利用秋水仙堿誘導(dǎo)美洲黑楊2n花粉的初步研究

趙鑫聞

(遼寧省楊樹研究所，遼寧 蓋州 115200)

1 引言

黑楊派是楊柳科(Salicaceae)楊屬(PopulusL.)五大派之一，栽培利用價(jià)值極高，具有速生豐產(chǎn)、實(shí)用性強(qiáng)、無性繁殖能力強(qiáng)等特點(diǎn)，是世界楊樹人工林的重要樹種資源。[1～2]而在遼寧、吉林、內(nèi)蒙古等省區(qū)，美洲黑楊常遭遇凍害，出現(xiàn)干稍和整株死亡現(xiàn)象，遇到干旱少雨年份，生長量也大幅降低，美洲黑楊的抗逆性亟待改良。實(shí)踐證明，三倍體育種在遺傳增益、材質(zhì)改良、速生、抗逆性等方面有非常大的優(yōu)勢，是楊樹遺傳改良的1條有效途徑。

楊樹多倍體育種的主要方法有從自然界中直接選擇天然多倍體，體細(xì)胞染色體加倍，不同倍性體間雜交，天然或人工誘導(dǎo)未減數(shù)配子雜交等，現(xiàn)已利用各種方法取得了一定成就。Johnsson最早采用秋水仙堿處理歐洲山楊、美洲山楊雄花枝，取得了一些2n 花粉，然后給雌花枝授粉,均得到了三倍體植株[4]。張志毅(1992)等利用高溫和秋水仙堿處理毛新楊均獲得了2n花粉，并取得了三倍體植株；康向陽等(1996)則在掌握楊樹花粉母細(xì)胞減數(shù)分裂規(guī)律的基礎(chǔ)上，明確了決定花粉染色體加倍效果的減數(shù)分裂有效處理時(shí)期及高效獲得白楊雜種三倍體的育種技術(shù)體系[6～9]。李云等(2001)利用秋水仙堿處理白楊雌花芽，獲得13株白楊三倍體[10]；李開隆等(2006)利用秋水仙堿誘導(dǎo)大青楊2n花粉，得到了10%直徑為37.5

2 材料與方法

2.1 材料

美洲黑楊33號(hào)楊(P.deltoidescl.‘33’)雄花枝于2016年3月采集于遼寧省凌海市遼寧省楊樹研究所基因庫，用塑料膜包裹，保持潮濕，運(yùn)回后保存于低溫的苗木窖中。

2.2 方法

2.2.1 2n花粉的誘導(dǎo)

將采集的美洲黑楊雄花枝移入溫室進(jìn)行水培，分別在水培3 d、4 d、5 d時(shí)(水培2 d時(shí)花序尚未伸出鱗片，水培6 d時(shí)花序開始產(chǎn)生花粉)，利用0.3%、0.5%、0.8%的秋水仙堿溶液處理美洲黑楊雄花芽，即用微量注射器將秋水仙堿溶液注入雄花芽中，每天注射3次，每次30 ul～40 ul，兩次處理時(shí)間間隔為5 h～7 h。每種處理10～15個(gè)雄花芽，每5個(gè)雄花芽得到的混合花粉為1次重復(fù)(表1)。

表1不同水培時(shí)間利用不同濃度秋水仙堿進(jìn)行美洲黑楊2n花粉的誘導(dǎo)

濃度水培時(shí)間(d)C10.3%3C20.3%4C30.3%5C40.5%3C50.5%4C60.5%5C70.8%3C80.8%4C90.8%5

2.2.2 2n花粉的統(tǒng)計(jì)與純化

2n花粉的統(tǒng)計(jì)與純化，分別按照不同處理收集獲得的花粉，并混合均勻，每個(gè)處理取少量花粉做5個(gè)臨時(shí)涂片，每個(gè)涂片觀察5個(gè)視野，測量視野內(nèi)花粉的直徑，A1 表示花粉粒直徑d<25 μm 范圍；A2 表示25 μm50 μm。分別統(tǒng)計(jì)每個(gè)處理中獲得的各級(jí)花粉數(shù)量及所占比例并分析[11]。研究表明直徑大于37 μm 的花粉為染色體未減數(shù)的2n 花粉[5，7，17]，因此本試驗(yàn)中A3和A4級(jí)花粉為2n花粉。

3 結(jié)果與分析

3.1 不同水培時(shí)間及不同濃度秋水仙堿的誘導(dǎo)效果

將采集的美洲黑楊雄花枝移入溫室進(jìn)行水培，水培3 d后花序開始伸長，即開始進(jìn)行美洲黑楊2n花粉的誘導(dǎo)，分別在水培3 d、4 d、5 d時(shí)利用0.3%、0.5%、0.8%的秋水仙堿處理美洲黑楊雄花芽，結(jié)果顯示，水培3 d，4 d，5 d后利用0.3%，0.5%，0.8%的秋水仙堿進(jìn)行處理，均得到了一定比例的2n花粉，其中水培3 d后利用0.5%的秋水仙堿進(jìn)行處理獲得的2n花粉數(shù)量最多，獲得直徑37.5 μm

表2誘導(dǎo)美洲黑楊各級(jí)花粉數(shù)及百分率

注：A1 表示花粉粒直徑d<25 μm 范圍；A2 表示25 μm50 μm。

圖1 經(jīng)秋水仙堿處理的不同級(jí)別的美洲黑楊花粉

3.2 美洲黑楊2n花粉誘導(dǎo)方差分析

從表3方差分析結(jié)果來看，處理時(shí)間及秋水仙堿濃度對美洲黑楊2n花粉的誘導(dǎo)影響均較大，達(dá)到極顯著水平，因此在利用秋水仙堿進(jìn)行美洲黑楊大花粉的誘導(dǎo)的過程中，不僅要注意處理時(shí)間的把握，同時(shí)也要選擇合適的秋水仙堿濃度，本試驗(yàn)結(jié)果表明，水培3 d時(shí)利用0.5%的秋水仙堿溶液對美洲黑楊雄花芽進(jìn)行處理得到的2n花粉最多。

表3不同處理所得2n花粉方差分析

4 結(jié)論與討論

本試驗(yàn)研究結(jié)果表明，水培3d時(shí)利用0.5%的秋水仙堿溶液對美洲黑楊雄花芽進(jìn)行處理得到的2n花粉最多，獲得A3級(jí)(37.5 μm

據(jù)朱之悌院士觀測，毛白楊雄株花粉中，除那些扁小、空癟、無核等敗育花粉外，均可觀察到有大花粉粒的廣泛存在，并混雜在眾多的小花粉粒中，但大花粉粒直徑要超過小花粉粒1 倍以上，很容易識(shí)別；大花粉粒直徑變動(dòng)在35 μm～45 μm 之間，疑為未減數(shù)的二倍體花粉[16]。據(jù)Einspahr 和Mashkina 經(jīng)驗(yàn)，直徑大于37 μm 的花粉為染色體未減數(shù)的2n 花粉[17]。張志毅等研究表明2n 花粉粒直徑遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于正常的單倍體花粉粒，約在 37 μm 以上[5]。康向陽經(jīng)發(fā)芽鏡檢，其染色體數(shù)為38，一般的正常毛白楊單倍體花粉染色體數(shù)為19[7]。通過光學(xué)顯微鏡測定，經(jīng)過加倍處理的美洲黑楊花粉直徑通常在15 μm～45 μm 之間，因此我們要根據(jù)其花粉直徑的大小進(jìn)行分級(jí)研究，我們將直徑大于37 μm的花粉作為大花粉的標(biāo)志加以統(tǒng)計(jì)，得到的A3和A4 級(jí)花粉極有可能是2n 花粉。下一步我們將對其進(jìn)行鑒定研究。得到的2n花粉也有可能是天然大花粉，但其數(shù)量較少，而且每個(gè)處理中都有可能產(chǎn)生天然大花粉，不影響試驗(yàn)結(jié)果，因此在本試驗(yàn)中沒有設(shè)計(jì)對照。

人工誘導(dǎo)花粉染色體加倍途徑獲取楊樹多倍體是最簡潔、可靠的途徑之一[7]。利用秋水仙堿或高溫等誘導(dǎo)方法獲得的2n雌雄配子在歐洲山楊、美洲山楊、香脂楊、毛新楊、銀腺楊、青楊、大青楊等楊樹中，均已獲得三倍體植株[4-17]。楊樹多倍體植株通常在一些性狀上優(yōu)于二倍體[18]。具體表現(xiàn)在巨大性、抗性和一些生理結(jié)構(gòu)的變化，例如生長量增加、抗寒、抗旱、抗病蟲害、器官大小、成分含量等[19]。歐洲山楊( Populus tremula) 三倍體比二倍體生長快30 %[20]，材積為二倍體的1.35倍[21]。我國選育的毛白楊( P.tomentosa) 異源三倍體最優(yōu)無性系(B301)單株材積是自然二倍體的3.5倍(8a生時(shí))[18]。三倍體歐洲山楊抗干旱和瘠薄性能較其親本二倍體有明顯的優(yōu)勢，并且還有較強(qiáng)的抗病蟲害的能力[22]。實(shí)踐證明倍性育種是對楊樹進(jìn)行遺傳改良的有效途徑。