5個(gè)新育成轉(zhuǎn)Bt基因抗蟲(chóng)恢復(fù)系配合力分析

歐陽(yáng)林娟，孫 玥＊，彭東華,王春雷，周大虎，傅軍如，賀曉鵬，賀浩華*，彭小松*

(1.江西農(nóng)業(yè)大學(xué) 農(nóng)學(xué)院/作物生理生態(tài)與遺傳育種教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/江西省超級(jí)稻工程技術(shù)研究中心/雙季稻現(xiàn)代化生產(chǎn)協(xié)同中心，江西 南昌 330045；2.江西省贛州市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所，江西 贛州 341000)

雜交水稻因高產(chǎn)，廣適，多抗等優(yōu)點(diǎn)，迅速被應(yīng)用于生產(chǎn)并被大面積推廣，為中國(guó)乃至世界的糧食安全做出了極大的貢獻(xiàn)[1]。然而近幾年，雜交水稻也面臨著一些新的機(jī)遇與挑戰(zhàn)。一方面，鱗翅目昆蟲(chóng)中僅二化螟、三化螟等害蟲(chóng)在亞洲造成的稻谷損失就占總產(chǎn)的10%左右，而廣泛使用農(nóng)藥既增加種植投入又破壞水土，與此同時(shí)我國(guó)面臨著城市化和勞動(dòng)力流向城市的嚴(yán)峻形勢(shì)，如何減少農(nóng)藥既人工打藥的高成本投入日漸成為亟需解決的問(wèn)題[2-3]。另一方面，大米消費(fèi)市場(chǎng)中優(yōu)質(zhì)常規(guī)稻米贏得了越來(lái)越多消費(fèi)者的青睞，雜交稻米由于品質(zhì)較差往往低價(jià)銷售，這嚴(yán)重挫傷了廣大農(nóng)民種植雜交稻的積極性,但目前雜交水稻整體而言品質(zhì)還難以和常規(guī)稻匹敵，特別是在整精米率、堊白和食味性狀上，選育和鑒定一批優(yōu)質(zhì)骨干親本已迫在眉睫[4-6]。培育抗蟲(chóng)、優(yōu)質(zhì)的雜交稻親本是解決上訴問(wèn)題的主要辦法，而評(píng)價(jià)這些種質(zhì)資源在育種的作用，主要看其配合力[7]。為了評(píng)價(jià)5個(gè)新育成的轉(zhuǎn)Bt基因抗蟲(chóng)恢復(fù)系的利用價(jià)值，以江西農(nóng)業(yè)大學(xué)新選育的5個(gè)轉(zhuǎn)Bt基因抗蟲(chóng)恢復(fù)系為父本，7個(gè)三系野敗型不育系為母本，按照5×7不完全雙列雜交試驗(yàn)設(shè)計(jì)[8]，并利用分子標(biāo)記輔助選擇[9]，篩選出特殊配合力效應(yīng)值較高的14個(gè)配組后代，將這14個(gè)組合送檢農(nóng)業(yè)部國(guó)家稻米品質(zhì)檢測(cè)中心(武漢)，篩選出2個(gè)組合米質(zhì)到達(dá)國(guó)優(yōu)3級(jí)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 轉(zhuǎn)基因恢復(fù)系 昌恢121T、昌恢606T、昌恢891T、昌恢T025T和R205T。

1.1.2 不育系 泰豐A、荃9311A、洪A、67A、潤(rùn)豐A、843A和5957A。

1.1.3 試劑 1.5×CTAB；氯仿/異戊醇(24∶1)；無(wú)水乙醇；引物(序列見(jiàn)表1，由上海生工公司合成)；Buffer；Taq酶；dNTP；瓊脂糖；GelRed等。

表1 BT基因擴(kuò)增引物

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 試驗(yàn)設(shè)計(jì) 試驗(yàn)以7個(gè)不育系和5個(gè)恢復(fù)系，采用不完全雙列雜交，2016年春在海南三亞江西農(nóng)業(yè)大學(xué)南繁試驗(yàn)基地配制35個(gè)組合。2016年夏將35個(gè)組合種植于江西農(nóng)業(yè)大學(xué)試驗(yàn)田，秧田釆用露地濕潤(rùn)育秧，5月19日播種，6月25日移栽。田間試驗(yàn)按隨機(jī)區(qū)組設(shè)計(jì)，每個(gè)小區(qū)栽插3行，每行10株，單本植，3次重復(fù)。

1.2.2 分子標(biāo)記輔助檢測(cè) 進(jìn)行PCR擴(kuò)增。將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物置于10 g/L瓊脂糖凝膠電泳上檢測(cè)。以DNA Marker DL-2000為分子標(biāo)記，電泳結(jié)果利用凝膠成像分析儀進(jìn)行拍照觀察。

1.2.3 免疫金試紙條轉(zhuǎn)基因植株Bt蛋白定性檢測(cè) 剪取分蘗期葉片置于2.5 mL離心管中，加入提取緩沖液并用玻璃棒將葉片汁液碾出，用免疫金試紙條蘸取混合液后觀察結(jié)果。

1.2.4 配合力效應(yīng)的數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析 配合力分析釆用SPSS數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)和Excel 2003進(jìn)行方差分析，一般配合力(GCA)、特殊配合力效應(yīng)值(SCA)估算，配合力方差貢獻(xiàn)率分析，結(jié)實(shí)率利用Excel反正弦平方根轉(zhuǎn)換。NCII遺傳交配設(shè)計(jì)模型為：Yijk=μ+gi+gj+gij+εijk，其中Yijk為一組親本i(母本)與另一組親本j(父本)的雜交組合第k次重復(fù)的表型值，μ為所有組合的均值，gi為第i個(gè)母本一般配合力效應(yīng)，gj為第j個(gè)父本—般配合力效應(yīng)，gij為親本i與親本j的雜交組合特殊配合力效應(yīng)，εijk為試驗(yàn)誤差[10]。

1.2.5 性狀考察 考察材料主要農(nóng)藝性狀，主要包括植株株髙、穗長(zhǎng)、有效穗數(shù)、每穗總粒數(shù)、每穗實(shí)粒數(shù)、千粒質(zhì)量、空批粒數(shù)、結(jié)實(shí)率和單株產(chǎn)量。在水稻完熟期收取連續(xù)3株，帶回實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行考種并記錄，篩選出產(chǎn)量性狀好的雜交組合，收取300 g稻谷送至農(nóng)業(yè)部食品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)測(cè)試中心(武漢)檢測(cè)。

2 結(jié)果與分析

2.1 分子標(biāo)記檢測(cè)結(jié)果

取分蘗期葉片抽提水稻DNA，通過(guò)PCR及瓊脂糖水平電泳檢測(cè)，顯影后確定35個(gè)F1能夠擴(kuò)增出片段長(zhǎng)度為600 bp、799 bp的cry1C、cry2A(含同時(shí)轉(zhuǎn)兩個(gè)抗蟲(chóng)基因的材料)，確定這些F1代雜交組合為陽(yáng)性植株。

Marker：1；轉(zhuǎn)基因F1組合實(shí)驗(yàn)材料:3、5、7、9、11和13;非轉(zhuǎn)基因F1組合作陰性對(duì)照:2、4、6、8、10、12和14Marker：1；the research materials were transgene F1 hybrid:3，5，7，9，11，13；the negative control were non-transgene F1 hybrid：2，4，6，8，10，12，14圖1 瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果Fig.1 Agarose gel electrophoretogram

2.2 免疫金標(biāo)速測(cè)卡檢測(cè)結(jié)果

使用上海佑隆公司免疫金標(biāo)速測(cè)卡檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，35個(gè)雜交組合均顯示出質(zhì)控線，與分子標(biāo)記檢測(cè)結(jié)果吻合，進(jìn)一步驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)的準(zhǔn)確性。

蛋白陽(yáng)性植株，質(zhì)控線和檢測(cè)線均出現(xiàn)Positive plants of protein which had line of quality control and line of detecting圖2 試紙條檢測(cè)結(jié)果Fig.2 Results of test paper detection

2.3 配合力方差分析

通過(guò)分析35個(gè)組合中9個(gè)農(nóng)藝性狀的方差，由表2可知，每個(gè)性狀在不同材料間存在極顯著差異，說(shuō)明試驗(yàn)材料間存在明顯的差異。分析父本的一般配合力方差可知，除單株產(chǎn)量外其他性狀的一般配合力方差均達(dá)到極顯著水平，而母本的一般配合力方差中，所有性狀的一般配合力方差均達(dá)到極顯著水平。分析母本/父本組合間的特殊配合力方差可以發(fā)現(xiàn)，除千粒質(zhì)量外其他性狀的特殊配合力方差均達(dá)到極顯著水平。

表2 35個(gè)組合9個(gè)產(chǎn)量性狀的配合力方差分析

**表示差異0.01水平顯著性,*表示差異0.05水平顯著性

**significant at 0.01 level，*significant at 0.05 level

2.4 親本的一般配合力效應(yīng)分析

由表3可知，7個(gè)不育系和5個(gè)恢復(fù)系的9個(gè)農(nóng)藝性狀一般配合力(GCA)效應(yīng)值均存在明顯差異，說(shuō)明親本加性效應(yīng)對(duì)于不同親本、不同性狀的作用程度不同。

表3 各親本產(chǎn)量及相關(guān)性狀的一般配合力(GCA)效應(yīng)值

在參試恢復(fù)系中，株高GCA效應(yīng)值以昌恢606T最高為-1.93，在提升其組合抗倒性上起到很大的貢獻(xiàn)；昌恢121T實(shí)粒數(shù)GCA效應(yīng)值為20.71，明顯高于同類恢復(fù)系；昌恢T025T穗長(zhǎng)、總粒數(shù)、單株產(chǎn)量GCA效應(yīng)值分別為2.01、43.49，明顯高于同類恢復(fù)系；單株產(chǎn)量是反應(yīng)組合產(chǎn)量大小的直接因素，單株產(chǎn)量GCA效應(yīng)值最高的是昌恢T025T，達(dá)到4.11，其次是昌恢121T、R205選T、昌恢606T、昌恢891T，分別為3.66、-0.52、-3.02和-4.23。昌恢891T千粒質(zhì)量GCA效應(yīng)值最高為1.83，在提升其組合粒重上起到很大的貢獻(xiàn)。綜上5個(gè)新轉(zhuǎn)Bt基因抗蟲(chóng)恢復(fù)系產(chǎn)量構(gòu)成相關(guān)性狀GCA效應(yīng)值，昌恢T025T效應(yīng)最高，昌恢121T、R205選T其次，昌恢606T、昌恢891T效應(yīng)最低。

在參試不育系中，株高的GCA效應(yīng)值，較低的依次為潤(rùn)豐A、843A、泰豐A、5957A、荃9311A、67A和洪A，其中潤(rùn)豐A和843A的株高GCA效應(yīng)值最低，在提升其組合抗倒性上起到很大的貢獻(xiàn)；67A穗長(zhǎng)GCA效應(yīng)值最高；在構(gòu)成組合產(chǎn)量性狀方面，有效分蘗和千粒質(zhì)量的GCA效應(yīng)值最高是荃9311A，實(shí)粒數(shù)GCA效應(yīng)值最高是洪A，總粒數(shù)和結(jié)實(shí)率GCA效應(yīng)值最高是67A，單株產(chǎn)量GCA效應(yīng)值最高的是洪A，其他較高的依次為荃9311A、潤(rùn)豐A、67A、泰豐A、5957A和843A。

表4 72個(gè)組合產(chǎn)量及相關(guān)性狀特殊配合力(SCA)效應(yīng)值

2.5 F1配組后代的特殊配合力效應(yīng)分析

單株產(chǎn)量是水稻單產(chǎn)的決定因素，由表4可知，35個(gè)組合單株產(chǎn)量SCA效應(yīng)值變幅為-22.66～22.62，有18個(gè)組合特殊配合力(SCA)效應(yīng)值為正值，較高的依次為67A/R205T(22.62)、荃9311A/昌恢T025T(19.01)、洪A/昌恢121T(15.72)和843A/昌恢891T(15.52)，其中67A/R205T單株產(chǎn)量SCA效應(yīng)值最高，為22.62；對(duì)產(chǎn)量性狀相關(guān)的4個(gè)性狀(包括有效穗數(shù)、總粒數(shù)、結(jié)實(shí)率、單株產(chǎn)量)SCA效應(yīng)值進(jìn)行綜合評(píng)價(jià)，荃9311A/昌恢T025T每穗實(shí)粒數(shù)(23.84)、總粒數(shù)(16.17)、結(jié)實(shí)率(0.02)和單株產(chǎn)量(19.01)具有較高的SCA效應(yīng)值，而株高(-0.99)、空癟粒數(shù)(-7.58)具有較低的SCA效應(yīng)值，該組合可能是一個(gè)高產(chǎn)組合；株高是決定水稻抗倒性的主要因素之一，在2016年9月臺(tái)風(fēng)環(huán)境壓迫下，株高SCA效應(yīng)值最小的是843A/昌恢606T(-8.78)，說(shuō)明843A/昌恢606T可能具有較好的抗倒伏能力；穗長(zhǎng)SCA效應(yīng)值最大的是843A/昌恢891T(2.21)，最小的是荃9311A/昌恢891T(-2.54)；空癟粒數(shù)是限制水稻產(chǎn)量的主要因素之一，在2016年7月底抽穗期高溫環(huán)境壓迫下，35個(gè)組合空癟粒數(shù)SCA效應(yīng)值變幅為-41.66～45.04，有16個(gè)組合空癟粒數(shù)SCA效應(yīng)值為負(fù)值，843A/昌恢121T空癟粒數(shù)SCA效應(yīng)值最低為-41.66，結(jié)實(shí)率SCA效應(yīng)值最高為0.23，說(shuō)明843A/昌恢121T可能是一個(gè)耐高溫組合。特殊配合力效應(yīng)值在同一組合的不同性狀間和同一性狀的不同組合間存在顯著差異，說(shuō)明這些材料的基因間互作是非常復(fù)雜的。

2.6 基因型方差貢獻(xiàn)率估算

為了清楚地了解親本對(duì)后代雜種優(yōu)勢(shì)的影響，試驗(yàn)對(duì)9個(gè)農(nóng)藝性狀的基因型方差貢獻(xiàn)率進(jìn)行了估算。從表5可以得知，所有性狀的一般配合力方差貢獻(xiàn)率(GCA%)均大于特殊配合力方差貢獻(xiàn)率(SCA%)，說(shuō)明材料的主要農(nóng)藝性狀受基因加性效應(yīng)控制，親本的一般配合力在選配組合過(guò)程中占主導(dǎo)作用，親本是決定組合好壞的關(guān)鍵因素。由雙親的一般配合力方差貢獻(xiàn)率(GCA%)可知，母本對(duì)株高、有效分蘗、每穗實(shí)粒數(shù)、總粒數(shù)、結(jié)實(shí)率、單株產(chǎn)量的貢獻(xiàn)率大于父本，而父本對(duì)穗長(zhǎng)、空癟粒數(shù)、千粒質(zhì)量的貢獻(xiàn)率大于母本，說(shuō)明父、母本對(duì)雜交一代各性狀的貢獻(xiàn)率有著重要的作用，但不同性狀貢獻(xiàn)率的側(cè)重方向不同；另外值得注意的是，有效分蘗和千粒質(zhì)量的特殊配合力方差貢獻(xiàn)率占了相當(dāng)大的比值，說(shuō)明這兩個(gè)性狀受雙親基因互作影響較大。

表5 9個(gè)農(nóng)藝性狀的基因型方差貢獻(xiàn)率

2.7 組合的品質(zhì)性狀檢測(cè)

選取14個(gè)產(chǎn)量相關(guān)性狀SCA效應(yīng)值較高的組合，將14個(gè)組合的稻谷送至農(nóng)業(yè)部國(guó)家稻米品質(zhì)檢測(cè)中心(武漢)檢測(cè)，兩個(gè)組合達(dá)到國(guó)家米質(zhì)3級(jí)，分別為荃9311A/昌恢T025T、龍S/昌恢121T(表6)。

表6 2個(gè)雜交組合的10個(gè)品質(zhì)性狀

3 結(jié)論與討論

一般配合力(GCA)效應(yīng)值分析表明，在5個(gè)新育成的轉(zhuǎn)Bt基因抗蟲(chóng)恢復(fù)系中，昌恢T025T和昌恢121T的單株產(chǎn)量GCA效應(yīng)值排名前兩位，分別為4.11和3.66，這兩個(gè)恢復(fù)系配出的組合單株產(chǎn)量較好，可以成為較好的親本材料；R205選T和昌恢606T配出的組合單株產(chǎn)量一般，單株產(chǎn)量GCA效應(yīng)值分別為-0.52和-3.02；昌恢891T單株產(chǎn)量GCA效應(yīng)值最低為-4.23。在7個(gè)不育系中，洪A和荃9311A的單株產(chǎn)量GCA排名前兩位，分別為19.62和17.60，這兩個(gè)不育系配出的組合單株產(chǎn)量較好。特殊配合力(SCA)效應(yīng)值分析表明，在荃9311/昌恢T025T的SCA效應(yīng)值中，穗長(zhǎng)為1.23,實(shí)粒數(shù)為23.84，總粒數(shù)為16.17，千粒質(zhì)量為1.02，單株產(chǎn)量為19.01，產(chǎn)量相關(guān)性狀的SCA效應(yīng)值綜合評(píng)價(jià)最好；67A/R205T的單株產(chǎn)量SCA效應(yīng)值最高為22.62；843A/昌恢121T的結(jié)實(shí)率SCA效應(yīng)值最高為0.23。昌恢T025T和荃9311A的單株產(chǎn)量GCA效應(yīng)值都較高，所配組合荃9311/昌恢T025T的單株產(chǎn)量SCA效應(yīng)值也較高，說(shuō)明只有選育出農(nóng)藝性狀好的親本，才能配組得到農(nóng)藝性狀好的組合。通過(guò)分析基因型方差貢獻(xiàn)率可知，9個(gè)農(nóng)藝性狀的一般配合力方差貢獻(xiàn)率均大于特殊配合力方差貢獻(xiàn)率，結(jié)果表明在親本與子代的遺傳力方面，基因加性效應(yīng)比基因非加性效應(yīng)的作用更強(qiáng)。最后，通過(guò)配合力分析結(jié)合田間實(shí)際育種經(jīng)驗(yàn)，研究發(fā)現(xiàn)江西農(nóng)業(yè)大學(xué)新培育的轉(zhuǎn)Bt基因抗蟲(chóng)恢復(fù)系昌恢T025T、昌恢121T是配合力強(qiáng)的親本材料，荃9311/昌恢T025T是一個(gè)綜合表現(xiàn)較好的轉(zhuǎn)Bt基因抗蟲(chóng)雜交組合材料。