黃金茶多糖結(jié)構(gòu)初探及除蛋白工藝研究

熊 磊，陳 慧，王 寧，劉 鑫，李祥格，吳國強，李景恩，王文君

(江西農(nóng)業(yè)大學(xué) 食品科學(xué)與工程學(xué)院/南昌市農(nóng)產(chǎn)品加工與質(zhì)量控制重點實驗室，江西 南昌 330045)

黃金茶是由柳葉蠟梅的嫩葉經(jīng)加工制作而得到的一種綠茶。柳葉蠟梅為半常綠灌木，多生長在浙江西部和江西東北一帶[1]。黃金茶含有多糖、黃酮、揮發(fā)油、生物堿類等多種有效活性成份[2]，而且富含鐵、鈣、鋅、鎂、硒等微量元素及VB1、VB2、VC等，并含有18種氨基酸[3]。黃金茶多糖是從黃金茶葉中提取出來的具有多種生物活性且結(jié)構(gòu)復(fù)雜的雜多糖或其復(fù)合物[4]。大量研究報告表明，多糖具有抗氧化、免疫調(diào)節(jié)、降血脂、降血糖、抗凝血等多種功效[5,9]。由于多糖在各個領(lǐng)域尤其是食品方面的廣泛應(yīng)用，有關(guān)多糖的開發(fā)利用與研究日益活躍。

目前，國內(nèi)外對黃金茶多糖的文獻(xiàn)報道較少，而黃金茶多糖又具有較高的生物活性[10]。本試驗通過紫外光譜(UV)、紅外光譜(FT-IR)、氣相色譜(GC)、掃描電鏡(SEM)等方法對其結(jié)構(gòu)進(jìn)行探究；同時對分離提取得到的黃金茶粗多糖進(jìn)行純化，而除蛋白是粗多糖純化過程中至關(guān)重要的環(huán)節(jié)。常用的除蛋白方法有Sevage法、蛋白酶水解法和酸類物質(zhì)沉淀法等[11-13]。利用Sevage法對黃金茶多糖除蛋白工藝的研究還未見報道，本試驗選取主要影響蛋白質(zhì)脫除效果的Sevage試劑添加量、振搖時間、氯仿與正丁醇體積比進(jìn)行單因素實驗，在此基礎(chǔ)上，設(shè)計L9(33)正交實驗，確定最佳除蛋白工藝條件[14]。旨在為了解黃金茶多糖特性，進(jìn)一步為黃金茶多糖的開發(fā)利用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

黃金茶葉，購于江西省玉山縣，粉碎機粉碎，過60目篩，在電熱恒溫干燥箱中60 ℃下干燥15 h后放于干燥器中備用；分析純葡萄糖(105 ℃干燥至恒質(zhì)量)；考馬斯亮藍(lán)g-250、石油醚、無水乙醇、乙醚、丙酮、苯酚、濃硫酸、溴化鉀、三氟乙酸、甲醇、硼氫化鈉、冰醋酸、乙酸酐、甲苯、氯仿、無水硫酸鈉、正丁醇、磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉、鐵氰化鉀、三氯乙酸和三氯化鐵均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

RE-5205旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器，上海亞榮生化儀器廠；GPX-9248A干燥箱，上海躍進(jìn)醫(yī)療器械有限公司；BS224S電子天平，賽多利斯科學(xué)儀器有限公司；TGL-16GB臺式離心機，上海安亭科學(xué)儀器廠；冷凍干燥機，寧波新芝生物科技有限公司；立式超低溫保存箱，青島海爾特種電器有限公司；YP-2壓片機，上海山岳科學(xué)儀器有限公司； Nicolet iS5紅外光譜儀，Thermo； GC7890A氣相色譜儀，Agilent； SB3200DTDN超聲波清洗機，寧波新芝生物科技股份有限公司； TDL-5-A低速大容量離心機，上海安亭科學(xué)儀器廠；V-5600型可見分光光度計，上海元析儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 黃金茶粗多糖的分離、提取、純化 黃金茶葉→干燥→粉碎→過60目篩→黃金茶粉末→石油醚脫脂→超聲循環(huán)水提取→濾液減壓濃縮→Sevage法除蛋白6次→脫色透析48 h→95%乙醇醇沉→無水乙醇洗滌→丙酮洗滌→乙醚洗滌→真空抽濾→冷凍干燥→黃金茶粗多糖→上DEAE-纖維素柱→0.3% NaCl洗脫→冷凍干燥→黃金茶多糖。

1.3.2 黃金茶多糖的純度鑒定 采用苯酚-硫酸法[15]測定黃金茶多糖純度，配制0.2 mg/mL的葡萄糖溶液，分別吸取0，0.2，0.4，0.6，0.8，1.0 mL葡萄糖溶液至試管中，加水至1 mL，分別加入1.0 mL 5%苯酚溶液和5 mL濃硫酸，混勻后反應(yīng)30 min，在490 nm波長下測定吸光度。以吸光度為縱坐標(biāo)，葡萄糖濃度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。根據(jù)回歸方程求得C，按如下公式計算黃金茶多糖的純度：

黃金茶多糖純度(%)=(C×f×V×100%)/(m×1000)

(1)

式中：C為提取所得黃金茶多糖濃度；f為溶液稀釋倍數(shù)；V為提取液體積；m為黃金茶粉末質(zhì)量。

1.3.3 黃金茶多糖的結(jié)構(gòu)初探 (1)紅外光譜掃描。取少量的黃金茶多糖與KBr(m黃金茶多糖∶mKBr=1∶100)粉末充分研磨后壓片，使用傅里葉變換紅外光譜在4 000～400 cm-1進(jìn)行掃描。

(2)紫外光譜分析。將一定量的黃金茶多糖完全溶解到蒸餾水中，使用紫外-可見光分光光度計對多糖溶液在400～200 nm進(jìn)行掃描。

(3)氣相色譜分析黃金茶多糖的單糖組成。

黃金茶多糖(2 mg)→三氟乙酸水解(2 mol/L，1 mL，90 min)→旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀蒸干→加入2 mL甲醇，蒸干(2次)→加入雙蒸水(2 mL)→硼氫化鈉還原(60 mg，8 h)→冰醋酸中和、旋蒸→甲醇(3 mL，3次)→旋蒸至粉末→烘干(110 ℃)→乙酸酐乙?；?1 mL，100 ℃，1 h)→冷卻→甲苯(3 mL)→減壓濃縮蒸干(4～5次)→用氯仿(3 mL)溶解后轉(zhuǎn)移至分液漏斗，加入少量蒸餾水充分震蕩(4次)→氯仿層用適量的無水硫酸鈉干燥→定容至10 mL→GC分析。

GC-MS條件：Hp-5 (Agilent 19091J-413)色譜柱(30 m×0.25 mm×320 μm)；程序升溫條件為：起始溫度120 ℃，以3 ℃/min升溫至250 ℃/min；保持5 min；進(jìn)樣口溫度為250 ℃，檢測器溫度為250 ℃/min，氫氣流量30 mL/min，空氣流量400 mL/min；載氣為N2，流速為1 mL/min。

(4)掃描電鏡。使用雙面膠將黃金茶多糖粉末固定在樣品架上，然后進(jìn)行噴金。使用掃描電鏡(SEM)在15 kv的高電壓和高真空條件下對樣品放大2 000和10 000倍進(jìn)行形態(tài)分析。

1.3.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備 (1)葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備。采用苯酚-硫酸法標(biāo)準(zhǔn)曲線見圖1。

(2)蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備。采用考馬斯亮藍(lán)法[16]，標(biāo)準(zhǔn)曲線見圖2。

圖1 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1 A standard curve of glucose

圖2 蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.2 A standard curve of protein

1.3.5 單因素試驗 (1)Sevage試劑添加量對黃金茶多糖除蛋白效果的影響。氯仿與正丁醇體積4∶1，振搖時間20 min條件下，Sevage試劑的添加量分別是多糖溶液的1/5，1/4，1/3，1/2，1倍時對黃金茶多糖除蛋白效果的影響，重復(fù)測定3次取平均值。

(2)振搖時間對黃金茶多糖除蛋白效果的影響。氯仿與正丁醇體積比4∶1，Sevage試劑與多糖溶液體積比1∶3條件下，振搖時間分別為10，15，20，25，30 min時對黃金茶多糖除蛋白效果的影響，重復(fù)測定3次取平均值。

(3)氯仿與正丁醇體積比對黃金茶多糖除蛋白效果的影響。Sevage試劑為多糖溶液的1/3倍，振搖時間20 min條件下，氯仿與正丁醇的體積比分別為1∶1，1∶2，1∶3，1∶4，1∶5時對黃金茶多糖除蛋白效果的影響，重復(fù)測定3次取平均值。

1.3.6 正交試驗 在單因素試驗基礎(chǔ)上，對Sevage試劑添加量(A)，振搖時間(B)，氯仿與正丁醇體積比(C)3個因素進(jìn)行正交試驗，設(shè)計正交表L9(33)，研究上述3種因素對黃金茶多糖除蛋白效果的影響，從而確定最佳除蛋白工藝條件。每種組合重復(fù)3次，取平均值。試驗因素水平設(shè)計見表1。

表1 正交試驗的因素水平表

2 結(jié)果與分析

2.1 黃金茶多糖的結(jié)構(gòu)分析

2.1.1 黃金茶多糖的紅外、紫外光譜分析 從黃金茶多糖紅外光譜(圖3A)可知，3 412 cm-1處的吸收峰是-OH的伸縮振動吸收峰；2 937 cm-1處的吸收峰是C-H的伸縮振動吸收峰；1 614 cm- 1處的吸收峰是C=O (-COO-)不對稱的伸縮振動吸收峰；1 423 cm-1處吸收峰-CH2的變形吸收峰；1 250 cm-1處則是S=O不對稱的伸縮振動吸收峰，1 074 cm-1處的吸收峰是環(huán)上碳-氧(C-O)吸收峰；635 cm-1處的吸收峰是C-H的伸縮振動吸收峰[17-19]。

圖3 黃金茶多糖的FT-IR光譜(A)和紫外光譜(B)Fig.3 FT-IR spectra of gold tea polysaccharide and UV spectra

從圖3B中可以看出黃金茶多糖在260 nm處沒有顯示吸收，表明不存在核酸。280 nm處的弱峰歸因于蛋白質(zhì)的吸收。苯酚-硫酸法測定黃金茶多糖的純度為65.4%[20]。

圖4 7種單糖標(biāo)準(zhǔn)品(A)和黃金茶多糖(B)的GC圖Fig.4 GC spectra(A)and gold tea polysaccharide(B) of seven standard monosaccharides

2.1.2 GC分析黃金茶多糖的單糖組成成分 圖4A為7種標(biāo)準(zhǔn)品單糖的GC圖，鼠李糖(Rha)、巖藻糖(Fuc)、阿拉伯糖(Ara)、木糖(Xyl)、甘露糖(Man)、葡萄糖(Glu)、半乳糖(Gal)出峰時間分別在15.924，16.402，16.625，17.649，27.660，28.208，28.661 min，圖4B在16.009，16.688，17.706，27.71，28.254，28.709 min的出峰時間可知，黃金茶多糖單糖由鼠李糖(Rha)、阿拉伯糖(Ara)、木糖(Xyl)、甘露糖(Man)、葡萄糖(Glu)、半乳糖(Gal)6種單糖組成，且摩爾比為 0.069∶0.148∶0.056∶0.051∶0.566∶0.102。

2.1.3 掃描電鏡圖 圖5A、5B分別是黃金茶多糖在2 000倍和10 000倍下的掃描電鏡圖像。從圖中可以看出黃金茶多糖表面結(jié)構(gòu)圓滑工整，且均為較規(guī)則的幾何體，10 000倍下的掃描電鏡圖可以看到各單糖分子間有一定的空隙，說明其分子間存在一定的排斥力[21]。

圖5 黃金茶多糖2 000和10 000倍下的掃描電鏡圖像(A,B)Fig.5 SEM image of gold tea polysaccharide under 2 000 and 10 000 times

2.2 單因素結(jié)果分析

2.2.1 Sevage試劑添加量對黃金茶多糖除蛋白效果的影響 由圖6結(jié)果可以看出，隨著試劑添加量的增大，黃金茶蛋白質(zhì)除去率呈現(xiàn)出先升高后降低再升高的趨勢，這可能與Sevage法除蛋白的機理有關(guān),也可能與黃金茶多糖中蛋白質(zhì)的種類及與多糖的結(jié)合方式有關(guān)[22]。試劑添加量在1/3倍時達(dá)到最大值，且與其他4組比較，差異顯著(P<0.05)。多糖損失率呈現(xiàn)出平穩(wěn)上升的趨勢，且除了1倍時達(dá)到17.35%之外，其余均在10%以下。綜合考慮可得：添加1/3倍體積黃金茶多糖溶液的Sevage試劑除蛋白效果較好。

2.2.2 振搖時間對黃金茶多糖除蛋白效果的影響 由圖7結(jié)果可以看出，隨著振搖時間的延長，黃金茶蛋白質(zhì)除去率呈現(xiàn)出先升高后降低的趨勢，這可能與黃金茶多糖中蛋白質(zhì)的種類及與多糖的結(jié)合方式有關(guān)[22]。在20 min時達(dá)到最大值，且與其他4組比較，差異顯著(P<0.05)。多糖損失率呈現(xiàn)平穩(wěn)上升的趨勢，除30 min時達(dá)到10.813%之外，其余均在10%以下。綜合考慮可得：黃金茶多糖溶液在振搖20 min時除蛋白效果較好。

圖6 Sevage試劑添加量對黃金茶多糖除蛋白效果的影響Fig.6 Effect of the sevage reagent content on deproteinization of gold tea polysaccharide

圖7 振搖時間對黃金茶多糖除蛋白效果的影響Fig.7 Effect of shaking time on deproteinization of gold tea polysaccharide

圖8 氯仿正丁醇體積比對黃金茶多糖除蛋白效果的影響Fig.8 Effect of volume ratio (chloroform:n-butanol) on deproteinization of gold tea polysaccharide

2.2.3 氯仿與正丁醇體積比對黃金茶多糖除蛋白效果的影響 由圖8結(jié)果可知，隨著氯仿正丁醇體積比的不斷增大，黃金茶多糖蛋白除去率呈現(xiàn)出先升高后降低的趨勢，這可能與黃金茶多糖中蛋白質(zhì)的種類及與多糖的結(jié)合方式有關(guān)[22]。在氯仿與正丁醇體積比為4∶1時達(dá)到最大值64.31%，且與除了3∶1之外的其余3組比較，差異顯著(P<0.05)。而多糖損失率從氯仿正丁醇體積比為1∶1的42.3%迅速下降至3∶1時的9.045%，其后下降幅度變得極其平緩。綜合考慮可知：黃金茶多糖溶液中添加氯仿正丁醇體積比為4∶1的Sevage試劑除蛋白效果較好。

2.3 黃金茶多糖Sevage法除蛋白最佳工藝的確定

根據(jù)表2和表3的數(shù)據(jù)分析可知，3因素對黃金茶多糖Sevage法除蛋白效果均顯著，且這3個因素對黃金茶多糖除蛋白效率的影響大小分別是A>C>B，即Sevage試劑添加量>氯仿正丁醇體積比>振搖時間。Sevage試劑添加量對黃金茶多糖除蛋白效果的影響極顯著，是影響該試驗結(jié)果的主導(dǎo)因子。根據(jù)K值大小和各因素各水平之間的比較，黃金茶多糖Sevage法除蛋白的最佳工藝組合為A2B2C3，即為Sevage試劑添加量為黃金茶多糖溶液的1/3，振搖時間為20 min，氯仿和正丁醇的體積比為4∶1。由表4可知，重復(fù)性試驗結(jié)果表明，正交優(yōu)化條件下最佳工藝條件的的重現(xiàn)性較好，(RSD=1.477%)，除蛋白率可達(dá)64.94%，(RSD=1.777%)，多糖含量可達(dá)90.14%。

表2 正交試驗結(jié)果

本試驗采用綜合加權(quán)平均法[23]，權(quán)重系數(shù)均為0.5，分別把兩項中最大的指標(biāo)定為100分，各號按下式評分：綜合評分=(脫蛋白率/60)×100×0.5 + (多糖含量/91)×100×0.5

表3 方差分析

*：P≤0.05，**：P≤0.01

2.4 重復(fù)性試驗

表4 重復(fù)性試驗結(jié)果

3 結(jié) 論

黃金茶粗多糖經(jīng)除脂肪、色素、蛋白等雜質(zhì)，過DEAE-纖維素柱，0.3% NaCl洗脫后，其純度達(dá)到65.4%。黃金茶多糖含有部分糖蛋白，含有-OH、-CH、-COOH、S=O、-C=O等官能團。黃金茶多糖由鼠李糖(Rha)、阿拉伯糖(Ara)、木糖(Xyl)、甘露糖(Man)、葡萄糖(Glu)、半乳糖(Gal)6種單糖組成，且6種單糖的摩爾比為 0.069∶0.148∶0.056∶0.051∶0.566∶0.102。利用Sevage法得出黃金茶多糖最佳除蛋白工藝為：Sevage試劑添加量為多糖溶液的1/3，振搖時間20 min，氯仿正丁醇體積比4∶1，在此條件下，黃金茶多糖的除蛋白效率最高且能保證多糖的損失率在合理范圍內(nèi)。