針刺對(duì)甲基苯丙胺暴露雌性大鼠生殖發(fā)育的影響

李明哲,徐平,陳永生,韓清,徐鳴曙,張英杰,單春雷

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針刺對(duì)甲基苯丙胺暴露雌性大鼠生殖發(fā)育的影響

李明哲1,2,徐平2,陳永生3,韓清4,徐鳴曙1,張英杰1,單春雷2

(1.上海市針灸經(jīng)絡(luò)研究所,上海 200030;2.上海中醫(yī)藥大學(xué),上海 201203;3.上海市公安局物證鑒定中心,上海 200439;4.復(fù)旦大學(xué)附屬金山醫(yī)院,上海 201508)

建立甲基苯丙胺(MA)染毒雌性大鼠模型,動(dòng)態(tài)觀察針刺干預(yù)對(duì)不同發(fā)育期雌性大鼠生殖發(fā)育的影響。60只雌性SD大鼠隨機(jī)分為7周齡針刺組(7WA組)、7周齡不治療組(7W組)、9周齡針刺組(9WA組)、9周齡不治療組(9W組)和正常對(duì)照組(N組),每組12只。以2.5 mg/kg的MA制備MA染毒大鼠模型。觀察肛殖距,卵巢、子宮重量和系數(shù),血清激素水平變化。7W組與N組、7WA組比較,肛殖距明顯縮短,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(＜0.01)。7W組血清LH水平與N組、7WA組比較,9W組與7WA組比較,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(＜0.05)。7W組血清FSH水平與N組、7WA組、9WA組及9W組比較,9W組與N組、7W組比較,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(＜0.05)。針刺干預(yù)可增加雌性MA染毒大鼠的肛殖距;提高其血清FSH、LH水平,可能對(duì)雌性大鼠MA暴露所致生殖發(fā)育功能有促進(jìn)作用。

針刺療法;電針;甲基苯丙胺;肛殖距;卵泡刺激素;黃體生成素;物質(zhì)相關(guān)紊亂;大鼠

甲基苯丙胺(methamphetamine, MA),俗稱冰毒,屬于苯丙胺類興奮劑(amphetamine type stimulus, ATS)的一種,是目前全球?yàn)E用最為猖獗的毒品之一,嚴(yán)重危害社會(huì)的健康發(fā)展。MA具有強(qiáng)大的神經(jīng)興奮作用,可以導(dǎo)致心癮,控制和認(rèn)知能力降低,還能引起月經(jīng)紊亂、停經(jīng),性功能減退,導(dǎo)致生殖內(nèi)分泌功能紊亂,婦科疾病發(fā)病率增高等,嚴(yán)重危害女性的生殖健康,甚至累及其子代。

女性對(duì)苯丙胺較男性有更強(qiáng)的易感性,并且濫用呈低齡化趨勢(shì)。相對(duì)男性,成癮女性處于不同月經(jīng)周期對(duì)可卡因或苯丙胺產(chǎn)生不同的主觀效應(yīng)[1],表現(xiàn)為經(jīng)量減少,甚至閉經(jīng),其紊亂程度與吸毒、多藥濫用的持續(xù)時(shí)間及藥量成正相關(guān)[2];吸毒對(duì)女性月經(jīng)周期的影響是可逆的,但月經(jīng)復(fù)來后經(jīng)量增多及痛經(jīng)發(fā)生的例數(shù)增多[3]。濫用甲基苯丙胺后55%的依賴者出現(xiàn)月經(jīng)改變,其中37%出現(xiàn)明顯月經(jīng)紊亂。激素紊亂類型與患者年齡、濫用時(shí)間及強(qiáng)戒隔離時(shí)間等存在明確聯(lián)系[4]。此外,如果整個(gè)孕期持續(xù)濫用,其子代所有的發(fā)育階段都會(huì)有明顯的延遲[5],尤其是當(dāng)劑量達(dá)到2.5 mg/kg時(shí),其子代中雄性的生殖器的距離會(huì)顯著縮短,無論雌性還是雄性的毛發(fā)出現(xiàn)和睜眼時(shí)間都會(huì)明顯縮短[6]。

目前,國內(nèi)外對(duì)MA濫用的治療方法很少,尚無批準(zhǔn)的治療藥物[7]。本課題組曾關(guān)注其影響學(xué)習(xí)、記憶及睡眠,采取針刺治療,療效顯著[8-9]。而對(duì)其導(dǎo)致生殖及內(nèi)分泌紊亂的治療,尚無文獻(xiàn)報(bào)道。故本文用針刺干預(yù)治療MA依賴所致大鼠生殖及內(nèi)分泌系統(tǒng)紊亂,以期為今后的臨床研究提供一定的依據(jù)和參考。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與分組

6周齡狀態(tài)良好、發(fā)育正常的健康清潔級(jí)SD大鼠60只,雌性,體重150～170 g,由上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限責(zé)任公司提供,飼養(yǎng)于上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬岳陽中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院動(dòng)物房,許可證號(hào)為SYXK(滬)2013 -0109。飼養(yǎng)環(huán)境為晝夜12 h交替,室內(nèi)溫度25℃,濕度50%～60%,食物和水自由攝取。實(shí)驗(yàn)過程對(duì)大鼠的各種干預(yù)手段均按照科技部2006年頒布的《關(guān)于善待實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的指導(dǎo)性意見》。動(dòng)物適應(yīng)環(huán)境1周后,將所有雌性大鼠采用隨機(jī)數(shù)字表進(jìn)行隨機(jī)分組。分為7周齡針刺組(7WA組)、7周齡不治療組(7W組)、9周齡針刺組(9WA組)、9周齡不治療組(9W組)和正常對(duì)照組(N組),每組12只。

1.2 模型制備

參照相關(guān)文獻(xiàn)[10]制備MA染毒大鼠模型。MA由上海市公安局物證鑒定中心提供,純度為98%,用0.9% NaCl溶解使用。給予MA染毒大鼠組腹腔注射MA (2.5 mg/kg),即按當(dāng)日體重的0.25%給予。7WA組和7W組從7周齡第1天開始;9WA組和9W組從9周齡第1天開始,每日1次,連續(xù)注射7天,末次注射后30 min開始觀察大鼠活動(dòng)情況,并記錄相關(guān)行為變化。所有染毒大鼠參照Sams-Dodd評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)對(duì)大鼠的刻板行為進(jìn)行評(píng)價(jià)[11],靜止,幾乎或根本沒有活動(dòng)為0分;正常活動(dòng),偶而有向前運(yùn)動(dòng)為1分;有活動(dòng)伴隨并反復(fù)向前探索為2分;持續(xù)向前探索為3分;反復(fù)抬頭、搖頭或旋轉(zhuǎn)為4分;迅速搖頭、旋轉(zhuǎn)或帶搖頭的背腹運(yùn)動(dòng)為5分。每10 min評(píng)分1次,記錄刻板行為持續(xù)時(shí)間,以刻板行為評(píng)價(jià)≥2分,持續(xù)時(shí)間≥15 min為造模成功。

1.3 治療方法

1.3.1 N組

不進(jìn)行抓取,沒有注射及干預(yù)。

1.3.2 7WA組和9WA組

造模后11周齡時(shí)根據(jù)《實(shí)驗(yàn)針灸學(xué)》[12]取足三里、三陰交、關(guān)元,采用0.30 mm×25 mm一次性使用無菌針灸針進(jìn)行針刺。關(guān)元針刺深度約0.5 cm,足三里、三陰交進(jìn)針深度約0.3 cm,進(jìn)針后小幅度捻轉(zhuǎn)。進(jìn)針得氣后,雙側(cè)足三里接通G6805-Ⅱ低頻電子脈沖治療儀(上海醫(yī)用電子儀器廠生產(chǎn)),連續(xù)脈沖波,刺激頻率2 Hz,電流范圍在10～30 mA之間,20 min。針刺治療時(shí)動(dòng)物處于相對(duì)自由狀態(tài),不進(jìn)行麻醉,治療者以手固定大鼠,使大鼠配合針刺,若針刺時(shí)針具脫落,則需再次針刺穴位,使針刺時(shí)間達(dá)到20 min。每周連續(xù)治療5 d,休息2 d,共治療10次,10次為1個(gè)療程。

1.3.3 7W組和9W組

只建立了染毒模型,沒有采用任何干預(yù)手段。

1.4 取材

為了保持各組間取材及數(shù)據(jù)的一致性,所有大鼠均在15周齡第1天時(shí)稱重,模型組大鼠腹腔注射MA(2.5 mg/kg)以染毒,染毒2 h后麻醉(10%的水合氯醛,4 mL/kg),N組直接麻醉,麻醉后取大鼠股動(dòng)脈血5 mL。但由于9WA組是第一批染毒并且麻醉處死的,所以注射水合氯醛麻醉時(shí)意外死亡1只大鼠,因無法取到足量的動(dòng)脈血,故舍棄該只大鼠的所有數(shù)據(jù)?？紤]到可能是由于MA與水合氯醛同用的聯(lián)合反應(yīng),所以其他模型組采用2.5 mL/kg的劑量進(jìn)行麻醉,無其他意外產(chǎn)生,N組大鼠仍然以4 mL/kg劑量進(jìn)行麻醉。取血后分離子宮及卵巢,剔除子宮及卵巢內(nèi)的多余脂肪。

1.5 觀察指標(biāo)

1.5.1 大鼠體重

對(duì)11周齡和15周齡的大鼠稱重,觀察各組MA染毒后體重變化。

1.5.2 肛殖距

在處死實(shí)驗(yàn)動(dòng)物前用游標(biāo)卡尺(日本三豐Mitutoyo,530-512)測(cè)量各組的肛殖距。

1.5.3 子宮、卵巢重量和系數(shù)

取材后稱取子宮濕重、卵巢重量,并計(jì)算子宮、卵巢的臟器系數(shù)(臟器系數(shù)=臟器重量/體重×1000‰)。

1.5.4 血清激素檢測(cè)

處死前取大鼠股動(dòng)脈血5 mL,室溫靜置1～2 h后臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)(德國Eppendorf公司)離心,取上清液,于﹣80℃保存?zhèn)溆?。檢測(cè)前恢復(fù)至室溫,采用酶聯(lián)免疫吸附法檢測(cè)血清LH、FSH含量,采用相關(guān)試劑盒(上海源葉生物科技有限公司),具體操作方法嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行,統(tǒng)計(jì)數(shù)值為測(cè)試濃度×5倍。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

應(yīng)用SPSS24.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料符合正態(tài)分布以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示,采用方差分析和檢驗(yàn),不符合正態(tài)分布采用秩和檢驗(yàn)。以＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 一般情況

實(shí)驗(yàn)期間,各組動(dòng)物飲食、活動(dòng)均正常,生長狀況良好。每次染毒后模型組大鼠均會(huì)出現(xiàn)刻板行為,表現(xiàn)為持續(xù)向前探索;反復(fù)抬頭、搖頭或旋轉(zhuǎn)及迅速搖頭、旋轉(zhuǎn)或帶搖頭的背腹運(yùn)動(dòng)。按照Sams-Dodd評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)均＞3分,持續(xù)時(shí)間＞2 h(每次只觀察到染毒后2 h)。

2.2 各組大鼠MA染毒后體重變化比較

連續(xù)染毒7 d后,大鼠各組體重均隨時(shí)間延長而增長,組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(＞0.05)。詳見表1。

表1 各組大鼠MA染毒后體重變化比較 (±s,g)

2.3 各組大鼠治療后肛殖距比較

7W組與N組比較,肛殖距縮短明顯,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(＜0.01);7W組與7WA組比較,肛殖距縮短明顯,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(＜0.01)。

表2 各組大鼠治療后肛殖距比較 (±s,mm)

注:與7W組比較1)＜0.01

2.4 各組治療后卵巢、子宮重量和系數(shù)比較

各組治療后卵巢、子宮重量和系數(shù)比較,差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(＞0.05)。詳見表3。

表3 各組治療后卵巢、子宮重量和系數(shù)比較 (±s)

2.5 各組治療后血清激素比較

7W組血清LH水平與N組、7WA組比較,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(＜0.05);9W組血清LH水平與7WA組比較,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(＜0.05);7W組血清FSH水平與N組、7WA組、9WA組及9W組比較,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(＜0.05);9W組血清FSH水平與N組、7W組比較,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(＜0.05)。詳見表4。

表4 各組治療后血清激素比較 (±s, mIU/mL)

注:與7W組比較1)＜0.05;與9W組比較2)＜0.05

3 討論

近年來,MA濫用問題越來越嚴(yán)峻,女性的濫用問題也越來越突出,其濫用人群為21～35歲的年輕女性[13];60.5%的女性濫用者在年齡小于18歲時(shí)開始濫用[14]。雌性大鼠的青春期為出生后第34～38 d,所以一般針對(duì)青春期的研究往往選擇6周齡的大鼠[15],為了更接近女性MA的真實(shí)濫用情況,本研究選擇建立7周齡(青春期,即性成熟期)及9周齡(生育期,即體成熟期)MA染毒大鼠模型。

成癮性藥物可使女性雌激素及孕激素長期處于低水平,從而導(dǎo)致下丘腦-垂體-性腺軸功能紊亂。女性對(duì)MA的敏感性與雌激素分泌相關(guān),雌激素水平較高時(shí),女性對(duì)MA更敏感。女性藥物濫用的后果還涉及到子女,影響圍產(chǎn)兒預(yù)后,早產(chǎn)、低體重兒、新生兒的發(fā)生率也與吸毒時(shí)間密切相關(guān)[16]。研究顯示,100620例產(chǎn)婦中有0.5%的是毒品依賴者,其中3.9%是MA依賴者[17];雌性大鼠在孕期皮下注射MA,其子代肛殖距和體長較其他組明顯縮短(＜0.01)[18]。

針刺可刺激經(jīng)絡(luò),調(diào)節(jié)下丘腦-垂體-性腺軸,提高血清中雌二醇(E2)、孕激素(P)、FSH、LH,改善排卵功能,從而促使紊亂的生殖及內(nèi)分泌功能恢復(fù)正常[19-22]。研究顯示,深刺組與淺刺組均能降低LH水平,且深刺組下降幅度較淺刺組大,與安慰針組比較,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(＜0.05)[23]。針刺治療女性內(nèi)分泌紊亂歷史悠久,療效顯著,如張桂芝等[24]研究發(fā)現(xiàn)針刺治療126例海洛因依賴閉經(jīng)的患者療效顯著,針刺的療效與吸毒和閉經(jīng)時(shí)間顯著相關(guān),閉經(jīng)時(shí)間越長,療效越差;但對(duì)吸毒時(shí)間長者,針刺療效卻很顯著。吳鎏楨等[25]發(fā)現(xiàn)跨皮膚電刺激可促使海洛因成癮者性機(jī)能恢復(fù),血清性激素LH和T水平顯著上升,減輕海洛因依賴者的戒斷癥狀,調(diào)節(jié)性機(jī)能。本研究選用足三里、三陰交和關(guān)元三穴,其中足三里為足陽明胃經(jīng)合穴,胃的下合穴,具有溫補(bǔ)脾胃、益氣養(yǎng)血、扶正培元的功效;三陰交為肝腎脾三陰經(jīng)的交會(huì)穴,可調(diào)理肝脾腎三臟、理氣活血、濡養(yǎng)胞宮;關(guān)元穴是任脈與足太陰脾經(jīng)、足厥陰肝經(jīng)、足少陰腎經(jīng)的交會(huì)穴,任脈起于胞中,主胞胎,可培腎固本、健脾、調(diào)理沖任。三穴同用能增強(qiáng)補(bǔ)腎、健脾、調(diào)沖任作用,調(diào)整機(jī)體陰陽氣血平衡,使腎-天癸-沖任-胞宮軸功能正常運(yùn)行,以恢復(fù)正常的生殖發(fā)育功能。

本研究顯示,雌性大鼠MA暴露對(duì)其生殖內(nèi)分泌系統(tǒng)產(chǎn)生一定的影響。7W組與N組比較,肛殖距縮短明顯,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(＜0.01)。7W組血清LH水平與N組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(＜0.05)。7W組血清FSH水平與N組、9W組比較,9W組與N組比較,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(＜0.05)。針刺治療對(duì)其紊亂的生殖內(nèi)分泌功能有調(diào)節(jié)和改善的作用。7WA組與7W組比較,肛殖距增長明顯,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(＜0.01)。7WA組與7W組、9W組比較,血清LH水平明顯升高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(＜0.05)。7WA組與7W組比較,血清FSH水平明顯升高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(＜0.05)。

綜上所述,針刺干預(yù)可增加雌性MA染毒大鼠的肛殖距;提高其血清FSH、LH水平,可能對(duì)雌性大鼠MA暴露所致生殖發(fā)育功能有促進(jìn)作用。但由于本研究樣本量較小,檢測(cè)指標(biāo)較少,不能充分闡明MA暴露對(duì)雌性大鼠生殖內(nèi)分泌紊亂的作用機(jī)制及針刺的干預(yù)作用,但值得后續(xù)進(jìn)一步采用大樣本、多維度的相關(guān)基礎(chǔ)研究。

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Effect of Acupuncture on the Reproductive Development in Methamphetamine-exposed Female Rats

-1,2,2,-3,4,-1,-1,-2.

1.,200030,; 2.,201203,; 3.,200439,; 4.,201508,

By establishing methamphetamine (MA)-addicted female rat model, to dynamically observe the effect of acupuncture on the reproductive development of the female rats in different developmental stages.Sixty female Sprague-Dawley (SD) rats were randomized into a 7-week acupuncture group (7WAG), a 7-week non-treatment group (7WG), a 9-week acupuncture group (9WAG), a 9-week non-treatment group (9WG) and a normal control group (NG), with 12 rats in each group. The MA-addicted rat model was established by administration of MA at 2.5 mg/kg. The anogenital distance, weights of ovaries and uterus and the ratio, as well as changes in serum hormones were observed.Compared with the NG and the 7WAG, the anogenital distance in the 7WG was significantly shorter (＜0.01). In comparing the level of serum luteinizing hormone (LH), the 7WG was significantly different from the NG and the 7WAG, and the difference between the 9WG and the 7WAG was also statistically significant (＜0.05). In comparing the level of serum follicle-stimulating hormone (FSH), the 7WG was significantly different from the NG, 7WAG, 9WAG and 9WG, and the 9WG was significantly different from the NG and the 7WG (＜0.05).Acupuncture can increase the anogenital distance of MA-addicted female rats and their serum levels of FSH and LH. It may promote the reproductive development of MA-exposed female rats.

Acupuncture therapy; Electroacupuncture; Methamphetamine; Anogenital distance; FSH; LH; Substance-related disorders; Rats

1005-0957(2018)09-1063-05

R2-03

A

10.13460/j.issn.1005-0957.2018.09.1063

2018-01-29

上海市衛(wèi)生與計(jì)劃生育委員會(huì)項(xiàng)目(20144y0159)

李明哲(1985—),女,助理研究員,碩士,Email:xiaoming308@163.com

徐鳴曙(1978—),男,副研究員,碩士生導(dǎo)師,博士,Email:mingshuxu@163.com