針刺介入時機對缺血性中風大鼠腦組織中PTEN、p-AKT和p-GSK3b的影響

劉勇,孫嘉婧

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針刺介入時機對缺血性中風大鼠腦組織中PTEN、p-AKT和p-GSK3b的影響

劉勇1,孫嘉婧2

(1.黑龍江中醫(yī)藥大學附屬第一醫(yī)院,哈爾濱 150040;2.黑龍江中醫(yī)藥大學,哈爾濱 150040)

觀察不同針刺介入時間對局灶性腦缺血中風模型大鼠腦組織細胞中雙特異性磷酸酶(PTEN)、磷酸化蛋白激酶B(p-AKT)和磷酸化糖原合酶激酶-3b(p-GSK3b)的影響。將200只成年雄性SD大鼠隨機分為A組(假手術組)、B組(模型組)、C組(造模后2 h針刺組)、D組(造模后72 h針刺組)和E組(造模后168 h針刺組),每組40只。除A組外,其余各組均采用線栓法制備大鼠局灶性永久性腦缺血模型。各組術后1 d、3 d、7 d及14 d分別采用Garcia復合評分法評定神經(jīng)功能,并采用Western Blot法和RT-PCR法檢測腦組織中PTEN、p-AKT和p-GSK3b基因的轉錄和相應蛋白的表達情況。與B組比較,C組和E組在不同時間點(術后1 d、3 d、7 d和14 d)Garcia復合評分均顯著提高(＜0.01)。D組術后7 d和14 d Garcia復合評分與C組比較,差異有統(tǒng)計學意義(＜0.05)。E組術后3 d、7 d和14 d Garcia復合評分與C組比較,差異均具有統(tǒng)計學意義(＜0.05)。B組在不同時間點(術后1 d、3 d、7 d和14 d)PTEN、p-AKT、p-GSK3b蛋白表達及PTEN mRNA、p-AKT mRNA、p-GSK3bmRNA表達與A組和C組比較,差異均具有統(tǒng)計學意義(＜0.01,＜0.05)。D組和E組術后3 d、7 d和14 d PTEN、p-AKT、p-GSK3b蛋白表達與C組比較,差異均具有統(tǒng)計學意義(＜0.01,＜0.05)。D組和E組在不同時間點(術后1 d、3 d、7 d和14 d)PTEN mRNA、p-AKT mRNA、p-GSK3bmRNA表達與C組比較,差異均具有統(tǒng)計學意義(＜0.01,＜0.05)。針刺可顯著降低缺血腦組織神經(jīng)細胞中PTEN的表達,顯著升高p-AKT和p-GSK3b的表達,從而抑制細胞凋亡,保護和修復受損神經(jīng)元細胞,且越早進行針刺,效果越好。

針刺;腦梗死;中風;介入時機;雙特異性磷酸酶;磷酸化蛋白激酶B;磷酸化糖原合酶激酶-3b;大鼠

針刺療法對于腦梗死的臨床治療是積極有效的。大量實驗研究證明,針刺對缺血性中風大鼠的治療效果顯著[1]。雙特異性磷酸酶(PTEN)參與調控神經(jīng)細胞周期[2],其表達升高可抑制磷酸化蛋白激酶B(p-AKT)的表達[3]。而PI3K/AKT通路是神經(jīng)細胞再生的重要環(huán)節(jié),磷酸化糖原合酶激酶-3b(p-GSK3b)是PI3K/Akt通路的下游效應靶點蛋白,p-GSK3b失活可阻止凋亡通路的激活。抑制PTEN的表達可促進p-AKT和p-GSK3b的表達[4],從而促進受損神經(jīng)干細胞修復和再生。本研究通過觀察不同針刺時機對缺血性中風大鼠腦組織中PTEN、p-AKT和GSK3b表達的影響,為尋找針刺治療腦梗死的最佳時機提供實驗室依據(jù),現(xiàn)報告如下。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及分組

選用2月齡、體重為280～300 g的健康清潔級雄性Sprague-Dawley(SD)大鼠250只(其中50只備用),購于黑龍江中醫(yī)藥大學實驗動物中心,許可證號(SCXK黑2008004)。將200只大鼠隨機分為A組(假手術組)、B組(模型組)、C組(缺血2 h針刺組)、D組(缺血72 h針刺組)和E組(缺血168 h針刺組),每組40只。

1.2 實驗儀器與試劑

1.2.1 主要儀器

電泳槽Mini P-4(Cavoy公司);MultiSkan3酶標儀(美國Thermo公司);水平脫色搖床(其林貝爾儀器制造有限公司);垂直電泳儀,半干槽,全自動梯度PCR儀、PCR反應擴增儀(美國Bio-Rad公司);凝膠成像系統(tǒng)(以色列MiniLumi公司);核酸電泳系統(tǒng)(美國Bio- Rad公司);pH儀(德國Sartorius公司)。

1.2.2 主要試劑

1.2.2.1 WB實驗試劑

蛋白抽提試劑、BCA蛋白定量試劑盒、考馬斯亮藍染色液、電泳緩沖液、中分子量蛋白marker、NC膜、濕轉緩沖液、麗春紅染色液(賽諾博公司提供);蛋白酶、磷酸酶抑制劑(Roche group);Trizma base、Glycine、T1503、SDS、Sodium deoxycholate (Sigma- Aldrich);山羊抗兔IgG、HRP,山羊抗小鼠IgG、GAPDH鼠單克隆抗體(天德悅公司提供);PTEN、p-AKT和p-GSK3b單抗(美國SANTACRUZ公司)。

1.2.2.2 RT-PCR所用試劑

Goldview染料、50XTAE電泳緩沖液(諾特萊斯生物科技有限公司);2xPCR TaqMix(北京康為世紀生物科技有限公司);瓊脂糖(上海貝晶生物技術有限公司);氯仿、異丙醇、無水乙醇(天津市富宇精細化工有限公司);PCR擴增引物、DNA Marker(2000bp)、RNA提取試劑盒、反轉錄試劑盒[寶生物工程(大連)有限公司]。

1.3 動物模型制備

采用頸內動脈線栓法制備大鼠局灶性永久性腦缺血模型[5]。將釣魚線經(jīng)75%乙醇消毒后制備線栓,并置于蒸餾水中備用。大鼠成功麻醉后,仰位固定于手術臺上。手術區(qū)域常規(guī)消毒,備皮后沿頸前正中線縱行切開皮膚,鈍性分離皮膚和皮下肌肉組織,在暴露左側頸總動脈(common carotid artery, CCA)后,依次分離出頸外動脈(external carotid artery, ECA)、頸內動脈(internal carotid artery, ICA),并時刻保護迷走神經(jīng)。依次在CCA近、遠心兩端以及ECA掛線備用。隨后先用微動脈夾暫時夾閉ICA,并迅速結扎CCA近心端和ECA。在距離左側CCA分叉4 mm處剪一斜向小口,由此將線栓小心插入ICA中,先將CCA遠端掛線稍系緊,然后繼續(xù)推進栓線進入ICA,在栓線過ICA的分叉18 mm時,系緊CCA遠心端的掛線。然后清理手術切口,用青霉素消炎處理,再逐層縫合肌肉和皮膚,用碘伏對切口表面進行局部消毒。A組除不進行插入線栓外,其余處理同B組。造模成功大鼠會出現(xiàn)明顯右肢癱瘓;或將其提尾懸空時,出現(xiàn)右上肢屈曲或向左側傾斜、轉圈。

1.4 動物干預方法

C組、D組和E組分別在造模成功后2 h、72 h和168 h進行針刺治療。取左側百會及雙側風池穴,穴位定位參照《實驗針灸學》[6]。將大鼠牢牢捆綁固定后,采用0.30 mm×13 mm毫針進行針刺,百會向曲鬢穴透刺,進針約0.8 mm,留針30 min,其間每隔10 min行捻轉手法1 min,要求速度為180～200 r/min;風池進針約0.5 mm,留針30 min,其間每隔10 min行提插捻轉手法1次。各針刺組均每日治療1次。

1.5 觀察指標

1.5.1 神經(jīng)功能評分測定

各組分別于術后1 d、3 d、7 d及14 d隨機選擇10只大鼠,采用Garcia 18分的復合評分法[7]對神經(jīng)功能進行評分。

1.5.2 腦組織標本采集及指標的測定

在神經(jīng)功能評分測試完成后,在相應時間將大鼠處死并斷頭,分離缺血部分的腦組織備用。利用WB法檢測PTEN、p-AKT和p-GSK3b蛋白的表達,利用RT-PCR法檢測PTEN、p-AKT和p-GSK3bmRNA的轉錄情況。

1.6 統(tǒng)計學方法

采用SPSS18.0軟件進行統(tǒng)計分析。符合正態(tài)分布的計量資料以均數(shù)±標準差表示,采用單因素方差分析,組間兩兩比較采用法。檢驗水準為α=0.05。

2 結果

各組在取材前共死亡45只,未進行取材及實驗數(shù)據(jù)分析,總死亡率為18.4%。其中A組死亡1只,原因為進行CCA切口時不慎將其剪斷,且近心端未結扎完全,導致大量出血死亡;B組死亡8只;C組死亡16只;D組死亡11只,E組死亡9只。造模時大鼠共死亡39只,造模成功率為80.9%,死亡原因為術中損傷迷走神經(jīng)導致呼吸心率衰竭、插入線栓時大量出血及術后感染等。此外,C組在造模后2 h進行針刺治療,由于大鼠掙扎導致未完全愈合的傷口開裂,從而出血或感染死亡5只。進行手術且存活的大鼠均單獨置于實驗動物專用籠,保證供給足量且等量的飼料和水,盡可能保證影響因素一致,并按時清理墊料保持衛(wèi)生,以此避免感染及不必要的傷害。剩余5只大鼠妥善飼養(yǎng)。

2.1 各組不同時間點Garcia復合評分比較

由表1可見,A組不存在神經(jīng)功能缺損,故4個時間點評分均為(18.00±0.00)分。C組和E組術后1 d、3 d、7 d和14 d Garcia復合評分與B組比較,差異有統(tǒng)計學意義(＜0.01)。D組術后1 d Garcia復合評分與B組比較,差異有統(tǒng)計學意義(＜0.01)。D組術后7 d和14 d Garcia復合評分與C組比較,差異有統(tǒng)計學意義(＜0.05)。E組術后3 d、7 d和14 d Garcia復合評分與C組比較,差異有統(tǒng)計學意義(＜0.05)。E組術后3 d、14 d Garcia復合評分與D組比較,差異有統(tǒng)計學意義(＜0.05)。提示針刺能明顯提高腦缺血中風大鼠Garcia復合評分,改善其感覺、運動和協(xié)調功能,其中C組改善大鼠神經(jīng)功能效果最好。

表1 各組不同時間點Garcia復合評分比較 (±s,分)

注:與B組比較1)＜0.01;與C組比較2)＜0.05;與D組比較3)＜0.05

2.2 各組大鼠不同時間點缺血腦組織中PTEN、p-AKT和p-GSK3b蛋白表達比較

由圖1、表2可見,A組大鼠腦組織中PTEN蛋白呈低表達;B組大鼠腦組織中PTEN蛋白呈高表達,隨著缺血時間的延長逐漸增強,并在缺血7 d時到達高峰,然后略有下降;與B組比較,C組、D組和E組大鼠腦組織中PTEN蛋白表達均有不同程度降低,隨著針刺時間的延長,降低越為顯著,其中以C組最為明顯。

B組、C組、D組和E組在不同時間點(術后1 d、3 d、7 d和14 d)PTEN蛋白表達與A組比較,差異均具有統(tǒng)計學意義(＜0.01,＜0.05)。C組、D組和E組不同時間點(術后1 d、3 d、7 d和14 d)PTEN蛋白表達與B組比較,差異均有統(tǒng)計學意義(＜0.05)。D組和E組術后3 d、7 d和14 d PTEN蛋白表達與C組比較,差異均具有統(tǒng)計學意義(＜0.05)。E組術后14 d PTEN蛋白表達與D組比較,差異具有統(tǒng)計學意義(＜0.05)。提示針刺能夠降低缺血腦組織中PTEN蛋白表達,且針刺干預越早對PTEN的影響越明顯。

由圖1、表3可見,A組大鼠腦組織中p-AKT蛋白呈高表達;B組大鼠腦組織中p-AKT蛋白呈低表達,隨著缺血時間的延長逐漸增強,并在缺血7 d時到達高峰,然后略有下降;與B組比較,C組、D組和E組大鼠腦組織中p-AKT蛋白表達均有不同程度升高,隨著針刺時間的延長,升高越為顯著,其中以C組最明顯。

表2 各組大鼠不同時間點缺血腦組織中PTEN蛋白表達比較 (±s,OD)

注:與A組比較1)＜0.01,2)＜0.05;與B組比較3)＜0.05;與C組比較4)＜0.05;與D組比較5)＜0.05

表3 各組大鼠不同時間點缺血腦組織中p-AKT蛋白表達比較 (±s,OD)

注:與A組比較1)＜0.01,2)＜0.05;與B組比較3)＜0.01,4)＜0.05;與C組比較5)＜0.01,6)＜0.05;與D組比較7)P＜0.05

B組和C組不同時間點(術后1 d、3 d、7 d和14 d) p-AKT蛋白表達與A組比較,差異均具有統(tǒng)計學意義 (＜0.01,＜0.05)。C組和D組不同時間點(術后1 d、3 d、7 d和14 d)p-AKT蛋白表達與B組比較,差異均有統(tǒng)計學意義(＜0.01,＜0.05)。D組和E組術后3 d、7 d和14 d p-AKT蛋白表達與C組比較,差異均具有統(tǒng)計學意義(＜0.01,＜0.05)。E組術后3 d、7 d和14 d p-AKT蛋白表達與D組比較,差異具有統(tǒng)計學意義(＜0.05)。提示針刺能夠升高缺血腦組織中p-AKT蛋白表達,針刺干預越早對p-AKT影響越明顯。

由圖1、表4可見,A組大鼠腦組織中p-GSK3b蛋白呈高表達;B組大鼠腦組織中p-GSK3b蛋白呈低表達,隨缺血時間的延長逐漸增強,并在缺血7 d時到達高峰,然后略有下降;與B組比較,C組、D組和E組大鼠腦組織中p-GSK3b蛋白表達均有不同程度升高,隨著針刺時間的延長,升高越為顯著,其中以C組最明顯。

B組、C組和D組不同時間點(術后1 d、3 d、7 d和14 d)p-GSK3b蛋白表達與A組比較,差異均具有統(tǒng)計學意義(＜0.05)。C組不同時間點(術后1 d、3 d、7 d和14 d)p-GSK3b蛋白表達與B組、D組和E組比較,差異均具有統(tǒng)計學意義(＜0.01,＜0.05)。E組術后3 d、7 d和14 d p-GSK3b蛋白表達與D組比較,差異具有統(tǒng)計學意義(＜0.05)。提示針刺能夠升高缺血腦組織中p-GSK3b蛋白表達,針刺干預越早對p-GSK3b的影響越明顯。

表4 各組大鼠不同時間點缺血腦組織中p-GSK3b蛋白表達比較 (±s,OD)

注:與A組比較1)＜0.05;與B組比較2)＜0.01,3)＜0.05;與C組比較4)＜0.01,5)＜0.05;與D組比較6)＜0.05

2.3 各組大鼠不同時間點缺血腦組織中PTEN、p-AKT和p-GSK3b轉錄比較

由圖2可見,A組大鼠腦組織中PTEN mRNA呈低轉錄;B組大鼠腦組織中PTEN mRNA呈高轉錄,隨著缺血時間的延長逐漸增強,并在缺血7 d時達到高峰,然后略有下降;與B組比較,C組、D組和E組大鼠腦組織中PTEN mRNA的轉錄情況均有不同程度的降低,隨著針刺時間的延長,降低越為顯著,其中以C組最明顯。

由表5可見,B組、C組、D組和E組不同時間點(術后1 d、3 d、7 d和14 d)PTEN mRNA表達與A組比較,差異均有統(tǒng)計學意義(＜0.01,＜0.05)。C組不同時間點(術后1 d、3 d、7 d和14 d)PTEN mRNA表達與B組、D組和E組比較,差異均有統(tǒng)計學意義(＜0.01,＜0.05)。E組術后3 d、7 d和14 d PTEN mRNA表達與D組比較,差異具有統(tǒng)計學意義(＜0.05)。提示針刺能夠有效抑制缺血腦組織中PTEN mRNA的轉錄,針刺干預越早對PTEN mRNA的影響越明顯。

由圖3可見,A組大鼠腦組織中p-AKT mRNA呈高表達;B組大鼠腦組織中p-AKT mRNA呈低表達,隨著缺血時間的延長逐漸增強,并在缺血7 d時達高峰,然后略有下降;與B組比較,C組、D組和E組大鼠腦組織中p-AKT mRNA表達均有不同程度的升高,隨著針刺時間的延長,升高越為顯著,其中以C組最明顯。

由表6可見,B組、D組和E組不同時間點(術后1 d、3 d、7 d和14 d)p-AKT mRNA表達與A組比較,差異均具有統(tǒng)計學意義(＜0.01,＜0.05)。C組術后1 d、7 d和14 d p-AKT mRNA表達與A組比較,差異均具有統(tǒng)計學意義(＜0.05)。C組不同時間點(術后1 d、3 d、7 d和14 d)p-AKT mRNA表達與B組、D組和E組比較,差異均具有統(tǒng)計學意義(＜0.01,＜0.05)。E組術后7 d和14 d PTEN mRNA表達與D組比較,差異具有統(tǒng)計學意義(＜0.01,＜0.05)。提示針刺能夠升高缺血腦組織中p-AKT mRNA表達,針刺干預越早對p-AKT mRNA的影響越明顯。

表5 各組大鼠不同時間點腦組織中PTEN mRNA表達比較 (±s,OD)

注:與A組比較1)＜0.01,2)＜0.05;與B組比較3)＜0.01,4)＜0.05;與C組比較5)＜0.01,6)＜0.05;與D組比較7)＜0.05

注:M為Marker2000;1為A組術后1 d;2為A組術后3 d;3為A組術后7 d;4為A組術后14 d;5為B組術后1 d;6為B組術后3 d;7為B組術后7 d;8為B組術后14 d; 9為C組術后1 d;10為C組術后3 d;11為C組術后7 d;12為C組術后14 d;13為D組術后1 d;14為D組術后3 d;15為D組術后7 d;16為D組術后14 d;17為E組術后1 d;18為E組術后3 d;19為E組術后7 d;20為E組術后14 d

表6 各組大鼠缺血腦組織中p-AKT mRNA表達比較 (±s,OD)

注:與A組比較1)＜0.01,2)＜0.05;與B組比較3)＜0.01,4)＜0.05;與C組比較5)＜0.01,6)＜0.05;與D組比較7)＜0.01,8)＜0.05

注:M為Marker2000;1為A組術后1 d;2為A組術后3 d;3為A組術后7 d;4為A組術后14 d;5為B組術后1 d;6為B組術后3 d;7為B組術后7 d;8為B組術后14 d; 9為C組術后1 d;10為C組術后3 d;11為C組術后7 d;12為C組術后14 d;13為D組術后1 d;14為D組術后3 d;15為D組術后7 d;16為D組術后14 d;17為E組術后1 d;18為E組術后3 d;19為E組術后7 d;20為E組術后14 d

由圖4可見,A組大鼠腦組織中p-GSK3bmRNA呈高表達;B組大鼠腦組織中p-GSK3bmRNA呈低表達,隨著缺血時間的延長逐漸增強,并在缺血7 d時達高峰,然后略有下降;與B組比較,C組、D組和E組大鼠腦組織中p-GSK3bmRNA表達均有不同程度的升高,隨著針刺時間的延長,升高越為顯著,其中以C組最明顯。

由表7可見,B組、C組、D組和E組不同時間點(術后1 d、3 d、7 d和14 d)p-GSK3bmRNA表達與A組比較,差異均具有統(tǒng)計學意義(＜0.01,＜0.05)。C組不同時間點(術后1 d、3 d、7 d和14 d)p-GSK3bmRNA表達與B組、D組和E組比較,差異均具有統(tǒng)計學意義(＜0.01,＜0.05)。E組術后14 d p-GSK3bmRNA表達與D組比較,差異具有統(tǒng)計學意義(＜0.05)。提示針刺能夠升高缺血腦組織中p-GSK3bmRNA表達,針刺干預越早對p-GSK3bmRNA的影響越明顯。

表7 各組大鼠不同時間點缺血腦組織中p-GSK3b mRNA表達比較 (±s,OD)

注:與A組比較1)＜0.01,2)＜0.05;與B組比較3)＜0.01,4)＜0.05;與C組比較5)＜0.01;與D組比較6)＜0.05

注:M為Marker2000;1為A組術后1 d;2為A組術后3 d;3為A組術后7 d;4為A組術后14 d;5為B組術后1 d;6為B組術后3 d;7為B組術后7 d;8為B組術后14 d; 9為C組術后1 d;10為C組術后3 d;11為C組術后7 d;12為C組術后14 d;13為D組術后1 d;14為D組術后3 d;15為D組術后7 d;16為D組術后14 d;17為E組術后1 d;18為E組術后3 d;19為E組術后7 d;20為E組術后14 d

3 討論

神經(jīng)功能評分是腦缺血中評價神經(jīng)功能損害及神經(jīng)功能恢復程度的行為學檢查方法。目前,Garcia復合評分法從大鼠自主運動、體態(tài)活動對稱性、前肢伸展功能、網(wǎng)格實驗、身體雙側感覺、雙側胡須反射6方面多角度評價神經(jīng)功能缺損程度,可避免單一評價方法的片面及主觀性,且該方法可操作性好[5]。本研究對針刺后的腦缺血中風大鼠進行神經(jīng)功能評分,證實針刺能明顯提高腦中風大鼠神經(jīng)功能Garcia復合評分,改善缺血性中風大鼠的感覺、運動和協(xié)調功能,從而有效改善缺血型腦中風大鼠的神經(jīng)功能。

本研究在對于腦缺血模型大鼠的針刺治療中遵循了中醫(yī)學傳統(tǒng)理論,并結合現(xiàn)代臨床研究,采用活血化瘀、醒腦開竅的治法,取頭部百會穴(透曲鬢穴)及風池穴,此法在頭部貫穿督脈、膀胱經(jīng)、膽經(jīng)3條陽經(jīng),可通發(fā)陽氣,從而達到疏通經(jīng)絡、行散瘀血的作用。針刺首先對還未凋亡的神經(jīng)細胞和未受累及的正常神經(jīng)細胞進行雙向刺激,以此來抑制細胞凋亡,促進細胞活性;其次,針刺還能改善局部血液循環(huán),提高缺血區(qū)神經(jīng)細胞的興奮性,這進一步加強了腦代償功能,使神經(jīng)細胞功能迅速得到改善和保護[7-9]。

PTEN陽性表達產(chǎn)物具有磷酸酶活性[3],其在神經(jīng)系統(tǒng)中廣泛存在,尤其在大腦皮質、杏仁核、尾殼核、小腦、海馬的表達較強[10]。腦缺血后,缺血部位細胞內滲透迅速升高,嚴重打破細胞內外離子平衡,使細胞水腫、壞死、凋亡,嚴重情況可直接導致細胞破裂。由此凋亡的細胞破裂后,向周圍細胞釋放化學信號,使PTEN迅速升高表達[11],并調節(jié)PI3K/AKT信號傳導通路,通過減少磷脂酰肌醇三磷酸(PIP3),抑制細胞增殖,從而導致細胞凋亡[12-15]。

本實驗結果表明,缺血腦組織中PTEN蛋白和基因呈高表達,不同針刺介入時機治療后,PTEN蛋白和基因表達均有不同程度的降低,其中以C組變化最為明顯。神經(jīng)元死亡形式主要有壞死和凋亡兩種,下調PTEN可阻斷鈣離子內流[16],減少鈣離子超載引起的神經(jīng)元延遲性壞死,同時平衡細胞內外離子水平,改善能量代謝,抑制缺血半暗帶神經(jīng)元的凋亡[1]。筆者推測針刺對缺血性中風大鼠腦損傷的保護機制可能是通過誘導PTEN基因表達下調,從而激活PI3K/Akt信號通路,使p-AKT蛋白表達增加,抑制神經(jīng)細胞的凋亡,發(fā)揮其神經(jīng)保護作用[17]。

近年來相關研究表明,PI3K/AKT信號轉導通路作為促進細胞生存關鍵信號通路已經(jīng)得到廣泛的證實,對維持細胞生存和抑制細胞凋亡中起關鍵作用[3]。PI3K/AKT途徑的負性調控主要受具有雙重功能的類脂磷酸酶PTEN的調控,存在p-AKT參與促進神經(jīng)干細胞的增殖的生理活動,尤其在組織缺血和缺氧的條件下,p-AKT的作用則更為重要[18-20]。本實驗結果表明,不同時間點腦缺血模型組p-AKT蛋白和基因表達明顯降低,不同針刺介入治療后較腦缺血組明顯增加,且神經(jīng)功能缺損減輕,腦組織病理損害減小,其中以C組最為明顯。不同針刺介入時機是通過PI3K/AKT通路的激活并增加磷酸化AKT的水平發(fā)揮保護神經(jīng)作用。

GSK-3是一種多功能的絲/蘇氨酸蛋白激酶,包括GSK-3a和GSK-3b兩種亞型,其中GSK-3b與細胞凋亡關系最為密切。研究發(fā)現(xiàn),應用GSK-3b抑制劑可以保護腦缺血中神經(jīng)細胞,減少腦梗死體積并且改善神經(jīng)功能缺失。磷酸化的GSK-3b能夠抑制GSK-3b的活性,參與神經(jīng)細胞的保護。有研究報道,缺氧預處理可以通過增加p-AKT的表達而增加p-GSK3b的表達,從而對缺氧損傷的神經(jīng)元起到保護作用[21]。本實驗中B組p-GSK3b蛋白和基因的表達明顯降低;不同針刺介入時機治療后能明顯增加p-GSK3b蛋白和基因的表達,其中以C組最為明顯。針刺抑制GSK-3b活性可能通過提高體內Mg2+濃度直接抑制GSK-3b的活性,同時通過增加AKT的磷酸化間接減少GSK-3b活性。

綜上所述,針刺能抑制缺血性中風大鼠PTEN蛋白和基因的表達,增強PI3K/AKT/GSK3b信號通路的轉導,這可以改善其缺血組織的能量代謝,調控凋亡相關蛋白表達,從而起到對腦缺血神經(jīng)元損傷的修復、再生和保護作用。而且造模后2 h針刺介入的效果明顯優(yōu)于72 h和168 h,故筆者推測針刺介入時機越早,對腦缺血神經(jīng)元損傷的修復、再生和保護作用越明顯。但由于實驗條件和經(jīng)驗限制,故尚不足以證明此推測成立。望廣大學者繼續(xù)努力研究,尋找出最佳時機。

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Effect of Acupuncture Intervention Time on PTEN, p-AKT and p-GSK3bin Brain Tissues of Rats with Ischemic Stroke

1,-2.

1.,,150040,; 2.,150040,

To investigate the effects of different intervention times on phosphatase and tensin homology deleted on chromosome 10 (PTEN), phosphorylated protein kinase B (p-AKT) and glycogen synthase kinase-3b(p-GSK3b) in brain tissue of rats with ischemic stroke.Two hundred adult male Sprague-Dawley (SD) rats were randomized to group A (sham operation group ), group B (model group), group C (group of acupuncture at 2 h after modeling), group D (group of acupuncture at 72 h after modeling) and group E (group of acupuncture at 168 h after modeling), with 40 rats in each group. Except group A, the rats of all the other groups were prepared into permanent focal cerebral ischemia model by suture-occluded method. Respectively, 1, 3, 7 and 14 days after surgery, Garcia composite score method was used to evaluate the neural function of the rats. Transcription of PTEN, p-AKT and p-GSK3bgene and the expression of their proteins in brain tissues of rats were examined by Western blotting and reverse transcription-polymerase chain reaction (RT-PCR) method.Compared with group B, Garcia composite score increased significantly (＜0.01) at different time points (1, 3, 7 and 14 days after surgery) in group C and group E. Garcia composite score at different time points (7 and 14 days after surgery) in group D were significantly different from that in group C (＜0.05). Garcia composite score at different time points (3, 7 and 14 days after surgery) in group E were significantly different from that in group C (＜0.05). The expressions of PTEN, p-AKT and p-GSK3bproteins and the expression of PTEN mRNA, p-AKT mRNA and p-GSK3bmRNA at different time points (1, 3, 7 and 14 days after surgery) in group B were significantly different from those in group A and group C (＜0.01,＜0.05). The expressions of PTEN, p-AKT and p-GSK3bproteins at different time points (3, 7 and 14 days after surgery) in group D and group E were significantly different from those in group C (＜0.01,＜0.05). The expressions of PTEN mRNA, p-AKT mRNA and p-GSK3bmRNA at different time points (1, 3, 7 and 14 days after surgery) in group D and group E were significantly different from those in group C (＜0.01,＜0.05).Acupuncture can significantlydown-regulate the expression of PTEN in the neurons of ischemic brain tissues, and significantly increase the expressions of p-AKT and p-GSK3b, through which it can suppress neural cell apoptosis, protect and repair the damaged neurons. The sooner the intervention of acupuncture, the better the treatment effect.

Acupuncture; Cerebral infarction; Intervention time; Stroke; Phosphatase and tensin homology deleted on chromosome 10; Phosphorylated Protein Kinase B; Glycogen synthase kinase-3b; Rats

1005-0957(2018)09-1068-08

R2-03

A

10.13460/j.issn.1005-0957.2018.09.1068

2018-04-18

黑龍江省自然科學基金項目(H2016061);黑龍江省博士后資助項目(LBH-Z11011)

劉勇(1975—),女,副主任醫(yī)師,博士,Email:24680190@qq.com