四磨湯口服液對(duì)糖尿病大鼠膀胱功能影響研究*

施 龍,丁留成，薛 珺，熊 宇，衛(wèi)中慶

南京醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院(南京 210000)

主題詞 糖尿病 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 四磨湯 大鼠

糖尿病膀胱功能障礙是糖尿病的常見(jiàn)并發(fā)癥，可引起多種膀胱功能損害，包括感覺(jué)功能障礙、逼尿肌反射亢進(jìn)或減退、收縮力增強(qiáng)或減弱，逐漸進(jìn)展為糖尿病神經(jīng)源性膀胱，患者生活甚至生命受到很大威脅[1]。膀胱逼尿肌、尿道、自主神經(jīng)和尿路上皮等結(jié)構(gòu)的功能紊亂是目前許多國(guó)內(nèi)外專(zhuān)家學(xué)者認(rèn)可的主要原因[2]。中醫(yī)將其歸為“消渴”、“癃閉”、“淋證(勞淋)”一類(lèi)，表現(xiàn)為本虛標(biāo)實(shí)之證，因氣郁、血瘀、水停、陰陽(yáng)虛衰最終導(dǎo)致腎與膀胱發(fā)生病變，與肺、脾聯(lián)系緊密。臨床表現(xiàn)為尿等待、尿無(wú)力、小便頻繁但尿量少，重者出現(xiàn)排尿困難、尿潴留，有時(shí)也表現(xiàn)為尿失禁。消渴日久，主要是因?yàn)槟I氣受損，陰陽(yáng)失調(diào)，使中氣下陷或命門(mén)火衰，無(wú)法蒸騰氣化，最后致使膀胱尿道功能障礙[3]。四磨湯口服液是依照明代《痘疹金鏡錄》中的四磨湯研制出來(lái)的，由檳榔、枳殼、木香及烏藥組方而成，該方藥物組成雖簡(jiǎn)單，但已普遍用于內(nèi)外婦兒各科并且獲得了良好的治療效果。吳深濤根據(jù)該病出現(xiàn)排尿異常之體征及“久病脾腎陽(yáng)虛”之病機(jī)，在宋代嚴(yán)用和《濟(jì)生方》四磨湯合少腹逐瘀湯加減，意在扶正固本，溫陽(yáng)化氣，通調(diào)水道，患者不僅排尿癥狀得到很大的改善，且對(duì)防治尿路感染有一定作用[4]，但其具體的作用機(jī)制尚未闡明。本文運(yùn)用四磨湯口服液對(duì)糖尿病膀胱模型大鼠進(jìn)行灌胃治療，從而探討四磨湯口服液對(duì)糖尿病膀胱大鼠膀胱相關(guān)壓力參數(shù)的影響及通過(guò)組織層面上HE染色、Masson染色的觀察，為其臨床診治提供新的方法。

材料與方法

1 材 料

1.1 實(shí)驗(yàn)對(duì)象:SD雌性大鼠，體重160～220 g，南京大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供，許可證號(hào):SYXK(蘇) 2016-0002;實(shí)驗(yàn)大鼠在南京醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心進(jìn)行喂養(yǎng)，符合SPF級(jí)要求，許可證號(hào): 2016-0016。

1.2 實(shí)驗(yàn)試劑與儀器:鏈脲佐菌素(streptozocin,STZ)、檸檬酸、檸檬酸鈉、四磨湯口服液，血糖測(cè)定儀與血糖試紙均購(gòu)于美國(guó)強(qiáng)生公司，尿動(dòng)力學(xué)分析儀(MedLab生物信號(hào)采集處理系統(tǒng)V6.5),DXL-D大鼠新型代謝籠(南京醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室)，電子稱(chēng)(南京醫(yī)科大學(xué)五臺(tái)動(dòng)物房)；無(wú)水乙醇；石蠟包埋機(jī)(型號(hào)KD-BM)；石蠟切片機(jī)(Thermo scientific, FINESSEME+)、二甲苯(國(guó)藥集團(tuán)，100023418)、蘇木精液染色(海貝索生物技術(shù)有限公司，BA-4097)、Masson三色染色液(武漢谷歌生物科技有限公司，G1006)、顯微鏡(Leica DMR);染色機(jī)(Lecia ST5010)。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 造模：適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，健康對(duì)照組正常喂養(yǎng)，糖尿病模型組大鼠依據(jù)體重一次性腹腔注射50 mg/kg濃度為1%的STZ溶液(檸檬酸和檸檬酸鈉按照1∶1配置而成的緩沖液，pH4.2)，3 d后剪尾采血，測(cè)血糖>16.7 mmol/L表明造模成功。

2.2 實(shí)驗(yàn)分組和灌藥：將34只SD大鼠隨機(jī)分為健康對(duì)照組10只，糖尿病模型組、四磨湯治療組各12只。四磨湯治療組經(jīng)換算每日一次四磨湯口服液按7.56 /ml(kg·d)，灌胃12周。

2.3 觀察對(duì)象：行為學(xué)表現(xiàn)，動(dòng)物毛發(fā)的色澤、活動(dòng)狀況、飲水量、飲食量、體重變化、精神狀態(tài)等。糖代謝情況，定期測(cè)定血糖，應(yīng)用代謝籠記錄飲食量、排尿量、飲水量等參數(shù)。尿動(dòng)力學(xué)檢測(cè)，每組大鼠按照12 m1/kg腹腔注射3.6%水合氯醛，先行下腹部膀胱頂部造瘺，導(dǎo)管插入后封閉瘺口，通過(guò)三通管使導(dǎo)管與壓力感受器和微量灌注泵連接，排空小便后，以30 ml/h的速度向膀胱泵入常溫等滲鹽水，當(dāng)排尿時(shí)，灌注暫停,記下排尿時(shí)間、逼尿肌壓等，并通過(guò)計(jì)算得到膀胱順應(yīng)性數(shù)值。膀胱組織形態(tài)學(xué)觀察即大鼠處死后取出膀胱組織，4%多聚甲醛固定，無(wú)水乙醇梯度脫水，二甲苯透明，石蠟包埋，切成約4 μm的組織片，常規(guī)蘇木素-伊紅(HE)、麥松(Masson)染色，光鏡觀察。

結(jié) 果

1 行為學(xué)表現(xiàn) 健康對(duì)照組大鼠飲食正常，體重增加，毛發(fā)顏色致密，有光澤。各糖尿病模型組大鼠出現(xiàn) “三多一少”的糖尿病征象，并伴有精神萎靡、活動(dòng)低下、毛色晦暗等。健康對(duì)照組大鼠沒(méi)有死亡的現(xiàn)象，糖尿病模型組、四磨湯治療組大鼠分別死2和4只，可能與STZ使胰島B細(xì)胞大量破壞、大鼠很難耐受持續(xù)高血糖狀態(tài)有關(guān)。第0周時(shí)，各組大鼠體重?zé)o明顯差別(P>0.05)，造模后第8周和第12周時(shí)，糖尿病模型各組大鼠體重與健康對(duì)照組大鼠相比偏低(P<0.05)，見(jiàn)表1。

表1 不同時(shí)間各組大鼠體重比較(g)

2 四磨湯口服液對(duì)血糖的影響 造模第0周(即STZ注射第3天)時(shí)，糖尿病造模各組大鼠血糖明顯上升，與健康對(duì)照組相比有明顯的統(tǒng)計(jì)學(xué)差別(P<0.05)，提示糖尿病大鼠模型制備成功。血糖在造模組中不同時(shí)段無(wú)明顯差別，提示模型相對(duì)穩(wěn)定(P>0. 05)，見(jiàn)表2。說(shuō)明書(shū)明確表明強(qiáng)生血糖儀的測(cè)量上限為27.80 mmol/L，超過(guò)此值顯示為“High”，所以上述部分組別血糖值用(27.80±0.00) mmol/L標(biāo)記。

表2 各組大鼠血糖比較(mmol/L)

3 代謝相關(guān)指標(biāo) 代謝籠指標(biāo)提示12周時(shí)糖尿病大鼠的食物攝入量、尿量和飲水量都高于健康對(duì)照組(P<0.05)。四磨湯治療組食量、尿量和飲水量與糖尿病模型組比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。見(jiàn)表3。

表3 各組大鼠代謝籠指標(biāo)比較 (g)

4 尿動(dòng)力學(xué) 模型組排尿時(shí)間(5.42±1.04)s、順應(yīng)性(5. 75±0.94)s/mmH2O指標(biāo)上較健康對(duì)照組(2.12±0.45)s、(1.48±0.37)s/mmH2O明顯增加，且最大逼尿肌壓(53.44±4.28) mmH2O也較健康對(duì)照組(63.50±2.92)mmH2O明顯下降，兩者比較具有明顯差異(P<0.05)。四磨湯治療組在大鼠排尿時(shí)間(2. 94±0.25)s和順應(yīng)性(2. 61±0.51) s/mmH2O優(yōu)于模型組(P<0.05)。見(jiàn)表4。

表4 第16周時(shí)各組大鼠尿動(dòng)力學(xué)指標(biāo)比較

5 殘余尿量及膀胱濕重 與健康對(duì)照組相比，模型組與四磨湯治療組殘余尿量與膀胱濕重明顯增加，二者之間有明顯差異(P>0.05)。四磨湯治療組和模型組相比，治療組大鼠殘余尿量和膀胱濕重較各組有改善趨勢(shì)但與模型組比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差別(P>0.05)。見(jiàn)表5。

表5 第16周時(shí)每組大鼠殘余尿量及膀胱濕重比較

6 膀胱組織形態(tài)學(xué)結(jié)果 HE染色圖片以光鏡觀察各組大鼠的膀胱組織，可以見(jiàn)到健康對(duì)照組大鼠的膀胱逼尿肌肌束排列緊密，細(xì)胞大小及形態(tài)正常，肌束間隙致密有結(jié)締組織，神經(jīng)束易見(jiàn)。其余各造模組大鼠的膀胱逼尿肌層有增厚現(xiàn)象，肌細(xì)胞肥大，形態(tài)多樣，肌束排列紊亂有斷裂，結(jié)構(gòu)松散，肌束間間隙明顯增寬，血管有充血，神經(jīng)束減少。說(shuō)明糖尿病大鼠的膀胱結(jié)構(gòu)明顯異常，經(jīng)過(guò)藥物治療后可改善糖尿病膀胱的形態(tài)。Masson染色圖片示：平滑肌肌纖維含量顯著減少，細(xì)胞外纖維化增多，治療組大鼠與模型組相比纖維化有一定的改善。

討 論

糖尿病神經(jīng)源性膀胱是糖尿病晚期的嚴(yán)重并發(fā)癥，主要是高血糖導(dǎo)致的肌源性及神經(jīng)源性病變和多尿引起逼尿肌收縮功能受損[5]。糖尿病膀胱神經(jīng)病變主要包括植物神經(jīng)病變，膀胱感覺(jué)神經(jīng)功能障礙，膽堿能(主要是M受體尤其是M3受體介導(dǎo))和非膽堿能神經(jīng)方面障礙[6]。有報(bào)道[7]膀胱舒張功能障也是植物神經(jīng)病變的重要組成部分，糖尿病膀胱逼尿肌損害出現(xiàn)在各個(gè)時(shí)間段內(nèi)且每個(gè)時(shí)間段內(nèi)B3受體含量都增加，在糖尿病膀胱病變的過(guò)程中腎上腺素能B3受體有著重要的意義。戴遲兵等[8]認(rèn)為自主神經(jīng)病變、平滑肌病變、腸道Cajal細(xì)胞的缺失都是糖尿病胃動(dòng)力障礙的病因，而胃腸激素分泌失調(diào)，如SP(substance P)、VIP(vasoactive intestinal peptide)及nNOS(neurogenic nitric oxide synthase)的失調(diào)也是糖尿病胃動(dòng)力障礙的致病因素，新近發(fā)現(xiàn)的胃腸激素Ghrelin陽(yáng)性神經(jīng)元在糖尿病模型中有減少趨勢(shì)，CGRP(calcitonin gene-related peptide)隨著糖尿病病程波動(dòng)也可能與糖尿病胃腸動(dòng)力障礙有關(guān)，四磨湯口服液可以針對(duì)上述部分病因改善糖尿病胃輕癱的癥狀。四磨湯口服液由檳榔、枳殼、木香及烏藥組方而成，且單藥研究發(fā)現(xiàn)檳榔和枳殼的活性成分檳榔堿和橙皮苷都可加強(qiáng)胃腸平滑肌收縮[9]。李紹磊等[10]認(rèn)為四磨湯口服液具有類(lèi)似M受體激動(dòng)劑效應(yīng)，主要是通過(guò)M3受體介導(dǎo)。有人報(bào)導(dǎo)膀胱逼尿肌細(xì)胞中的M受體主要是M2和M3受體且M3受體可直接參與逼尿肌細(xì)胞收縮，與M受體激動(dòng)劑結(jié)合后會(huì)誘導(dǎo)逼尿肌細(xì)胞的收縮[11]；糖尿病膀胱時(shí)膀胱內(nèi)的激素分泌也會(huì)失調(diào)，如SP、VIP、nNOS及CGRP等[12],四磨湯口服液是否會(huì)通過(guò)該途徑影響糖尿病膀胱逼尿肌的功能尚需進(jìn)一步研究。依據(jù)測(cè)定的血糖值，各造模組之間空腹血糖的差別無(wú)明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，所以四磨湯口服液灌胃對(duì)大鼠體內(nèi)高血糖狀態(tài)并無(wú)明顯影響，表明四磨湯口服液無(wú)法徹底阻斷糖尿病膀胱的發(fā)生，但四磨湯口服液灌胃后對(duì)糖尿病膀胱發(fā)生起到一定的保護(hù)作用，增加逼尿肌的收縮強(qiáng)度，進(jìn)而改善糖尿病膀胱排尿障礙。但是四磨湯口服液如何對(duì)糖尿病膀胱產(chǎn)生作用，目前尚未明確。本研究通過(guò)觀察四磨湯口服液灌胃干預(yù)大鼠糖尿病膀胱后通過(guò)尿動(dòng)力學(xué)中重要參數(shù)的變化及通過(guò)組織層面上HE染色、Masson染色的觀察，以初步探討四磨湯口服液對(duì)糖尿病性膀胱大鼠膀胱排尿功能的改善作用機(jī)制。

實(shí)驗(yàn)第0周時(shí)，各糖尿病大鼠體重明顯減輕，血糖顯著升高，尿量、食量及飲水量明顯增加，說(shuō)明糖尿病大鼠模型造模成功;第16周時(shí)，糖尿病大鼠殘余尿量及膀胱濕重顯著增加，表明糖尿病大鼠已出現(xiàn)糖尿病膀胱功能障礙的征象。糖尿病大鼠膀胱濕重與健康對(duì)照組比較明顯增加，可能是多尿、膀胱逼尿肌功能障礙和神經(jīng)病變，致使膀胱逼尿肌肥厚，間質(zhì)和膠原成分增加。尿動(dòng)力學(xué)檢查發(fā)現(xiàn)模型組大鼠排尿時(shí)間明顯延長(zhǎng)、排尿過(guò)程中最大逼尿肌壓降低、殘余尿量增加，表明逼尿肌收縮功能受損，也從功能學(xué)方面印證了造模的成功，為四磨湯口服液干預(yù)糖尿病膀胱的研究提供了良好的動(dòng)物模型。受限于大鼠膀胱有限的體積，非麻醉情形下置入測(cè)壓管并固定有一定的難度，所以本實(shí)驗(yàn)選擇在麻醉狀態(tài)下進(jìn)行尿動(dòng)力學(xué)檢查，與清醒狀態(tài)下的該檢查結(jié)果有一定的差異，將來(lái)我們會(huì)進(jìn)一步改進(jìn)大鼠尿動(dòng)力學(xué)檢查。

在本研究實(shí)驗(yàn)第16周，四磨湯口服液治療組大鼠的膀胱排尿時(shí)間、順應(yīng)性、濕重及殘余尿量，均低于糖尿病模型組，可見(jiàn)四磨湯口服液可改善糖尿病膀胱排尿功能障礙。本實(shí)驗(yàn)尚需檢測(cè)大鼠膀胱組織的受體水平，從而從分子機(jī)制水平做進(jìn)一步分析，探討四磨湯口服液是通過(guò)哪種途徑來(lái)改善糖尿病膀胱排尿功能。大鼠殘余尿量是排尿后通過(guò)膀胱測(cè)壓管抽空膀胱內(nèi)剩余尿液來(lái)計(jì)量的，因膀胱測(cè)壓管中有等滲鹽水會(huì)導(dǎo)致健康對(duì)照組大鼠殘余尿量增加，也是導(dǎo)致測(cè)量誤差的原因之一，以后我們將改進(jìn)。通過(guò)組織層面上HE染色、Masson染色的觀察，可以看出經(jīng)過(guò)四磨湯藥物治療后可改善糖尿病膀胱的形態(tài)及逼尿肌纖維化的程度。

本研究表明四磨湯可在不干擾血糖的情況下，改善糖尿病膀胱逼尿肌功能，對(duì)改善糖尿病膀胱功能障礙有一定的作用。未使用降糖藥物作為基礎(chǔ)干預(yù)手段、沒(méi)有進(jìn)行膀胱組織形態(tài)學(xué)的檢測(cè)以及四磨湯口服液沒(méi)有進(jìn)一細(xì)化低、中、高濃度對(duì)糖尿病膀胱的影響是本實(shí)驗(yàn)研究的不足之處。今后打算在該方與降糖藥聯(lián)合應(yīng)用、分子作用機(jī)制、方藥量效等方面作進(jìn)一步研究，從而為防治糖尿病神經(jīng)源性膀胱提供更多方法?？傊?，在糖尿病導(dǎo)致糖尿病膀胱形成的過(guò)程中，膀胱逼尿肌功能障礙起著非常重要的作用。四磨湯口服液可通過(guò)增強(qiáng)逼尿肌收縮力和減少殘尿量有助于改善糖尿病膀胱排尿功能障礙。因此，四磨湯口服液可能成為早期糖尿病性膀胱功能障礙潛在的治療手段之一。