基于QuEchERS-GC/MS法測定母乳的咖啡因殘留量

◎ 趙璟悠，王 勇，舒翠霞，董 穎

（1.蘇州市公安局刑警支隊(duì)，江蘇 蘇州 215000；2.南京市公安局刑事科學(xué)技術(shù)研究所，江蘇 南京 210012；3.公安部物證鑒定中心，北京 100038）

母乳喂養(yǎng)是世界衛(wèi)生組織聯(lián)合國兒童基金會(huì)全力倡導(dǎo)的科學(xué)育兒方法，現(xiàn)今也越來越被廣大家庭重視和推崇[1]。因此，女性的哺乳期飲食也就成為育兒家庭普遍關(guān)注的重要主題，當(dāng)前對于哺乳媽媽是否能夠攝入咖啡、茶、巧克力等含有咖啡因的食物眾說紛紜?？Х纫颍–affeine，咖啡堿）屬于甲基黃嘌呤生物堿，具有中樞興奮作用，大劑量或長期食用可能導(dǎo)致失眠、激動(dòng)不安、心悸，甚至可引起驚厥[2]。而美國兒科學(xué)會(huì)（APP）及國際母乳協(xié)會(huì)則表示，每天攝入的咖啡因不超過300 mg并不會(huì)影響哺乳媽媽喂奶和寶寶健康[3]。

目前，母乳的檢測都是針對其營養(yǎng)成分，如蛋白質(zhì)、脂肪、乳糖、礦物質(zhì)，尚無對攝入咖啡因的檢測，并且也尚無標(biāo)準(zhǔn)檢測方法[4-6]。根據(jù)文獻(xiàn)，咖啡因檢測的方法主要有高效液相色譜法[7]、氣相色譜法、氣相色譜-質(zhì)譜法[8]、毛細(xì)管電泳法[9]、紫外分光光度法以及電化學(xué)分析方法[10]等，其中常用的方法為色譜或色譜-質(zhì)譜法。選擇合適的儀器方法能夠降低檢出限、提高靈敏度，而合適的前處理方法更直接關(guān)系分析的準(zhǔn)確性和可靠性[11-12]。母乳含有幾千種生物性流體，相較于體外食品樣本，基質(zhì)成分復(fù)雜且多樣[4]，若采用傳統(tǒng)的溶劑萃取法[6]則存在雜質(zhì)干擾、有機(jī)溶劑消耗多等不足；若采用生物檢材處理方法[13]，如固相萃取則存在操作繁瑣耗時(shí)、目標(biāo)物損失等不足。QuEChERS是近年來國際上最新發(fā)展起來的一種快速凈化技術(shù)[14]，具有回收率高、分析速度快、操作簡便、溶劑使用量少、污染小等優(yōu)點(diǎn)。本研究建立了QuEChERS凈化，GC/MS法測定母乳中咖啡因殘留量的方法，并應(yīng)用于實(shí)際母乳樣品的檢測，旨在為相關(guān)部門對母乳中的咖啡因做一步研究提供有益參考。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器、材料與試劑

①儀器；Aglient 7890A-5975C氣相色譜-質(zhì)譜儀，eppendorf 5430型高速離心機(jī)，SK-1型快速混勻器，電子天平，eppendorf移液槍，15 mL高速離心管，Horizon miVac自動(dòng)濃縮儀。

②材料與試劑；無水乙醇（色譜純，TEDIA）、無水甲醇（色譜純，TEDIA）、乙腈（色譜純，TEDIA）、無水MgSO4、PSA（德國 CNW）、咖啡因標(biāo)準(zhǔn)溶液（濃度為1 000 mg/L，購自北京芬格爾安科技有限公司）。

1.2 儀器工作條件

①色譜條件，HP-5 MS毛細(xì)管色譜柱（30 m×0.25 mm，0.25 μm）；進(jìn)樣口溫度，260 ℃；載氣為高純氦氣（純度不小于99.99%），流量1.2 mL/min；分流模式，分流比為20∶1；進(jìn)樣量1 μL。升溫程序：初始溫度70 ℃，保持1 min；以20 ℃/min速率升溫至180 ℃，保持2 min；以10 ℃/min速率升溫至275 ℃，保持20 min。②質(zhì)譜條件，電子轟擊離子源（EI），離子源溫度230 ℃；電子能量70 eV；電子倍增電壓1 600 V；質(zhì)量掃描，50～550 u；掃描方式，SCAN、SM；溶劑延遲3 min。

1.3 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

分別精密移取1 000 mg/L標(biāo)準(zhǔn)咖啡因溶液1、10、20、50、100、200 μL定容于 1 mL進(jìn)樣瓶中，用無水甲醇進(jìn)行稀釋，得到1、10、20、50、100、200 mg/L的咖啡因系列標(biāo)準(zhǔn)溶液。

1.4 樣品前處理

準(zhǔn)確移取1 mL母乳樣品置于15 mL離心管中，加入乙腈10 mL提取，同時(shí)添加無水MgSO4150 mg、PSA 50 mg凈化，振蕩、混勻10 min后置于高速離心機(jī)以6 000 r/min的轉(zhuǎn)速離心10 min，取上清液轉(zhuǎn)移至10 mL玻璃試管，待濃縮揮干后，無水乙醇定容100 μL，供GC-MS測定。

2 結(jié)果與討論

2.1 提取方式的選擇

對于不同咖啡因制品測定的前處理方法一般包括ISO 10095：1992試樣處理[15]、溶劑提取、超聲萃取、水浴浸提等方法。對上述方法進(jìn)行比較、優(yōu)化、改進(jìn)及篩選的相關(guān)研究表明，三氯甲烷超聲萃取法更為簡單快速且效果最佳[16]。對于痕量的咖啡因，本實(shí)驗(yàn)比較了三氯甲烷超聲萃取法和QuEChERS凈化法這兩種提取方式：①取1 mL空白母乳樣品中添加50 μg咖啡因，加入10 mL三氯甲烷，超聲10 min，渦旋后離心取清液，重復(fù)上述步驟后合并清液，揮干定容。②取1 mL空白母乳樣品中添加50 μg咖啡因，加入乙腈10 mL提取，同時(shí)添加無水MgSO4150 mg、PSA 50 mg凈化，振蕩10 min后離心取上清液，揮干定容。2種提取方式所提樣品咖啡因色譜圖，如圖1所示。

圖1 2種提取方式所提樣品咖啡因色譜圖

由圖1（a）可以看出：三氯甲烷超聲萃取法無法有效去除蛋白質(zhì)和油脂等雜質(zhì)，導(dǎo)致提取率不佳、雜峰干擾嚴(yán)重，咖啡因色譜峰不明顯，影響分析定性；圖1（b）中QuEchERS法適用于富含多種雜質(zhì)目標(biāo)物的提取，因而雜質(zhì)峰大大降低，目標(biāo)物回收率高；使用乙腈溶劑，提取液處于上層移取時(shí)也不容易引入雜質(zhì)。此外，該法還具有回收率高、操作簡單快速、溶劑使用量少的優(yōu)點(diǎn)，故本實(shí)驗(yàn)采用QuEchERS法對母乳樣品進(jìn)行前處理凈化，去除蛋白質(zhì)和油脂等雜質(zhì)。

2.2 凈化條件的選擇

通過乙腈沉淀固然能除去母乳中的蛋白質(zhì)，但對脂肪、水溶性、礦物質(zhì)和維生素等基質(zhì)的凈化效果不佳，而PSA對脂肪酸、有機(jī)酸、碳水化合物等極性雜質(zhì)卻有極好的吸附能力，MgSO4可通過吸水降低大部分水溶性雜質(zhì)在樣品提取液中的溶解度，達(dá)到進(jìn)一步凈化的目的。本實(shí)驗(yàn)對人工添加凈化和直接采用QuEchERS凈化管的不同方式做了比較：①電子天平稱取無水MgSO4150 mg和PSA 50 mg。 ② 凈 化 管 為PSA 50 mg、Carbon 50 mg和MgSO4150 mg。③凈化管為PSA 50 mg、C1850 mg和MgSO4150 mg。其中，C18能進(jìn)一步吸附除去少量脂肪等非極性雜質(zhì)，Carbon因具有較大的比表面積和較強(qiáng)的吸附力，可以吸附母乳的乳黃色減少有機(jī)物干擾，使得提取液澄清透明。與人工配比添加PSA 50 mg、MgSO4150 mg凈化處理相比，樣品經(jīng)過②凈化管和③凈化管處理后的色譜雜質(zhì)峰并無明顯的降低或減少。因此，兼顧經(jīng)濟(jì)適用性原則，選擇人工添加PSA和無水MgSO4足以滿足檢測需要。

2.3 線性范圍、檢出限和定量限

按實(shí)驗(yàn)1.3所示的咖啡因系列標(biāo)準(zhǔn)溶液，以咖啡因峰面積為縱坐標(biāo)（Y），以相應(yīng)的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（X）繪制曲線，在1～200 mg/L濃度范圍內(nèi)，咖啡因峰面積和母乳中添加的咖啡因濃度呈良好的線性關(guān)系，見表1。線性方程為Y=120 179X+185 717，相關(guān)系數(shù)r=0.999 4。采用標(biāo)準(zhǔn)添加法，以信噪比（S/N）為3，確定母乳中咖啡因的檢出限為1.25 ng/mL，以信噪比（S/N）為10，確定母乳中咖啡因的定量限為3.50 ng/mL。

表1 不同的咖啡因母乳添加濃度與對應(yīng)的峰面積表

2.4 方法回收率和精密度

選取陰性母乳樣品加入咖啡因系列標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)，加入10、50、200 mg/L 3個(gè)水平濃度標(biāo)準(zhǔn)溶液，分別平行操作6次，計(jì)算回收率在70.2%～84.7%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差在1.89%～3.01%，說明該方法測定母乳中的咖啡因可行。

2.5 實(shí)際樣品的檢測

對飲用咖啡飲品（星巴克拿鐵330 mL）的哺乳期女性采集樣本，分別采集攝入后1、2、4、8、12 h的母乳樣品，按照本文實(shí)驗(yàn)1.4的方法步驟進(jìn)行測定，測得的咖啡因含量分別為270.6、139.32、71.98、13.52、3.76 mg/L，如圖2所示。5份樣品提取的離子色譜圖如圖3所示。對于哺乳期女性食用含有咖啡因食品是否對嬰兒有影響，醫(yī)學(xué)上尚無權(quán)威性的理論科學(xué)依據(jù)，該方法可為咖啡因在母乳中的代謝變化的研究做初步探索。

圖2 個(gè)體母乳攝入的咖啡因代謝趨勢圖

圖3 攝入后不同時(shí)間陽性母乳的提取離子色譜圖

3 結(jié)語

本文著重探討對前處理方法的選擇，通過文獻(xiàn)參考和實(shí)驗(yàn)對比，確定QuEchERS是更為理想的前處理方法，從而建立了QuEchERS提取-氣相質(zhì)譜聯(lián)用儀（GC/MS）定性定量分析母乳中咖啡因的新方法。實(shí)驗(yàn)探討了提取和凈化條件，表明方法準(zhǔn)確靈敏、操作簡單，檢測限及回收率均符合要求，可為開展母乳中咖啡因的檢測提供有效的檢驗(yàn)方法。