超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定奶粉和液體奶中的壬基酚

◎ 方 玲

（上海天祥質(zhì)量技術(shù)服務(wù)有限公司，上海 200233）

壬基酚（NP）是一種公認(rèn)的環(huán)境激素，具有雌激素類(lèi)特性和生物毒性，其對(duì)生物體的不良作用包括對(duì)內(nèi)分泌系統(tǒng)、生殖系統(tǒng)和免疫系統(tǒng)的影響以及致癌作用等[1-2]。而調(diào)查發(fā)現(xiàn)，壬基酚大量存在于嬰幼兒配方奶粉中，對(duì)于主要食用配方奶粉的嬰幼兒來(lái)說(shuō)有著極高的安全風(fēng)險(xiǎn)，壬基酚在剛開(kāi)始發(fā)育的嬰幼兒身上作用將更加明顯，可能對(duì)嬰幼兒的內(nèi)分泌系統(tǒng)造成不可逆轉(zhuǎn)的影響，使得嬰幼兒性發(fā)育速度過(guò)快，免疫能力差[3]。近年來(lái)，國(guó)家對(duì)嬰兒配方食品安全監(jiān)管日趨嚴(yán)格，除了定期對(duì)日常營(yíng)養(yǎng)指標(biāo)有抽檢外，一些嬰兒配方食品中可能存在的有毒及環(huán)境污染物質(zhì)也列入風(fēng)險(xiǎn)監(jiān)測(cè)，其中就包括近年人們?cè)絹?lái)越視和關(guān)注的壬基酚[4]。

目前，測(cè)定壬基酚殘留的文獻(xiàn)比較多，方法主要是氣相-氣質(zhì)聯(lián)用法[5]和液相-質(zhì)譜聯(lián)用法[6-8]等。本研究建立了另外一種超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜（UPLCMS/MS）測(cè)定奶粉和液態(tài)奶中壬基酚的分析方法。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

試驗(yàn)用水，超純水；甲醇（色譜純）和乙腈（色譜純），德國(guó)默克公司；乙酸乙酯（色譜純）、環(huán)己烷（色譜純），美國(guó)Fisher 公司；壬基酚標(biāo)準(zhǔn)品及同位素內(nèi)標(biāo)（純度＞99%），Dr. Ehrenstorfer GmbH，上海安譜公司代購(gòu)。

1.2 主要儀器與設(shè)備

超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀，美國(guó)Waters 公司TQS；分析天平，梅特勒-托利多；移液槍?zhuān)琓hermo；超聲儀，上?？茖?dǎo)超聲儀器有限公司；凍干機(jī)，北京博醫(yī)康實(shí)驗(yàn)儀器有限公司；超低溫冰箱（-80 ℃），Thermo；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，BUCHI Labortechnik AG。

1.3 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

1.3.1 壬基酚標(biāo)準(zhǔn)中間液

準(zhǔn)確移取1 000 μg/mL的壬基酚標(biāo)準(zhǔn)品100 μL于10 mL容量瓶中，用乙腈稀釋并定容至刻度。該標(biāo)準(zhǔn)中間液的濃度為10 μg/mL，再移取100 μL于10 mL容量瓶中，用乙腈稀釋并定容至刻度。該標(biāo)準(zhǔn)中間液的濃度為100 ng/mL。置于1～4 ℃冰箱保存，可保存6個(gè)月。

1.3.2 壬基酚內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)中間液

準(zhǔn)確稱(chēng)取1 mg的壬基酚標(biāo)準(zhǔn)品于10 mL容量瓶中，用乙腈溶解并稀釋定容至刻度。該標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液的濃度為100 μg/mL。再準(zhǔn)確移取100 μL的上述儲(chǔ)備液于10 mL容量瓶中，用乙腈溶解并稀釋定容至刻度。該標(biāo)準(zhǔn)中間液的濃度為1 μg/mL。再準(zhǔn)確移取1 mL該儲(chǔ)備液于10 mL容量瓶中，用乙腈溶解并稀釋定容至刻度，該標(biāo)準(zhǔn)中間液的濃度為100 ng/mL。置于1～4 ℃冰箱保存，可保存6個(gè)月。用移液槍準(zhǔn)確吸取上述標(biāo)準(zhǔn)貯備液適量，用乙腈稀釋?zhuān)渲瞥梢幌盗袠?biāo)準(zhǔn)工作溶液，質(zhì)量濃度范圍為0.5、1、2、5、10 ng/mL。

1.4 樣品處理

稱(chēng)取奶粉樣品2 g到25 mL玻璃比色管中，用移液槍準(zhǔn)確加入壬基酚內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)中間液（100 ng/mL）100 uL，再用移液槍準(zhǔn)確移取10 mL環(huán)己烷∶乙酸乙酯=1∶1于玻璃比色管中，渦旋混勻1 min后超聲20 min，靜置2 h，取上清液5 mL待GPC凈化。

GPC流動(dòng)相為環(huán)己烷∶乙酸乙酯=1∶1，流速為5 mL/min，收集8～20 min流出的溶液于100 mL雞心瓶中，在40 ℃下，80 r/min旋蒸至近干，用1 mL乙腈復(fù)溶后，上機(jī)檢測(cè)分析。

牛奶試樣用-80 ℃冰箱預(yù)凍3～4 h后，放置于凍干機(jī)中，冷凍干燥至干，再按照上述奶粉樣品前處理方法進(jìn)行處理。

所有用到的玻璃器皿均用環(huán)己烷∶乙酸乙酯=1∶1清洗兩遍，且須在臨使用前準(zhǔn)備。

由于環(huán)境中普遍存在壬基酚，因此GPC凈化后的溶液須盡快旋蒸處理，避免放置時(shí)間過(guò)長(zhǎng)。整個(gè)實(shí)驗(yàn)用的試劑均須現(xiàn)配現(xiàn)用，處理后的試樣須盡快上機(jī)分析。

1.5 儀器分析條件

1.5.1 液相色譜條件

色譜柱，Waters Xbridge BEH C18100 mm×2.1 mm，1.7 μm；流動(dòng)相，A相為水，B相為甲醇；流速，0.3 mL/min；進(jìn)樣量，5 μL；柱溫，40 ℃。梯度洗脫條件，見(jiàn)表1。

表1 流動(dòng)相及梯度洗脫條件表

1.5.2 質(zhì)譜條件

電噴霧離子源（ESI）；負(fù)離子掃描模式；多反應(yīng)監(jiān)測(cè)（MRM）模式；源溫度350 ℃；毛細(xì)管電壓3.0 kV；脫溶劑氣溫度350 ℃；脫溶劑氣流量800 L/h，具體的離子采集參數(shù)，見(jiàn)表2。

表2 壬基酚質(zhì)譜采集參數(shù)表

2 方法驗(yàn)證

2.1 方法線(xiàn)性范圍與檢出限

在上述試驗(yàn)條件下，配制NP的質(zhì)量濃度0.5～10 μg/kg的系列標(biāo)準(zhǔn)工作液，內(nèi)標(biāo)濃度為5 μg/kg，將NP的定量離子的峰面積與內(nèi)標(biāo)的定量離子峰面積比對(duì)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，線(xiàn)性關(guān)系和相關(guān)系數(shù)見(jiàn)表3。以加標(biāo)樣品中NP色譜峰的信噪比S/N=3對(duì)應(yīng)的濃度為方法的檢出限（LOD），其檢出限為 1μg/kg，以加標(biāo)樣品中NP色譜峰的信噪比S/N=10對(duì)應(yīng)的濃度為方法的定量限，其定量限為 3μg/kg，靈敏度能夠滿(mǎn)足食品檢測(cè)的要求。

表3 NP的線(xiàn)性范圍、相關(guān)系數(shù)及檢出限、定量限表

2.2 方法回收率及精密度

在奶粉中添加20 μL濃度為100 ng/mL的壬基酚標(biāo)準(zhǔn)中間液，做10平行，按上述試驗(yàn)條件進(jìn)行處理和測(cè)定，內(nèi)標(biāo)法計(jì)算NP的回收率和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）。由表4可知，加標(biāo)回收率為80%～95%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差＜10%，由此可見(jiàn)此方法回收率和精密度良好。樣品加標(biāo)的離子色譜圖如圖1所示。

表4 奶粉中NP的加標(biāo)回收率與相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差表

圖1 樣品加標(biāo)的離子色譜圖

3 結(jié)論

本文該法建立了超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜（UPLC-MS/MS）測(cè)定奶粉和液態(tài)奶中壬基酚的分析方法，檢出限為1 μg/kg，可以滿(mǎn)足配方奶粉及液態(tài)原料乳中壬基酚殘留量的需求，可以作為企業(yè)判斷是否有壬基酚污染的手段之一。由于壬基酚對(duì)嬰幼兒的發(fā)育有很?chē)?yán)重的危害，由此相關(guān)部門(mén)對(duì)污染源展開(kāi)了調(diào)查，結(jié)果顯示，嬰幼兒配方乳粉當(dāng)中主要的壬基酚成分來(lái)自于奶粉的外包裝、加工過(guò)程以及原料，需加強(qiáng)對(duì)原料、包裝材料以及生成過(guò)程中的接觸材料中壬基酚含量的檢測(cè)及控制，不使用含有壬基酚成分的容器中和管道，通過(guò)更換不銹鋼材質(zhì)的管道、容器及采用馬口鐵包裝從源頭上控制污染[3，9]。