的治療可分為兩部分：局部治療和全身治療。治療方式的選擇取決于癌癥的階段及其類型，包括分子和組織學分類等。早期乳腺癌（Ⅰ期和Ⅱ期），腫瘤局限于乳腺組織或受感染的局部淋巴結(jié)，可以通過乳房切除術(shù)和或聯(lián)合放療來治愈。乳腺癌細胞表面可存在（也可缺失）以下3種激素受體，包括雌激素受體（estrogen receptor, ER）、孕酮受體（progesterone receptor, PR）和人表皮生長因子-2受體（human epidermal growth factor-2 receptor, HER2）。轉(zhuǎn)移性乳腺癌（metastatic breast cancer, MBC）的治療方式主要有化療、激素治療和靶向治療。根據(jù)癌癥的分子性質(zhì)及其在乳腺癌組織中的起源，Perou和Sorlie[2]在2000年提出根據(jù)腫瘤表面受體情況將乳腺癌主要分為4個亞型：①管腔A型（luminal A型），②管腔B型（luminal B型），③基底細胞樣型和④HER2型[2]。在臨床實踐中，通常也根據(jù)乳腺癌不同分子和組織學來源進行分類。另一種方法是根據(jù)細胞表面是否存在受體進行分類，腫瘤細胞表面存在ER和/或PR受體的乳腺癌稱為激素陽性乳腺癌，而另一種情況是腫瘤細胞表面只有HER2受體而缺乏ER和PR受體（即不能通過激素療法來治療）被稱為HER2陽性乳腺癌；三陰性乳腺癌（triple negative breast cancer, TNBC）既是指腫瘤細胞表面缺乏ER、PR和HER2的表達，這種類型的乳腺癌不能通過激素治療或HER2靶向治療，化療是目前TNBC全身治療僅有的選擇[1]。

2 乳腺癌的病理生理和轉(zhuǎn)移

雖然目前尚未完全闡明乳腺癌發(fā)病的確切機制，但是人們對乳腺癌的發(fā)生和發(fā)展已有一定了解。腫瘤干細胞模型是指通過刺激前體腫瘤干細胞而觸發(fā)乳腺癌的發(fā)生和發(fā)展。該理論假設(shè)，乳腺癌和腫瘤層次中的細胞多樣性由腫瘤干細胞產(chǎn)生[3]?？寺∵M化模型假設(shè)，指的是隨機突變以及在基因水平上的克隆選擇導致細胞向乳腺癌細胞異質(zhì)性方向發(fā)展[4]。這兩種模型之間存在聯(lián)系，例如乳腺癌腫瘤干細胞可能在克隆進化過程中參生。乳腺癌的發(fā)展沿著低級和高級兩種途徑發(fā)展。低級途徑的特征是，ER表型和二倍體（或接近二倍體）核型的大多數(shù)基因的在表達時發(fā)生變化。luminal A型和部分luminal B型就屬于這一途徑。另一方面，高級通路的特征是基因的改變，包括13q基因的缺失、染色體區(qū)-11q13的增加和17q12基因的擴增。17q12基因編碼乳腺癌細胞中的HER2，在轉(zhuǎn)移性乳腺癌的細胞增殖和細胞周期維持中均可檢測到17q12高水平表達[5]。HER2陽性和TNBC就屬于這一途徑。在乳腺癌中檢測到許多基因要么發(fā)生突變或者過表達，要么兩者都具備。這些基因有：PIK3CA（30%）、PTEN（16%）、TP53（41%）、CCND1（16%）、ERBB2（13%）和GATA3（10%）[6]，它們的共同特點是都參與細胞周期的調(diào)節(jié)。乳腺癌與許多其他癌癥相似，其p53基因被抑制，增加細胞周期蛋白D1表達的基因被激活。此外，在乳腺癌中，HER2、MYC和FGFR1等可抑制癌細胞的凋亡并刺激持續(xù)增殖的基因被激活[7]。

晚期乳腺癌可轉(zhuǎn)移到各種器官，包括周圍淋巴結(jié)、肺、骨、大腦、肝臟和腹腔等。乳腺癌最常見的轉(zhuǎn)移性部位是骨。大約67%的晚期乳腺癌腫瘤轉(zhuǎn)移在骨骼，其中比例較高的是luminal B型（79%）和luminal A型（70%），而HER2和TNBC型（60%）或基底細胞型（40%）比例相對低[1]。此外常見的乳腺癌轉(zhuǎn)移部位是肝、周圍淋巴結(jié)和肺。近37%的晚期乳腺癌可以分別轉(zhuǎn)移到肝臟和肺，而乳腺癌轉(zhuǎn)移到周圍淋巴結(jié)的幾率為30%～50%。TNBC和HER2的肝轉(zhuǎn)移率比luminal型乳腺癌高，HER2為45%，TNBC為35%。除了TNBC，其他乳腺癌亞型的血管生成和周圍淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的幾率都很高。關(guān)于肺轉(zhuǎn)移，luminal A和luminal B轉(zhuǎn)移的幾率則較低（25%～30%），而TNBC和HER2向肺轉(zhuǎn)移的幾率較高（35%～45%）。當乳腺癌轉(zhuǎn)移到肺、肝和大腦等重要器官時，患者的生存期將明顯縮短。研究表明，大約12.6%的癌癥會轉(zhuǎn)移到腦組織中，其他不太常見的轉(zhuǎn)移部位有乳腺內(nèi)側(cè)淋巴結(jié)（10%～40%）、對側(cè)乳房（6%）和鎖骨上淋巴結(jié)（1%～4%）[1]（圖1）。

圖1 .乳腺癌常見轉(zhuǎn)移部位示意圖。 TNBC，三陰性乳腺癌Fig. 1. Common metastatic sites of breast cancer. TNBC, triple negative breast cancer

3 乳腺癌耐藥、轉(zhuǎn)移和復發(fā)的分子機制

乳腺癌耐藥、轉(zhuǎn)移和復發(fā)的分子機制主要包括：增加化療藥物的排出，這其中涉及多種蛋白的參與；乳腺癌干細胞的參與；上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化的存在等。

3.1 增加藥物的排出

化療藥物從癌細胞排出會導致藥物積累的減少，這是腫瘤細胞化療耐藥的主要原因。藥物外排蛋白，也稱為外排泵，主要引起癌細胞中的多重耐藥性（multidrug resistance, MDR）[8]。藥物外排蛋白屬于ATP結(jié)合盒式（ATP-binding cassette, ABC）轉(zhuǎn)運蛋白超家族，負責通過ATP水解產(chǎn)生的能量運輸細胞膜內(nèi)外的溶質(zhì)。人類基因組包含48個ABC基因，分為7個亞科（ABCA—G）。其中ABCB1、ABCC1和ABCG2轉(zhuǎn)運蛋白在腫瘤化療藥物治療過程中MDR的出現(xiàn)發(fā)揮重要的作用[9]。藥物外排蛋白主要包括：①P-糖蛋白（P-glycoprotein, P-gp），由ABCB1基因編碼的ABC亞家族B家族成員1；②乳腺癌耐藥蛋白（Breast cancer resistance protein, BCRP），由ABCG2基因和白色亞家族成員編碼的ABCG成員2；③多重耐藥相關(guān)蛋白-1（multidrug resistance associated protein-1, MRP-1），由ABCC2基因編碼的ATP結(jié)合盒式C家族成員2[10]。圖2描述了各種耐藥機制，包括MDR的外排泵和其他耐藥機制[11]。

圖2 耐藥性的產(chǎn)生機制。細胞中的外排轉(zhuǎn)運蛋白（包括P-gp，BCRP和MRP-1）外排藥物和其他外源性物質(zhì)。癌細胞可以通過增加藥物代謝酶的表達、改變藥物靶點、藥物進入溶酶體等方式至使藥物失活[11]。Fig. 2 The mechanism of resistance. The efflux transporters (P-gp, BCRP and MRP-1) in cells efflux drugs and other exogenous substances. Cancer cells can inactivate drugs by increasing the expression of drug-metabolizing enzymes, changing drug targets, and drugs entering lysosomes [11].

3.1.1 P-糖蛋白

糖蛋白（P-glycoprotein, P-gp），也稱多重耐藥蛋白-1（multidrug resistance protein-1, MDR-1）或分化簇243（CD243），是ABC超家族的第一個成員，負責外源物的排出[8]。P-gp由兩個半氨基酸和1280個同源氨基酸組成，每一半都由6個疏水跨膜域（transmembrane domains, TMD）組成，具有一個可以水解ATP 的ATP結(jié)合位點或核苷酸結(jié)合結(jié)構(gòu)域（nucleotide-binding domain, NBD）。ATP結(jié)合致轉(zhuǎn)運體構(gòu)象變化對轉(zhuǎn)運體的功能至關(guān)重要[12]。在癌細胞中，P-gp的過度表達導致MDR。P-gp結(jié)構(gòu)上有多個藥物結(jié)合位點，可結(jié)合多種化療藥物，包括阿霉素、依托泊苷、紫杉醇等[13]。在不同類型的癌癥中，P-gp的過表達存在差異，結(jié)腸、胰腺、肝臟、腎上腺和腎癌的P-gp表達呈最高水平，在軟組織癌、神經(jīng)母細胞瘤和血液惡性腫瘤中呈中等表達，而低水平的表達呈現(xiàn)在乳腺癌、卵巢、肺癌和食道癌中。在腫瘤表現(xiàn)出對化療耐藥性后，P-gp的表達水平增加[14]。

P-gp抑制劑主要阻斷P-gp并輔助MDR的逆轉(zhuǎn)，分為第一、第二和第三代藥物。第一代藥物的效力較低，無選擇性且與P-gp結(jié)合親和力較低，需要高劑量才能達到逆轉(zhuǎn)MDR的效果，這同時意味著可能會增加藥物毒性。三氟拉嗪、環(huán)孢菌素A、維拉帕米、奎尼丁、利血平、他莫昔芬、長春新堿和育亨賓是第一代P-gp抑制劑的代表藥[15]。第一代P-gp抑制劑藥代動力學和藥效學的不足為第二代Pgp抑制劑藥物的研發(fā)指明了方向。與第一代藥物類似，二代藥物也是通過阻斷P-gp的作用來抑制化療藥物的代謝和排泄。通過修飾第一代P-gp抑制劑的結(jié)構(gòu)，從而更好地實現(xiàn)藥理反應(yīng)、更好的耐受力和低毒性。戊司泊達（PSC833）、維拉帕米、檸檬酸比里科達（VX-710）和右尼古地平是第二代P-gp抑制劑的典型[15]。第二代P-gp抑制劑的一些缺陷，如與細胞色素P4503A4的相互作用影響藥物代謝，在第三代藥物中被克服。佐舒喹達LY335979、依克立達-GF120918、安那霉素和米托坦（NSC-38721）是第三代P-gp抑制劑的代表藥[13]。他立喹達可被視為一種理想的P-gp抑制劑，因其在癌癥化療臨床試驗中已經(jīng)證明了P-gp抑制有效性[16]。在II期臨床試驗（NCT00048633）中，該藥物還能有效逆轉(zhuǎn)晚期乳腺癌中的化療耐藥[16]。需要注意的是，盡管第三代P-gp抑制劑取得一些臨床效果，但還是會引起藥物毒性。Zhong[17]等證明了葉酸靶向納米紅細胞輸送可以用來克服乳腺癌體內(nèi)中的MDR。

3.1.2 乳腺癌耐藥蛋白

乳腺癌耐藥蛋白（breast cancer resistance protein, BCRP）在一種耐藥的人乳腺癌細胞系中首次被發(fā)現(xiàn)，當時該細胞系正接受米托蒽醌和P-gp抑制劑（他立喹達）的治療[14]。BCRP由ABCG2基因編碼，是ABC轉(zhuǎn)運體的ABCG亞型，是一個由N端NBD和一個含六個跨膜螺旋的羧基末端TMD組成的半轉(zhuǎn)運蛋白[13]。BCRP在細胞間藥物的吸收、代謝、排泄以及毒性中起著重要作用，其還作為一個外排泵，將抗癌藥物從乳腺癌細胞輸送到細胞外環(huán)境中，從而賦予腫瘤細胞MDR。雖然BCRP最初在乳腺癌中被發(fā)現(xiàn)，但后續(xù)發(fā)現(xiàn)其也存在于大多數(shù)癌細胞中并引起MDR[13]。蒽環(huán)類藥物可因在乳腺癌細胞上表達的BCRP而產(chǎn)生耐藥性[18]。BCRP除了存在于細胞膜外，也在細胞內(nèi)的小泡中表達，這些小泡通常是保留藥物的，但BCRP很快將藥物泵出來，這是導致耐藥性增加的另一個原因[19]。BCRP在乳腺癌細胞中高度表達，這些細胞具有干細胞樣的特性，大多對化療耐藥。Wiese[20]等報道了BCRP/ABCG2抑制劑的專利，以及這些抑制劑在對抗MDR之外還有其他的作用。在這些抑制劑中，最有前途的是二價類黃酮，與其他類化合物相比，二價類黃酮已經(jīng)表現(xiàn)出廣泛抑制性，二價類黃酮也是BCRP/ABCG2的選擇性抑制劑[20]。

3.1.3 多重耐藥相關(guān)蛋白

多重耐藥相關(guān)蛋白（multidrug resistance associated protein, MRP）是人類細胞膜轉(zhuǎn)運體的ABC家族的一個成員，已知會引起MDR。該轉(zhuǎn)運蛋白最初在一種小細胞肺癌耐藥系H69AR細胞中發(fā)現(xiàn)[13]。MRP1轉(zhuǎn)運體由橫跨細胞膜的17個TMD組成，負責內(nèi)源性物質(zhì)和異源性藥物的運輸。MRP1在過去20多年里因在各種癌癥耐藥過程中扮演重要的角色而廣受關(guān)注。MRP1是一種190 kDa的蛋白，具有一個P-gp轉(zhuǎn)運蛋白，就像一個核心和一個N端TMD[21]。MRP1是一個基底外轉(zhuǎn)運體，能轉(zhuǎn)運化合物進入基膜下面的細胞，并防止藥物從基底側(cè)吸收，并清除細胞中的藥物[22]。MRP1可以轉(zhuǎn)運谷胱甘肽（glutathione, GSH）、化療藥物和GSH聯(lián)合化合物[23]，提示其轉(zhuǎn)運機制與P-gp存在差異[23]。MRP1在大多數(shù)人類組織中廣泛表達，也存在于大多數(shù)腫瘤中，包括乳腺癌，并在MDR中發(fā)揮重要作用。MRP1幫助腫瘤細胞對多種藥物產(chǎn)生耐藥性，如長春生物堿、蒽環(huán)類、喜樹堿、依托泊苷、鉑化合物、核苷和核苷酸類似物、葉酸抗代謝物和甲氨蝶呤藥物等。MRP1不會對大部分紫杉類產(chǎn)生作用，但除了甲氨蝶呤。因此，乳腺癌的復發(fā)與腫瘤細胞中MRP1活性的增加密切相關(guān)，MRP轉(zhuǎn)運體的藥物靶向治療可幫助克服耐藥性的問題[13]。

3.1.4 肺耐藥蛋白

肺耐藥蛋白（lung resistance protein, LRP）是一種由LRP基因編碼的跨膜蛋白，首次在非小細胞肺癌細胞系SW-1573中被發(fā)現(xiàn)。該蛋白存在于腫瘤細胞的細胞質(zhì)和核膜中，并不是轉(zhuǎn)運蛋白ABC超家族的成員[13]。對LRP cDNA的初級序列分析發(fā)現(xiàn)，LRP的氨基酸序列與棕色大鼠穹隆蛋白同源87.7%，也被稱為主要穹隆蛋白。在不同的真核細胞中，穹隆蛋白廣泛分布在核孔復合物中，并形成核復合物的中心塞。在此基礎(chǔ)上，穹隆蛋白幫助物質(zhì)進出核膜的運輸。穹隆蛋白可能通過調(diào)節(jié)藥物的核-細胞質(zhì)運動而在MDR中發(fā)揮作用[13]。LRP蛋白在大多數(shù)癌癥中過表達，導致細胞核中抗癌藥物的積累減少。Wood等觀察到乳腺癌患者唾液中的LRP濃度明顯高于健康女性[24]。與P-gp、BCRP和MDRP類似，LRP也會對生物堿、蒽環(huán)類和依托泊苷等化合物產(chǎn)生耐藥性。除此之外，LRP還能引起對順鉑和幾種非典型的MDR藥物的耐藥性[25]。

3.2 乳腺癌干細胞

乳腺癌干細胞（breast cancer stem cells, BCSCs）是乳腺癌細胞的一個小亞群，在癌癥進展、轉(zhuǎn)移和復發(fā)中發(fā)揮重要作用。BCSCs與其他乳腺癌細胞不同，它們具有抗化療和放療的能力[26]。BCSCs的數(shù)量與轉(zhuǎn)移性乳腺癌治療率和生存率呈負相關(guān)[27]。越來越多的研究發(fā)現(xiàn)，不同表面標記和信號分子的表達可以作為潛在的治療靶點。BCSCs促進腫瘤形成的特點是，表面標記CD44的高表達和表面標記CD24低或不表達（CD44+/CD24-）[28]；與此同時，上皮細胞粘附分子的表達增強BCSCs轉(zhuǎn)移的潛力[29]。此外，具有醛脫氫酶1（aldehyde dehydrogenase 1, ALDH1）活性的BCSCs已被證明表現(xiàn)出潛在致瘤性，當其被注入裸鼠時，細胞數(shù)量低至20就足以滿足腫瘤的形成[30]。在乳腺癌組織內(nèi)，BCSCs（CD44+/CD24-）主要存在于侵襲性邊緣，而ALDH1活性升高的BCSCs主要存在于以缺氧為主的內(nèi)部區(qū)域[31]。目前的化療藥物已被證明可以通過兩種機制增加BCSCs的數(shù)量：①只影響非BCSCs，從而增加BCSCs的比例；②將非BCSCs轉(zhuǎn)化為BCSCs。例如，紫杉醇、卡鉑和5-氟尿嘧啶已被證明對非BCSC有效，并增加不同細胞系中的BCSCs（CD44+/CD24-）[32]。（CD44+/CD24-）和ALDH1表型的BCSCs從乳腺癌受體表達（ER、PR和HER2）中分離出的具有相似的基因表達譜。這表明，同種治療策略可以用來治療不同乳腺癌亞型中的BCSCs[33]。

各種信號分子和轉(zhuǎn)錄因子的表達在BCSCs的轉(zhuǎn)移中起重要作用。Tribbles同源蛋白3是一種由TRIB3基因編碼的蛋白質(zhì)，通過影響FOXO1-AKTSOX2通路，其表達與乳腺癌預后差和BCSCs干性直接相關(guān)[34]。在體外模型中，暴露于轉(zhuǎn)化生長因子-β1（transforming growth factor-β1, TGF-β1）可增加乳腺球的數(shù)量[35]。其他一些信號通路被證明對BCSCs也很重要，包括激活hedgehog、notch、核因子kappa B（NF-kB）、受體酪氨酸激酶等[36]。因此，BCSCs是治療乳腺癌的重要決定因素。研究表明，通過影響關(guān)鍵的信號通路和轉(zhuǎn)錄因子可以減少BCSCs的數(shù)量。例如，VS-4718和VS-6063可通過抑制局部粘附激酶（focal adhesion kinase, FAK）而影響Wnt/β-catenin信號通路。與紫杉醇單獨使用相比，與VS-4718或VS-6063聯(lián)用會減緩由異種移植形成的小鼠腫瘤再生長和轉(zhuǎn)移[37]。Quisinostat是一種組蛋白去乙?；敢种苿?，其與阿霉素聯(lián)合，可協(xié)同減少非CSC和BCSC的數(shù)量[38]。天然萘醌衍生物白花丹醌可通過調(diào)節(jié)Wnt/β-catenin信號通路而有效對抗內(nèi)分泌耐藥性乳腺癌中的BCSCs[39]?；掖纪ㄟ^靶向Wnt/β-catenin和TGF通路，影響（CD44+/CD24-）和ALDH1的活性從而調(diào)節(jié)BCSCs。

3.3 上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化

具有不同表型的BCSCs，包括（CD44+/CD24-）者，已被證實有上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化（epithelial-mesenchymal transition, EMT）的特征[13]。EMT是一種將極化上皮細胞轉(zhuǎn)化為間充質(zhì)細胞的過程，其遷移、產(chǎn)生細胞外基質(zhì)成分和轉(zhuǎn)移的能力有所增強，該過程包括激活多種信號通路和轉(zhuǎn)錄因子的[13]。從人乳腺癌細胞中分離出來的（CD44+/CD24-）型BCSCs顯示，波形蛋白、E盒結(jié)合鋅指蛋白1（zinc finger Ebox binding homeobox 1, ZEB1）、ZEB2和基質(zhì)金屬蛋白酶-1的表達較高，這都預示 EMT的出現(xiàn)[33]。

Notch信號通路作為乳腺癌MET的調(diào)節(jié)劑得到了廣泛的研究。Notch信號通路的激活可誘導磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B信號通路的表達，并通過誘導活化NF-κB，在細胞生長和增殖中發(fā)揮重要作用[40]。NF-κB通過影響下游效應(yīng)器，包括MMP-9、VEGF、細胞周期蛋白D1和生存素來促進EMT[40]。

細胞因子在調(diào)節(jié)EMT中也發(fā)揮重要作用。上皮細胞的照射誘導白細胞介素-6的產(chǎn)生，激活JAK/STAT通路，誘導各種下游效應(yīng)子的表達促進EMT[41]。腫瘤壞死因子α（tumor necrosis factor α, TNF-α）通過誘導Twist1的表達，促進乳腺癌細胞的轉(zhuǎn)移并誘導EMT[42]。轉(zhuǎn)化生長因子β（transforming growth factor β, TGF-β）途徑在乳腺癌的EMT中普遍激活。缺氧通常與乳腺癌EMT的啟動有關(guān)，缺氧通過激活Notch2誘導HES1和HEY1效應(yīng)子的表達，這些效應(yīng)子的上調(diào)降低電子鈣粘蛋白的表達，這是EMT的一個重要特征[43]。缺氧還通過促進環(huán)粘蛋白酶-2的表達，影響鈣粘蛋白的表達來促進EMT[44]。

4 小結(jié)

癌癥的耐藥機制非常復雜，主要涉及分子修飾、腫瘤微環(huán)境（導致血管重建的缺氧條件）和細胞主要修復方式的基因突變（DNA修復的激活、p53突變、凋亡受損）等等。從藥物的角度來看，靶向癌細胞中化療藥物的濃度和利用率的降低是化療的主要障礙。盡管最近出現(xiàn)了許多治療預措施，但目前癌癥化療是該疾病最常見的治療方式。但是目前成功的化學治療往往需要同時服用三到四種藥物?；煂Π┌Y早期的患者有一定的療效，但由于MDR，癌細胞適應(yīng)治療并“阻礙”治療，往往導致治療無效和復發(fā)[13]。使用多種藥物和高濃度的給藥，導致人體內(nèi)化療藥物的毒性大大增加，增強了副作用的程度，以至于患者無法耐受，從而導致許多治療的失敗。目前乳腺癌藥物治療方面有進一步發(fā)展希望的是靶向納米治療，它克服上述不足，有望成為乳腺癌治療的突破口。其中值得一提的是，納米載體技術(shù)可以發(fā)揮保護化療藥物免受系統(tǒng)降解、增加在腫瘤部位的藥物濃度、防止腫瘤細胞外排等作用，應(yīng)用在乳腺癌的治療取得一定的成果[44-47]。