遼寧樹莓黏菌病病原菌原質(zhì)團(tuán)生物學(xué)特性研究

臧超群 林秋君 傅俊范

摘要：采用植物病理學(xué)研究方法，對(duì)樹莓（Rubus idaeus L.）黏菌病病原菌黏菌原質(zhì)團(tuán)進(jìn)行生物學(xué)特性測(cè)定。結(jié)果表明，黏菌原質(zhì)團(tuán)在馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基、馬鈴薯蔗糖瓊脂培養(yǎng)基、燕麥培養(yǎng)基、樹莓葉粉培養(yǎng)基、査氏培養(yǎng)基、水瓊脂培養(yǎng)基、孟加拉紅培養(yǎng)基、玉米粉培養(yǎng)基8種培養(yǎng)基上均可生長(zhǎng)，其中樹莓葉粉培養(yǎng)基上生長(zhǎng)最佳，菌落直徑可達(dá)8.45 cm；最適碳源為乳糖和淀粉，最適氮源為精氨酸，最適pH為6，最適生長(zhǎng)溫度為30 ℃，最適培養(yǎng)條件為24 h連續(xù)黑暗。

關(guān)鍵詞：樹莓（Rubus idaeus L.）；黏菌；原質(zhì)團(tuán)；生物學(xué)特性

中圖分類號(hào)：S663.2；Q936 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：0439-8114（2018）12-0065-04

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2018.12.018

Abstract： Using the phytopathological methods，the biological characteristics of mycetozoan isolated from raspberry（Rubus idaeus L.） was tested. The results showed that the plasmodium of mycetozoan could grow on the eight different mediums，such as PDA，PSA，oatmeal agar medium，raspberry leaf powder medium，czapek's medium，water agar medium，rose bengal medium，corn flour medium. Among these mediums the colony on raspberry leaf powder growed best， with the diameter up to 8.45 cm.Optimum carbon source was lactose and starch，and the optimum nitrogen source was arginine， the optimum pH was 6，the optimum growth temperature was 30 ℃，24 h continuous darkness had the best effect on colony growth.

Key words： raspberry（Rubus idaeus L.）； mycetozoan； plasmodium； biological characteristics

樹莓（Rubus idaeus L.）為薔薇科、懸鉤子屬多年生小灌木類落葉果樹。隨著國(guó)際市場(chǎng)需求量的增加及中國(guó)農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)結(jié)構(gòu)的調(diào)整，全國(guó)樹莓栽培面積逐年增加，樹莓病害日益嚴(yán)重。近幾年，遼寧省沈陽(yáng)市樹莓產(chǎn)區(qū)內(nèi)發(fā)現(xiàn)1種樹莓新病害——黏菌病，引起樹莓種植戶的恐慌[1]。黏菌常附著活的植物體上而有礙觀瞻，在有損美觀的同時(shí)也會(huì)對(duì)植物造成危害，在較高溫濕條件下一些作物苗床上常導(dǎo)致幼苗萎蔫。2011年在浙江省樂(lè)清市的鐵皮石斛種植田內(nèi)發(fā)現(xiàn)2種黏菌病，該病害可對(duì)鐵皮石斛正常生長(zhǎng)造成嚴(yán)重影響[2]；黏菌也是危害平菇、雙孢蘑菇、滑子菇、木耳、靈芝等菇類的一種常見(jiàn)病害，普遍發(fā)生于冀北食用菌產(chǎn)區(qū)，尤以老菇棚、菇房受害為重，一般可使食用菌減產(chǎn)20%左右，嚴(yán)重的可減產(chǎn)50%以上甚至絕收[3]；在福建有黏菌危害花生幼苗的報(bào)道[4]。

黏菌的營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)階段是獨(dú)立生活、多核非細(xì)胞結(jié)構(gòu)、僅有表面質(zhì)膜無(wú)細(xì)胞壁、能變形移動(dòng)和攝食有機(jī)物的一團(tuán)原生質(zhì)，稱為原質(zhì)團(tuán)[5]。黏菌黏變形體產(chǎn)生性結(jié)合后，便會(huì)進(jìn)行新一階段的個(gè)體發(fā)育，合子便會(huì)分裂形成雙核的幼原質(zhì)團(tuán)，合子通過(guò)連續(xù)的核分裂很快便會(huì)形成一個(gè)微小的原質(zhì)團(tuán)[6]。Alexopoulos等[7]將黏菌的原質(zhì)團(tuán)類型總結(jié)為3種，原始型原質(zhì)團(tuán)、隱型原質(zhì)團(tuán)、顯型原質(zhì)團(tuán)。原生質(zhì)團(tuán)是黏菌生活周期中的營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)階段，原質(zhì)團(tuán)的形態(tài)大小、顏色和結(jié)構(gòu)都有分類學(xué)意義[8]。目前，尚未發(fā)現(xiàn)樹莓黏菌病病原菌原質(zhì)團(tuán)生物學(xué)特性研究的報(bào)道，從樹莓上分離獲得1株黏菌，擬測(cè)定不同培養(yǎng)基、碳氮源、溫度、光照和pH等對(duì)黏菌的生長(zhǎng)的影響，旨在為樹莓黏菌病的防控提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試病原菌 黏菌，由遼寧省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所生物防治研究室分離、保存。

1.1.2 供試培養(yǎng)基 基礎(chǔ)碳源培養(yǎng)基：（NH4）2SO4 2.64 g，KH2PO4 2.38 g，K2HPO4·3H2O 5.65 g，MgSO4·7H2O 1 g，CuSO4·H2O 6.4 mg，F(xiàn)eSO4·7H2O 1.1 mg，MnCl2·4H2O 7.9 mg，ZnSO4·7H2O 1.5 mg，去離子水1 000 mL，pH 6.8～7.0。

基礎(chǔ)氮源培養(yǎng)基：葡萄糖10 g，MgSO4·7H2O 0.5 g，NaCl 0.5 g，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.01 g，去離子水1 000 mL，pH 7.2。

馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（PDA）：馬鈴薯200 g，葡萄糖10 g，瓊脂粉16 g，去離子水1 000 mL。

馬鈴薯蔗糖瓊脂培養(yǎng)基（PSA）：馬鈴薯200 g，蔗糖10 g，瓊脂粉16 g，去離子水1 000 mL。

燕麥培養(yǎng)基：燕麥片30 g，瓊脂粉16 g，去離子水1 000 mL。

樹莓葉粉培養(yǎng)基：樹莓干樹葉粉30 g，瓊脂粉16 g，去離子水1 000 mL。

査氏培養(yǎng)基：KNO3 2 g，K2HPO4 1 g，KCl 0.5 g，MgSO4·7H2O 0.5 g，F(xiàn)eSO4 0.01 g，蔗糖30 g，瓊脂粉16 g，去離子水1 000 mL。

水瓊脂培養(yǎng)基：瓊脂粉16 g，去離子水1 000 mL。

孟加拉紅培養(yǎng)基：蛋白胨5 g，葡萄糖10 g，KH2PO4 1 g，MgSO4 0.5 g，瓊脂粉16 g，孟加拉紅0.033 g，氯霉素0.1 g。

玉米粉培養(yǎng)基：玉米粉30 g，瓊脂粉16 g，去離子水1 000 mL。

1.2 黏菌原質(zhì)團(tuán)生物學(xué)特性研究

1.2.1 不同培養(yǎng)基對(duì)黏菌原質(zhì)團(tuán)生長(zhǎng)的影響 將黏菌在燕麥培養(yǎng)基上培養(yǎng)，待原質(zhì)團(tuán)長(zhǎng)至直徑6 cm時(shí)，用打孔器在菌落邊緣均勻打0.7 cm直徑的菌餅，分別移植于PDA、PSA、燕麥培養(yǎng)基、樹莓葉粉培養(yǎng)基、查氏培養(yǎng)基、水瓊脂培養(yǎng)基、孟加拉紅培養(yǎng)基、玉米粉培養(yǎng)基中。25 ℃恒溫培養(yǎng)，10 d后采用十字交叉法測(cè)量原質(zhì)團(tuán)直徑，每個(gè)處理3次重復(fù)。

1.2.2 不同碳源培養(yǎng)基對(duì)黏菌原質(zhì)團(tuán)生長(zhǎng)的影響 將蔗糖、葡萄糖、果糖、山梨糖、乳糖、麥芽糖、淀粉、木糖以1%（m/v）加入基礎(chǔ)碳源培養(yǎng)基，配制含不同碳源的培養(yǎng)基。按照“1.2.1”方法將黏菌移植在不同碳源培養(yǎng)基上，25 ℃恒溫培養(yǎng)，10 d后采用十字交叉法測(cè)量原質(zhì)團(tuán)直徑，每個(gè)處理3次重復(fù)。

1.2.3 不同氮源培養(yǎng)基對(duì)黏菌原質(zhì)團(tuán)生長(zhǎng)的影響 將半胱氨酸、甘氨酸、精氨酸、磷酸二氫銨、氯化銨、硝酸銨、硫酸銨、草酸銨、硝酸鉀以1%（m/v）加入基礎(chǔ)碳源培養(yǎng)基，配制含不同氮源的培養(yǎng)基。按照“1.2.1”方法將黏菌移植在不同氮源培養(yǎng)基上，25 ℃恒溫培養(yǎng)，10 d后采用十字交叉法測(cè)量原質(zhì)團(tuán)直徑，每個(gè)處理3次重復(fù)。

1.2.4 不同pH對(duì)黏菌原質(zhì)團(tuán)生長(zhǎng)的影響 分別用HCl（1 mol/L）和NaOH（1 mol/L）將燕麥培養(yǎng)基調(diào)配成pH為3、4、5、6、7、8、9和10，按照“1.2.1”方法將黏菌移植在不同pH培養(yǎng)基上，25 ℃恒溫培養(yǎng)，10 d后采用十字交叉法測(cè)量原質(zhì)團(tuán)直徑，每個(gè)處理3次重復(fù)。

1.2.5 不同溫度處理對(duì)黏菌原質(zhì)團(tuán)生長(zhǎng)的影響 按照“1.2.1”方法將黏菌移植在燕麥培養(yǎng)基上，分別置于15、20、25、30和35 ℃的恒溫箱中培養(yǎng)，10 d后采用十字交叉法測(cè)量原質(zhì)團(tuán)直徑，每個(gè)處理3次重復(fù)。

1.2.6 不同光照條件對(duì)黏菌原質(zhì)團(tuán)生長(zhǎng)的影響 按照“1.2.1”方法將黏菌移植在燕麥培養(yǎng)基上，分別置于24 h連續(xù)光照，24 h連續(xù)黑暗，12 h/12 h光暗交替培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度25 ℃，10 d后采用十字交叉法測(cè)量原質(zhì)團(tuán)直徑，每個(gè)處理3次重復(fù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同培養(yǎng)基對(duì)黏菌原質(zhì)團(tuán)生長(zhǎng)的影響

由圖1可知，黏菌原質(zhì)團(tuán)在供試的8種不同培養(yǎng)基上均能生長(zhǎng)，原質(zhì)團(tuán)生長(zhǎng)的大小存在顯著差異性。樹莓葉粉培養(yǎng)基是黏菌最適宜利用的培養(yǎng)基，在該培養(yǎng)基上生長(zhǎng)10 d菌落直徑能達(dá)到8.45 cm，說(shuō)明樹莓葉粉中的含有黏菌適宜利用的營(yíng)養(yǎng)成分，水瓊脂培養(yǎng)基最不適宜黏菌生長(zhǎng)。

2.2 不同碳源培養(yǎng)基對(duì)黏菌原質(zhì)團(tuán)生長(zhǎng)的影響

黏菌原質(zhì)團(tuán)在供試的9種不同碳源培養(yǎng)基上均能正常生長(zhǎng)，但是原生質(zhì)直徑存在顯著差異。乳糖和淀粉是黏菌生長(zhǎng)最適宜的碳源，其次是麥芽糖。黏菌生長(zhǎng)最不適宜利用的碳源為山梨糖（圖2）。

2.3 不同氮源培養(yǎng)基對(duì)黏菌原質(zhì)團(tuán)生長(zhǎng)的影響

黏菌原質(zhì)團(tuán)在供試的9種不同氮源培養(yǎng)基上均可生長(zhǎng)，但是原生質(zhì)直徑存在顯著差異。精氨酸是黏菌生長(zhǎng)最適宜的氮源，其次是硝酸鉀和甘氨酸，在其他供試的氮源培養(yǎng)基上生長(zhǎng)較慢（圖3）。

2.4 不同pH對(duì)黏菌原質(zhì)團(tuán)生長(zhǎng)的影響

由圖4可知，黏菌原質(zhì)團(tuán)對(duì)于生長(zhǎng)環(huán)境酸堿度的耐受范圍較廣，在pH 3～10范圍內(nèi)均可生長(zhǎng)，弱酸性或中性均適合黏菌生長(zhǎng)，當(dāng)pH為6時(shí)，黏菌生長(zhǎng)最快，當(dāng)pH為3時(shí)，黏菌生長(zhǎng)緩慢。

2.5 不同溫度處理對(duì)原質(zhì)團(tuán)生長(zhǎng)的影響

由圖5可知，黏菌原質(zhì)團(tuán)在15～35 ℃均能生長(zhǎng)，但生長(zhǎng)速度存在顯著差異，當(dāng)環(huán)境溫度為30 ℃時(shí)黏菌生長(zhǎng)最快。

2.6 不同光照條件對(duì)黏菌原質(zhì)團(tuán)生長(zhǎng)的影響

由圖6可知，黏菌原質(zhì)團(tuán)在不同光照條件下均能生長(zhǎng)，但生長(zhǎng)速度存在顯著差異。在24 h連續(xù)黑暗條件下原質(zhì)團(tuán)生長(zhǎng)最快。

3 小結(jié)與討論

有研究表明，絨泡菌目黏菌原質(zhì)團(tuán)最適宜的培養(yǎng)基為燕麥培養(yǎng)基[9]，本研究從樹莓上分離獲得的黏菌原質(zhì)團(tuán)在8種供試培養(yǎng)基上均可以生長(zhǎng)，以樹莓葉粉培養(yǎng)基上生長(zhǎng)最好，其次是在燕麥培養(yǎng)基，與前人研究結(jié)果基本一致，本黏菌是從樹莓上篩選獲得，是長(zhǎng)期自然選擇的結(jié)果，因此易利用樹莓葉粉的營(yíng)養(yǎng)成分。9種供試碳源培養(yǎng)基中，最佳碳源為乳糖和淀粉，在山梨糖培養(yǎng)基上長(zhǎng)勢(shì)最差。9種氮源培養(yǎng)基中，最佳氮源為精氨酸，在半胱氨酸培養(yǎng)基上生長(zhǎng)最差。黏菌原質(zhì)團(tuán)在pH為3～10均能生長(zhǎng)，當(dāng)環(huán)境為弱酸性時(shí)適宜原質(zhì)團(tuán)生長(zhǎng)，當(dāng)pH為3時(shí)，生長(zhǎng)緩慢，這與Bryson[10]的研究結(jié)果一致。在不同光照培養(yǎng)條件下均能生長(zhǎng)，24 h連續(xù)黑暗條件下生長(zhǎng)最佳。原質(zhì)團(tuán)在10～35 ℃條件下均可生長(zhǎng)，Hok[11]研究發(fā)現(xiàn)黏菌原質(zhì)團(tuán)避光培養(yǎng)時(shí)，可以在16～30 ℃生長(zhǎng)，在30 ℃時(shí)生長(zhǎng)會(huì)受到限制，本研究發(fā)現(xiàn)樹莓黏菌原質(zhì)團(tuán)在30 ℃條件下恒溫培養(yǎng)生長(zhǎng)最快，出現(xiàn)這種結(jié)果的原因可能是由于黏菌的種類不同。本研究結(jié)果為了解黏菌的生活習(xí)性和樹莓黏菌病的防控提供科學(xué)依據(jù)。

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