紫皮洋蔥低聚糖的提取及分離研究

賈 甜,曾 潔,張瑞瑤,曹 蒙,宋孟迪,胡雅婕,高海燕，張 浩

(河南科技學(xué)院食品學(xué)院,河南新鄉(xiāng) 453003)

洋蔥,又名玉蔥,百合科蔥屬植物,被譽(yù)為“蔬中皇后”、“菜中玫瑰”。洋蔥營(yíng)養(yǎng)豐富,含有硫化合物、低聚糖、類黃酮化合物、多糖、前列腺素類和甾體皂苷等多種生理活性物質(zhì),具有抗癌,抗菌,抗衰老,降血壓,抗動(dòng)脈硬化,治療糖尿病等生理作用[1-2]。其中,洋蔥中含有豐富的低聚糖,低聚糖是由2～10個(gè)單糖通過(guò)糖苷鍵連接形成的直鏈或支鏈低度聚合糖[3],洋蔥低聚糖不僅具有低熱、穩(wěn)定、安全無(wú)毒的理化性質(zhì),而且具有預(yù)防、抑制和殺死腫瘤細(xì)胞,提高機(jī)體免疫力,激活巨噬細(xì)胞的吞噬活性,提高機(jī)體的抗感染能力的重要作用[4-6]。目前多采用溶劑直接浸提、微波和超聲波輔助萃取及酶水解法提取低聚糖,但由于聚合度或極性相近,低聚糖的分離是一大難題。本文對(duì)紫皮洋蔥低聚糖的提取進(jìn)行優(yōu)化,并對(duì)提取物進(jìn)行Bio gel P-2生物膠層析分離檢測(cè)及水解研究,為紫皮洋蔥低聚糖的進(jìn)一步研究提供了理論依據(jù),同時(shí)也為植物低聚糖的分離方法及水解方法提供一種參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

鮮紫皮洋蔥 市售;蒽酮 天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司;硫酸 鄭州派尼化學(xué)試劑廠;乙酸乙酯、甲醇、乙醇、葡萄糖(TLC檢測(cè)用) 天津市光復(fù)科技發(fā)展有限公司;果糖(TLC檢測(cè)用) 合肥博美生物科技有限責(zé)任公司;蔗糖(TLC檢測(cè)用) 天津市德恩化學(xué)試劑有限公司;棉子糖(TLC檢測(cè)用) Alfa Aesar;磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉 天津市東麗區(qū)天大化學(xué)試劑廠;葡萄糖(HPLC分析用)、果糖(HPLC分析用)、蔗糖(HPLC分析用)蔗果三糖、蔗果四糖、蔗果六糖 量子高科(中國(guó))生物股份有限公司;β-D-呋喃果糖苷酶(酶活力為330 U/mg)、硅膠板(GF254) 美國(guó)sigma公司;生物膠Bio-gel P-2 美國(guó)BIO-RAD公司;4-甲氧基苯甲醛 國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

WBL25B26型榨汁機(jī) 美的公司;ME104E型電子天平 梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司;SHZ-95B型循環(huán)水式多用真空泵 鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司;SHA-C型水浴恒溫振蕩器 金壇市杰瑞爾電器有限公司;冰箱 青島海爾股份有限公司;TDL-40B臺(tái)式離心機(jī) 上海安亭科學(xué)儀器廠;YRE-52AA型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司;HZ-2S型恒流泵 上海瀘西分析儀器廠有限公司;玻璃點(diǎn)樣毛細(xì)管 華西醫(yī)科大學(xué)儀器廠;721型分光光度計(jì) 上海舜宇恒平科學(xué)儀器有限公司;恒溫鼓風(fēng)干燥箱 上海瑯玕實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司;FL-1型可調(diào)式封閉電爐 北京市永光明醫(yī)療儀器有限公司;10 μL微量進(jìn)樣器 上海高鴿工貿(mào)有限公司;Waters 510型高效液相色譜儀 Waters公司(Milford,MA,USA)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 紫皮洋蔥低聚糖的提取 將新鮮紫皮洋蔥剝?nèi)ネ鈱痈善?破碎其組織,得到勻漿液,準(zhǔn)確稱取勻漿10 g置于250 mL燒杯中,量取100 mL 95%乙醇用于除去洋蔥勻漿中的可溶性單糖,抽濾,濾渣重復(fù)洗滌兩次,采用熱水浸提法,將一定料液比的濾渣和超純水裝入錐形瓶中,并加上封口膜,置于水浴振蕩器中,在一定提取溫度、一定提取時(shí)間條件下,得到紫皮洋蔥糖類物質(zhì),加2.5倍無(wú)水乙醇攪拌并置于4 ℃冰箱過(guò)夜,以4500×g轉(zhuǎn)速離心5 min,棄沉淀,將上清液旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)即可得到紫皮洋蔥低聚糖提取液,定容至50 mL備用[2,7-9]。

1.2.2 低聚糖含量的定性分析 紫皮洋蔥低聚糖提取液經(jīng)過(guò)蒽酮-硫酸比色法顯色后[13-15],采用紫外-可見(jiàn)光譜儀掃描顯色后的溶液[13],采集吸收波長(zhǎng)為400～800 nm,分辨率為1 nm的吸收光譜。

采用蒽酮-硫酸比色法制作葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線[12]。

紫皮洋蔥低聚糖的測(cè)定:取1 mL紫皮洋蔥低聚糖提取液,采用蒽酮-硫酸比色法在紫外光譜最大波長(zhǎng)處測(cè)定其吸光值,平行測(cè)定3次,取平均值,代入標(biāo)準(zhǔn)曲線,計(jì)算出低聚糖提取量,再根據(jù)以下公式計(jì)算得率。

得率(mg/g)=低聚糖提取量(mg)/紫皮洋蔥重量(g)

1.2.3 紫皮洋蔥低聚糖提取試驗(yàn)設(shè)計(jì)

1.2.3.1 單因素實(shí)驗(yàn) 在提取溫度為70 ℃、提取時(shí)間80 min的條件下,探究料液比1∶1、1∶2、1∶3、1∶4、1∶5 g/mL對(duì)洋蔥低聚糖得率的影響;在料液比1∶3 g/mL,提取溫度70 ℃的條件下,探究提取時(shí)間60、70、80、90、100 min對(duì)洋蔥低聚糖得率的影響;在料液比為1∶3 g/mL,提取時(shí)間為80 min的條件下,探究溫度50、60、70、80、90 ℃對(duì)洋蔥低聚糖得率的影響。

1.2.3.2 正交試驗(yàn) 為確定最佳提取工藝參數(shù),采用L9(34)正交設(shè)計(jì),比較料液比(A)、提取時(shí)間(B)和提取溫度(C)對(duì)洋蔥低聚糖得率的影響,以洋蔥低聚糖得率作為指標(biāo)。

表1 正交實(shí)驗(yàn)因素水平表Table 1 Experiment design

1.2.4 低聚糖的TLC檢測(cè)分析 TLC染色液:準(zhǔn)確量取12.5 mL 4-甲氧基苯甲醛于212.5 mL冰浴甲醇中,攪拌,防止液體飛濺,小心加入25 mL濃硫酸于冰浴甲醇中,60 min內(nèi)加完,淡黃色的染色液貯存于-20 ℃?zhèn)溆谩８鶕?jù)點(diǎn)樣個(gè)數(shù),將薄層層析板裁取適當(dāng)大小,用鉛筆在距薄層板一端大約 1 cm處每隔適當(dāng)距離畫(huà)點(diǎn),同時(shí)在下方做好標(biāo)記,然后用移液器分別吸取0.3 μL濃度為10 mmol/mL的葡萄糖、果糖、蔗糖、棉子糖及0.3 μL樣品點(diǎn)于對(duì)應(yīng)點(diǎn)上,放入45 ℃干燥箱中烘干。把點(diǎn)好樣的薄層板放進(jìn)展開(kāi)槽中展開(kāi),以V(乙酸乙酯)∶V(甲醇)∶V(水)∶V(冰醋酸)=6∶2 ∶1∶0.2為展開(kāi)劑進(jìn)行展開(kāi),展開(kāi)完畢后,進(jìn)行染色,記下斑點(diǎn)位置[16-17]。

1.2.5 質(zhì)譜分析 本實(shí)驗(yàn)將提取到的紫皮洋蔥低聚糖進(jìn)行LC-MS/MS分析得到質(zhì)譜圖,根據(jù)質(zhì)譜峰的位置及峰的強(qiáng)度對(duì)產(chǎn)物進(jìn)行成分分析和結(jié)構(gòu)分析,本實(shí)驗(yàn)采用TQD LC/MS system(Waters,USA),配有真空脫氣系統(tǒng),設(shè)置掃描范圍為150～1800 m/z,流動(dòng)相為超純水[18-19],使用微量進(jìn)樣器進(jìn)樣,每次進(jìn)樣10 μL。

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1.2.6 高效液相色譜分析(HPLC) 采用高效液相色譜法對(duì)所提取到的低聚糖及該低聚糖水解后的產(chǎn)物進(jìn)行定性分析。

標(biāo)準(zhǔn)品配制:分別稱取葡萄糖、果糖、蔗糖、蔗果三糖、蔗果四糖、蔗果六糖10 mg,加超純水溶解并定容至10 mL,配制成1 mg/mL的單一標(biāo)準(zhǔn)品存于4 ℃冰箱備用,根據(jù)使用需求進(jìn)行稀釋,配制成不同濃度的混合標(biāo)準(zhǔn)樣品,過(guò)0.22 μm濾膜待用。

樣品處理:稱取紫皮洋蔥低聚糖10 mg,加超純水定容至10 mL,過(guò)0.22 μm濾膜待用。紫皮洋蔥低聚糖的水解:將一定量的紫皮洋蔥低聚糖加入到pH為5.5濃度為 50 mmol/L的磷酸緩沖液中,配制成濃度為10%的糖液,取4 mL于55 ℃預(yù)熱10 min,加入等量β-呋喃果糖苷酶液調(diào)節(jié)pH至4.0,在轉(zhuǎn)速為200 r/min的55 ℃氣浴蒸蕩器中反應(yīng)40 min后放入沸水浴15 min終止反應(yīng),過(guò)0.22 μm濾膜待用[20-22]。

參數(shù)設(shè)置:HPLC分析在Waters 510高效液相色譜儀(Milford,MA,USA)上進(jìn)行;分離柱:Hypersil-NH2柱(4.6×250 mm;5 μm);流動(dòng)相:水∶乙腈=32∶68;流速:1.0 mL/min;柱溫:30 ℃;進(jìn)樣量:10 μL。

1.2.7 紫皮洋蔥低聚糖的分離純化 準(zhǔn)確稱取20 g紫皮洋蔥勻漿,按優(yōu)化后的方法提取紫皮洋蔥低聚糖,提取液經(jīng)抽濾后濃縮至約2 mL,然后用Bio gel P-2凝膠層析柱純化[23-27]。將處理好的Bio gel P-2凝膠裝柱,上樣,洗脫劑為去離子水,調(diào)整自動(dòng)收集器收集,每8 min收集1管,每管6 mL,利用重力作用洗脫平衡1～2個(gè)柱體積。對(duì)收集到的100管分離液進(jìn)行TLC快速檢測(cè),用微量移液槍依次吸取各管0.3 μL溶液,點(diǎn)樣,烘干,置于254 nm紫外燈下觀察是否有顯紫外的點(diǎn),做好標(biāo)記,然后對(duì)硅膠板進(jìn)行染色,烘烤,挑選出不顯紫外且顯色點(diǎn)的管號(hào)做進(jìn)一步TLC檢測(cè)分析,并以葡萄糖、果糖、蔗糖、棉子糖為標(biāo)準(zhǔn)樣品作為參照。

從經(jīng)快速檢測(cè)顯色的管中吸取1.0 mL分離液,以蒽酮-硫酸比色法在紫外光譜圖最大吸收峰處測(cè)定吸光值,處理數(shù)據(jù),作紫皮洋蔥低聚糖提取液的糖分分布曲線。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

采用Excel 2007軟件、正交助手軟件及Origin 8.0軟件處理分析實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)并繪圖,每個(gè)樣品平行測(cè)定三次。

2 結(jié)果與分析

2.1 紫皮洋蔥低聚糖的可見(jiàn)光譜分析及標(biāo)準(zhǔn)曲線建立

紫皮洋蔥低聚糖的可見(jiàn)光譜圖如圖1所示。從圖1中可看出,在628 nm處有最大吸收峰,故選擇628 nm為吸收波長(zhǎng)。標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖2所示,實(shí)驗(yàn)測(cè)得標(biāo)準(zhǔn)回歸方程為:y=0.0111x+0.0116,相關(guān)系數(shù)為:R2=0.9995。

圖1 紫皮洋蔥低聚糖的可見(jiàn)光譜分析Fig.1 Visible spectrum analysis of oligosaccharides from purple onion

2.2 單因素實(shí)驗(yàn)

2.2.1 料液比的確定 由圖3可知,料液比在1∶1～1∶4 g/mL之間時(shí),低聚糖提取量隨著水提取劑用量的增加不斷增加,這可能是由于提取劑用量的增大提高了原料與溶劑之間的傳質(zhì)推動(dòng)力[22],提高了糖分子的擴(kuò)散速率,從而低聚糖不斷溶出。當(dāng)料液比達(dá)到1∶4 g/mL,再增加提取劑的量時(shí),低聚糖提取量沒(méi)有明顯增加,趨于穩(wěn)定狀態(tài),可能是在此條件下,低聚糖已經(jīng)近乎全部浸出,再增加提取劑只會(huì)增加旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮難度以及成本,所以,選擇料液比為1∶3、1∶4、1∶5三個(gè)水平為正交試驗(yàn)考察因素。

圖3 料液比對(duì)低聚糖提取量的影響Fig.3 Effect of liquid ratio on the extraction of oligosaccharides

2.2.2 提取時(shí)間的確定 低聚糖的提取過(guò)程十分復(fù)雜,包括浸泡、擴(kuò)散、滲透、溶解、再擴(kuò)散、平衡等多個(gè)步驟[8]。由圖4可知,提取時(shí)間在50～90 min時(shí),隨著時(shí)間的延長(zhǎng),低聚糖能不斷的溶出,提取量隨著時(shí)間的增加而增加。但是當(dāng)提取時(shí)間大于90 min時(shí),低聚糖提取量反而減小,提取時(shí)間過(guò)長(zhǎng),會(huì)造成提取液中部分寡糖分解,導(dǎo)致得率下降。所以,選擇提取時(shí)間為80、90、100 min三個(gè)水平為正交試驗(yàn)考察因素。

圖4 提取時(shí)間對(duì)低聚糖提取量的影響Fig.4 Effect of extracting time on the extraction of oligosaccharides

2.2.3 提取溫度的確定 由圖5可知,溫度在50～70 ℃之間時(shí),低聚糖提取量隨提取溫度的升高而增加,在此溫度范圍內(nèi),低聚糖溶解度隨著溫度的升高而增大。當(dāng)溫度高于70 ℃后,溫度越高低聚糖提取量反而減少,這可能是某些熱穩(wěn)定性較差的寡糖在較高溫度下分解,從而導(dǎo)致較低的提取量。所以,選擇溫度為60、70、80 ℃三個(gè)水平為正交試驗(yàn)考察因素。

圖5 提取溫度對(duì)低聚糖提取量的影響Fig.5 Effect of extraction temperature on the extraction of oligosaccharides

2.3 正交試驗(yàn)結(jié)果與分析

由表2可知,影響紫皮洋蔥低聚糖得率的主次因素是提取溫度>提取時(shí)間>料液比,由K值可知,紫皮洋蔥低聚糖提取條件的最佳組合為A3B1C2,即料液比1∶5 g/mL,提取時(shí)間80 min,提取溫度70 ℃,經(jīng)驗(yàn)證,所提取到的低聚糖得率為3.92 mg/g,其他條件下都高。

表2 正交試驗(yàn)結(jié)果Table 2 The orthogonal experiment results

2.4 TLC檢測(cè)與質(zhì)譜分析

由圖6可知,紫皮洋蔥提取液的TLC圖譜中顯示了主要的兩大類糖分,其中位置較高的斑點(diǎn)與果糖的Rf值相近,位置較低的斑點(diǎn)與蔗糖的Rf值相近,并且樣品點(diǎn)靠下部分有拖尾現(xiàn)象,可能是其它聚合度的糖類物質(zhì)但其所占比例很低,難以清晰顯現(xiàn)。由圖7質(zhì)譜圖及表3質(zhì)譜分析表可知,所提取的紫皮洋蔥低聚糖中存在二糖(360.13 m/z)、三糖(521.95 m/z)、四糖(683.86 m/z)、六糖(1029.64 m/z),可能因?yàn)槟承┚酆隙鹊奶呛枯^低,所以在TLC檢測(cè)中難以清晰顯現(xiàn),其中測(cè)得的分子量中,1146.26、1302.27、1486.58 m/z為上述聚合度的低聚糖在質(zhì)譜測(cè)量過(guò)程中不同聚合度的疊加,1146.26 m/z為三糖和四糖的疊加,1302.27 m/z為二糖和六糖的疊加或者是兩個(gè)四糖的疊加,1486.58 m/z為三個(gè)三糖的疊加。關(guān)于低聚糖組分的定性分析及其活性評(píng)價(jià),將在后續(xù)實(shí)驗(yàn)中進(jìn)一步研究,以確定其單糖組分與活性的關(guān)系。

圖6 紫皮洋蔥低聚糖的TLC圖譜Fig.6 TLC analysis of carbohydrates from purple onion

圖7 紫皮洋蔥低聚糖的質(zhì)譜圖Fig.7 MS of oligosaccharides from purple onion

表3 紫皮洋蔥低聚糖質(zhì)譜分析表Table 3 The MS analysisTable of oligosaccharides from purple onion

2.5 HPLC結(jié)果分析

由圖8、圖9可知,紫皮洋蔥低聚糖中含有蔗糖、蔗果三糖、蔗果四糖、蔗果六糖,其中,蔗果三糖含量較高,蔗果四糖,蔗果六糖含量相對(duì)較低,同時(shí),發(fā)現(xiàn)葡萄糖和果糖含量較低,說(shuō)明乙醇沉淀法能較好的除去單糖。由圖10可知,紫皮洋蔥低聚糖經(jīng)β-呋喃果糖苷酶水解后,蔗糖、蔗果三糖、蔗果四糖、蔗果六糖含量明顯降低,果糖和葡萄糖含量升高,該水解后的HPLC分析說(shuō)明β-呋喃果糖苷酶在適宜條件能較好的水解紫皮洋蔥低聚糖中的蔗果低聚糖。

圖8 混合標(biāo)準(zhǔn)溶液的HPLC分析Fig.8 HPLC analysis of the mixed standard solution注:1:果糖;2:葡萄糖;3:蔗糖;4:蔗果三糖; 5:蔗果四糖;6:蔗果六糖；圖9、圖10同。

圖9 紫皮洋蔥低聚糖的HPLC分析Fig.9 HPLC analysis of oligosaccharides from purple onion

圖10 紫皮洋蔥低聚糖水解后的HPLC分析Fig.10 HPLC analysis of oligosaccharides after hydrolysis from purple onion

2.6 Big gel p-2分離純化

由圖11可知,經(jīng)Big gel p-2凝膠柱層析后,所收集的分離樣品中53～71管均有糖類物質(zhì)存在,53～63管有和蔗糖Rf值相近的糖類物質(zhì)存在,61～69管有和果糖Rf值相近的糖類物質(zhì)存在,而粗樣品中的拖尾點(diǎn)可能是濃度較低的低聚糖點(diǎn),經(jīng)分離后濃度太低,在薄層層析板上未能清晰顯現(xiàn)。由圖12為紫皮洋蔥低聚糖經(jīng)Big gel p-2凝膠柱層析后得到的糖分分布曲線,Big gel p-2凝膠能起到將具有一定特點(diǎn)的糖類聚集分離的作用,但是并不能完全將洋蔥中單一聚合度的低聚糖分離。

圖11 紫皮洋蔥低聚糖分離后的TLC檢測(cè)注：1:葡萄糖;2:果糖;3:蔗糖;4:棉子糖; 5:樣品;6～14:53管～69管中單數(shù)管。Fig.11 TLC analysis of carbohydrates from purple onion after separation

圖12 紫皮洋蔥低聚糖洗脫曲線Fig.12 Elution curve of carbohydrates from purple onion

3 結(jié)論

采用熱水浸提法對(duì)新鮮紫皮洋蔥進(jìn)行低聚糖的提取,通過(guò)單因素實(shí)驗(yàn)及正交試驗(yàn)確定影響紫皮洋蔥低聚糖提取量的主次因素是提取溫度>提取時(shí)間>料液比,最佳提取工藝為料液比1∶5 (g/mL)、提取溫度70 ℃、提取時(shí)間80 min,在此提取工藝下,所提取到的低聚糖含量為3.92 mg/g。TLC檢測(cè)和MS分析對(duì)粗寡糖進(jìn)行檢測(cè),研究表明,所提取的紫皮洋蔥低聚糖中存在二糖、三糖、四糖、六糖。同時(shí),對(duì)粗寡糖及其水解產(chǎn)物進(jìn)行HPLC分析,結(jié)果顯示,紫皮洋蔥低聚糖主要組成為蔗果低聚糖,在適宜條件下,β-呋喃果糖苷酶能較好的對(duì)其水解。粗寡糖經(jīng)Bio gel P-2凝膠柱層析后,雖然不能將紫皮洋蔥低聚糖不同聚合度的糖組分完全分開(kāi),但能對(duì)其進(jìn)行初步分離。