托毒生肌凝膠對大鼠潰瘍創(chuàng)面治療的機(jī)制研究*

王瑞淑，左慶選，李新麗，彭金霞

1.河南省濮陽市人民醫(yī)院創(chuàng)面治療中心(濮陽457000)，2.湖北醫(yī)藥學(xué)院附屬人民醫(yī)院燒傷整形科(十堰442000)

主題詞 潰瘍 @托毒生肌凝膠 動物實(shí)驗(yàn) 大鼠

皮膚潰瘍在臨床上屬于一種較常見的疾病，主要是由多種因素導(dǎo)致的體表皮膚潰爛或缺損，從而形成難愈的創(chuàng)面[1]。這種創(chuàng)面往往久治不愈，并在身體各處均能發(fā)生，給患者造成很大的痛苦。對其治療的主要藥物包括表皮細(xì)胞生長因子、前列腺素、堿性成纖維細(xì)胞生長因子等，但這些藥物療程較長，且費(fèi)用昂貴，效果也不理想。隨著中醫(yī)藥的發(fā)展，用中藥治療皮膚潰瘍越來越受到大家的關(guān)注。鄭琪[2]用四效散治療慢性皮膚潰瘍的治療，10年治療經(jīng)驗(yàn)顯示臨床效果顯著。李友山[3]的研究顯示，中藥辨證治療明顯降低瘢痕形成率，并促進(jìn)創(chuàng)面的愈合，中藥治療慢性潰瘍的療效是確切的，但對其機(jī)制研究較少。由此本研究用托毒生肌凝膠用于大鼠潰瘍創(chuàng)面進(jìn)行治療，以探討其療效及作用機(jī)制，為臨床治療提供依據(jù)。

材料與方法

1 材 料

1.1 動 物:SD大鼠(雄性，清潔級)，體重225～250 g，共56只(購自上海斯萊克公司)，飼養(yǎng)室溫(22±3)℃、濕度(47±4)%，光照12 h明暗交替，自由飲水。使用許可證號為：SCXK(滬)2014-0002，動物合格證：SYXK(滬)2014-0005。

1.2 試 藥:托毒生肌方組成：白芷、丹參、黃芪、紫草、血竭、大黃、珍珠粉、爐甘石等。重組牛堿性成纖維細(xì)胞生長因子凝膠[批號20151220，規(guī)格：21000IU·(5g)-1/支)]卡波姆(批號20160122)，95%乙醇(批號20151122)；甘油(批號20160220)。總RNA提取試劑盒(批號R6852-01)；反轉(zhuǎn)錄試劑盒(批號RR415A)，實(shí)時熒光定量試劑盒(批號RR041Q，Takar公司)。

1.3 儀 器:實(shí)時熒光定量PCR分析儀(ABI7500)、普通PCR分析儀(ABI9700)，均由美國ABI公司提供；德國Eppendorf公司提供的核酸蛋白測定儀；美國普通PCR分析儀(ABI9700)。

1.4 藥物制備:配方根據(jù)李友山[3]的處方，將黃芪、爐甘石、白芷各30.05 g，沒藥、丹參各15.05 g，血竭10.08 g，大黃15.13 g，珍珠粉30.10 g，紫草30.15 g均放到燒瓶中，倒入95%乙醇1500 ml，提取1 h；然后進(jìn)行第2次95%乙醇(1000 ml)提取，時間1 h。把2次提取液充分混合，在靜置過濾后濃縮到175 ml，隨后取出12.5 ml繼續(xù)濃縮至7 ml，并和溶脹好的卡波姆充分混合，制成提毒生肌凝膠(為使pH值達(dá)6～8，加三乙醇胺適量)。配置空白基質(zhì)：取甘油0.5 g與卡波姆0.375 g，加水11.5 ml溶成空白凝膠基質(zhì)，均在4 ℃下保存待用。

2 方 法

2.1 造模及分組:56只SD大鼠，在靠近頭部的背部皮膚剪毛，脫毛(涂8%硫化鈉，脫毛面積約3.5 cm×3.5 cm)，腹腔內(nèi)麻醉[7%水合氯醛，劑量21(g/kg)],仰臥位在木板上固定消毒后，用直徑2 cm圖章做標(biāo)記(在背部正中)，將全層皮膚、皮下的結(jié)蹄組織均剪掉，深達(dá)筋膜，制造全層皮膚開放性缺損創(chuàng)面，隨機(jī)抽取42只用冰醋酸(50%)涂于創(chuàng)面，1次/d，連用7 d，制造大鼠潰瘍創(chuàng)面模型。將造模成功大鼠隨機(jī)分為三組(n=14)：模型對照組、貝復(fù)新組及托毒生肌組。剩余14只為對照組，各組大鼠從手術(shù)前1 d起，給予青霉素(4000U/只)后肢肌肉注射，連用4 d，分籠飼養(yǎng)，常規(guī)喂養(yǎng)。

2.2 用 藥:對照組及模型對照組大鼠潰瘍面涂抹適量空白凝膠；貝復(fù)新組大鼠潰瘍面涂抹貝復(fù)新凝膠(重組堿性成纖維細(xì)胞生長因子凝膠)適量。托毒生肌組大鼠潰瘍面涂抹托毒生肌凝膠適量，3組均1次/d，連用15 d。每組潰瘍面用藥后，上面覆蓋醫(yī)用紗布，膠帶(醫(yī)用)包扎。

2.3 觀察指標(biāo)及標(biāo)本采集:創(chuàng)面恢復(fù)情況：A觀察創(chuàng)面滲出水腫情況、有無分泌物、是否干燥與紅腫等。B在造模后第3天、7天、15天時用標(biāo)尺標(biāo)記，并用數(shù)碼照相機(jī)拍攝創(chuàng)面情況,以創(chuàng)面表現(xiàn)完全上皮化為愈合標(biāo)準(zhǔn)，觀察不同時間點(diǎn)創(chuàng)面的愈合率，創(chuàng)面愈合率=(創(chuàng)面的原始面積-創(chuàng)面未愈合面積)/創(chuàng)面的原始面積×100%。C觀察創(chuàng)面愈合時間：從造模至創(chuàng)面完全上皮化所用的時間。組織學(xué)檢查：三組造模后治療7 d、15 d時分別取創(chuàng)面中心的肉芽組織(各取7只)由病理醫(yī)師做蘇木精-伊紅(HE)染色，用光鏡對標(biāo)本進(jìn)行觀察(隨機(jī)5個視野)，用圖像分析系統(tǒng)(Mias)3.0對圖像進(jìn)行分析，光鏡下避開毛細(xì)血管觀察肉芽組織成纖維細(xì)胞數(shù)(5個視野，取平均數(shù))，同樣方法每個標(biāo)本觀察3個視野，計算新生毛細(xì)血管數(shù)，取平均值。反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)：取造模后用藥7 d、15 d各組大鼠的創(chuàng)面組織100 mg進(jìn)行裂解(加Trizol1mL),RT-PCR法對血管生成素-1(Ang-1)、血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)、低氧誘導(dǎo)因子(HIF-1α)mRNA表達(dá)進(jìn)行檢測。使用內(nèi)參均為β-actin。Ang-1上游引物為：5′GTGGAGAAGTCTATGTCCCT3′，下游引物為：5′GAGTGTTCAGCTTCTCCT3′;VEGF上游引物為：5′GTGGAGAGTGCTAGGTCCCT3′，下游引物為：5′CACTGAACTTCTGCTCTTTC3′;HIF-1α上游引物為：5′AGCTGTATTACTGTGCCTTTG3′，下游引物為：5′TATGGTTCTCGTGCCTTTGAT3′。

結(jié) 果

1 創(chuàng)面恢復(fù)情況 對照組炎性分泌物少，有新生上皮由外向中心生長，在15 d后大多創(chuàng)面已趨向愈合。模型對照組在治療過程中，發(fā)現(xiàn)創(chuàng)面炎性分泌物較多，創(chuàng)面干燥結(jié)痂后，將痂取下，能夠發(fā)現(xiàn)創(chuàng)面下有小空洞，有些皮膚發(fā)灰發(fā)白，新生上皮生長少量，愈合緩慢；貝復(fù)新組表現(xiàn)創(chuàng)面暗紅色，干燥結(jié)痂，創(chuàng)面周圍被新生上皮包圍并向中心生長；托毒生肌組創(chuàng)面潔凈濕潤，創(chuàng)面基底部及周圍均能見到鮮紅肉芽組織，炎性分泌物較少，稀薄，呈淡黃色，有新生上皮(淡紅色)從創(chuàng)面周圍向中心生長。15 d后多數(shù)大鼠趨向愈合，有毛發(fā)覆蓋。

2 各組創(chuàng)面組織形態(tài) 對照組成纖維細(xì)胞大量，有胞漿，核仁有著色，炎性細(xì)胞少；模型對照組表現(xiàn)新生毛細(xì)血管、成纖維細(xì)胞較少，但淋巴及中性粒細(xì)胞較多。貝復(fù)新組創(chuàng)面組織中成纖維細(xì)胞較多，不及托毒生肌組，有炎性細(xì)胞少數(shù)；托毒生肌組對照組成纖維細(xì)胞大量，有很多胞漿，核仁有著色，炎性細(xì)胞少(圖1)。

圖1 各組大鼠用藥7d時創(chuàng)面組織形態(tài)變化(HE×400)

3 各組創(chuàng)面不同時間點(diǎn)愈合率分析 模型對照組、貝復(fù)新組各時間點(diǎn)愈合率明顯低于對照組(F值=4.670、15.370、133.350，P=0.015、0.000、0.000)；托毒生肌組各時間愈合率明顯高于模型對照組(t=2.965、5.503、15.441，P=0.006、0.000、0.000)，具體情況見表1。

表1 各組創(chuàng)面不同時間點(diǎn)愈合率分析(%)

注：與對照組比較，△P<0.05；與模型對照組比較，▲P<0.05。

4 各組創(chuàng)面愈合時間分析 貝復(fù)新組、模型對照組創(chuàng)面愈合時間明顯高于對照組(F=19.000，P=0.000)；托毒生肌組創(chuàng)面愈合時間明顯低于模型對照組及貝復(fù)新組(t=5.501、3.230，P=0.000、0.003)。見表2。

5 各組各時間點(diǎn)創(chuàng)面新生毛細(xì)血管及成纖維細(xì)胞數(shù)量對比 模型對照組各時間點(diǎn)新生毛細(xì)血管及成纖維細(xì)胞數(shù)目與對照組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=3.360、5.406、5.671、4.601，P<0.01)；托毒生肌組第7天、第15天新生毛細(xì)血管及成纖維細(xì)胞數(shù)目與模型對照組比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(t=3.540、4.939、5.397、4.540，P<0.01)。見表3。

表2 各組創(chuàng)面愈合時間分析(d)

注：與對照組比較，△P<0.05；與模型對組比較情況，▲P<0.05

表3 各組創(chuàng)面新生毛細(xì)血管及成纖維細(xì)胞數(shù)量(個)

注：與對照組比較，△P<0.05；與模型對照組比較，▲P<0.05

6 各組各時間點(diǎn)創(chuàng)面Ang-1、VEGF、HIF-1α mRNA表達(dá) 模型對照組、貝復(fù)新組各時間點(diǎn)大鼠創(chuàng)面組織中Ang-1、VEGF、HIF-1α mRNA表達(dá)與對照組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=8.990、4.160、4.560、3.610、6.620、3.850，P=0.002、0.033、0.025、0.048、0.007、0.04)；托毒生肌組各時間點(diǎn)Ang-1、VEGF、HIF-1α mRNA表達(dá)與模型對照組比較(t=6.203、4.215、3.626、3.773、4.819、4.922，P=0.000、0.000、0.001、0.001、0.000、0.000)。見表4。

表4 各組各時間點(diǎn)創(chuàng)面Ang-1、VEGF、HIF-1α mRNA表達(dá)

注：與對照組比較，△P<0.05；與模型對照組比較，▲P<0.05

討 論

皮膚創(chuàng)面潰瘍在中醫(yī)學(xué)中屬于“潰瘍”范疇，近些年的研究表明[4]，中醫(yī)藥在治療皮膚潰瘍方面占有一定的優(yōu)勢。趙光明等[5]在研究中發(fā)現(xiàn)，回陽生肌膏對大鼠慢性潰瘍創(chuàng)面的愈合有促進(jìn)作用。本研究中使用的托毒生肌方，沒藥中含有大量揮發(fā)油成分，能經(jīng)皮膚或呼吸道進(jìn)入人體，發(fā)揮開竅、理氣、調(diào)性功效，激發(fā)人體自身再生及調(diào)理功能，從而起到生肌、散瘀等功效。藥理學(xué)研究顯示[6]，沒藥有良好的鎮(zhèn)痛、抗炎及收斂作用;爐甘石有收斂、祛濕、止癢等功能;血竭來自麒麟竭果實(shí)，由果實(shí)滲出的樹脂經(jīng)過加工而成，對生肌、散瘀與止痛作用顯著，在臨床上多用于瘡瘍不斂等。丹參可活血化瘀，與其他多藥同用，發(fā)揮托毒生肌，收斂抗炎、活血祛瘀等功能[7]。除此之外，凝膠制劑更利于涂抹與吸收，發(fā)揮更好的生物相容作用。

本研究顯示，托毒生肌組有較高的創(chuàng)面愈合率及較短的創(chuàng)面愈合時間，提示托毒生肌凝膠治療潰瘍創(chuàng)面的效果較好，此結(jié)果與徐杰男[8]的研究一致。Ang1主要經(jīng)旁分泌的途徑促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞的遷移，其能夠刺激血管，使血管滲透率明顯增加，也可以使內(nèi)皮細(xì)胞增加TGF-β的釋放，并作用于FGF-4，使VEGF表達(dá)明顯升高，從而使血管生成增加。VEGF為調(diào)控血管的新生的因子，能夠促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞的生成，刺激血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖，發(fā)揮促進(jìn)微血管新生的作用，另外，其能夠使血管通透性增加，加速創(chuàng)面的愈合。程靜[9]研究中指出，創(chuàng)面中VEGF如果持續(xù)保持分泌狀態(tài)，對創(chuàng)面的愈合意義重大。洪立珠等[10]在研究中顯示，其能夠使毛細(xì)血管新生，改善微循環(huán)，并將創(chuàng)面代謝的毒物及產(chǎn)物帶走。HIF-1α 屬于一種多樣性血管生成因子，研究證實(shí)，其能夠使VEGF、Ang及PLGF等多種血管形成因子成為靶基因，從而加速創(chuàng)面的愈合，使血管新生數(shù)目增加。由此可知，Ang1/VEGF/HIF-1α 信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路在血管新生、創(chuàng)面愈合中起著重要的促進(jìn)作用。本研究結(jié)果顯示，托毒生肌組用藥7 d后，Ang-1、VEGF、HIF-1α mRNA表達(dá)均明顯升高，用藥14 d后，這3種基因表達(dá)又明顯降低，提示托毒生肌方用于潰瘍創(chuàng)面效果優(yōu)于貝復(fù)新，結(jié)果與病理學(xué)檢查結(jié)果基本一致，與創(chuàng)面愈合分期也一致，其可能為托毒生肌凝膠治療大鼠潰瘍創(chuàng)面的作用機(jī)制。

綜上所述，托毒生肌方用于潰瘍創(chuàng)面模型大鼠的治療，使創(chuàng)面愈合明顯加快，其機(jī)制可能是通過調(diào)節(jié)Ang1/VEGF/HIF-1α 信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路而發(fā)揮作用。