siRNA靶向沉默TrkB基因?qū)θ税螂装┘?xì)胞株T24生長和轉(zhuǎn)移的影響及其分子機制

邢增術(shù) 張 沖 劉振湘 白志明

(中南大學(xué)湘雅醫(yī)學(xué)院附屬?？卺t(yī)院泌尿外科，海南 海口 570208)

近年來研究發(fā)現(xiàn)〔1～3〕，酪氨酸激酶受體(Trk)B在某些惡性腫瘤組織中過度表達(dá)，導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞的增殖能力和侵襲轉(zhuǎn)移能力明顯提高，但其在膀胱癌增殖轉(zhuǎn)移分子機制中的具體作用國內(nèi)外未見報道。本研究探討siRNA靶向沉默TrkB基因?qū)Π螂装┘?xì)胞株T24生長和轉(zhuǎn)移的影響及其分子機制。

1 材料和方法

1.1材料 (1)細(xì)胞株：人膀胱癌T24細(xì)胞購自中國典型培養(yǎng)物保藏中心(CCTCC)。(2)主要耗材及試劑：超低黏附培養(yǎng)板購自美國Corning 公司；人重組腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(rhBDNF)購自美國R&D公司；Lipofectamin2000購自美國Invitrogen公司；委托廣州銳博生物科技有限公司設(shè)計和合成siRNAOligo；一抗和二抗均購自美國Santa Cruz 公司。

1.2細(xì)胞培養(yǎng) 將膀胱癌T24細(xì)胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清(FBS)的RPMI1640培養(yǎng)液，置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待細(xì)胞近90%融合時用胰蛋白酶消化傳代。

1.3T24細(xì)胞的siRNA轉(zhuǎn)染 TrkB(NTRK2)-siRNA1：上游5′-CCGUCACCUUGACUUGUCUTT-3′，下游5′-AGACAAGUCAAGGUGACGGTT-3′；TrkB(NTRK2)-siRNA2：上游5′-CCACGAACAGAAGUAAUGATT-3′，下游5′-UCAUUACUUCUGUUCGUGGTT-3′；TrkB(NTRK-2)-siRNA3：上游5′-GCGCUUCAGUGGUUCUAUATT-3′，下游5′-UAUAGAACCACUGAAGCGCTT-3′；陰性對照組：上游5′-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3′，下游5′-ACGUGACACGUUCGGAGAATT-3′。按Lipofectami-n2000進(jìn)行轉(zhuǎn)染，轉(zhuǎn)染后48 h檢測目的基因蛋白，選擇敲低效率最高者留作進(jìn)一步實驗。

1.4吖啶橙(AO)/溴乙啶(EB)雙染色法觀察細(xì)胞失巢凋亡情況 將轉(zhuǎn)染TrkB-siRNA的T24細(xì)胞和陰性對照細(xì)胞(轉(zhuǎn)染NT-siRNA)分別置于6孔超低黏附性培養(yǎng)板中與濃度為100 ng/ml 100 μl的rhBDNF共懸浮培養(yǎng)72 h，分別收集兩組細(xì)胞制成細(xì)胞懸液。按試劑盒說明操作后熒光顯微鏡下觀察。

1.5MTT法檢測細(xì)胞生長 于細(xì)胞對數(shù)生長期，收集轉(zhuǎn)染TrkB-siRNA的T24細(xì)胞和陰性對照細(xì)胞(轉(zhuǎn)染NT-siRNA)，分別制成細(xì)胞懸液后接種于96孔板，每孔加入濃度為100 ng/ml 100 μl的rhBDNF共培養(yǎng)。于培養(yǎng)第0、12、24、48、72、96 h時各時間點分別收獲細(xì)胞，按MTT法在酶標(biāo)儀上檢測各孔的OD值，繪制生長曲線。

1.6軟瓊脂克隆形成試驗檢測細(xì)胞克隆形成能力 分別取對數(shù)期轉(zhuǎn)染siRNA-TrkB的T24細(xì)胞和陰性對照細(xì)胞(轉(zhuǎn)染NT-siRNA)，與濃度為100 ng/ml 100 μl的rhBDNF共培養(yǎng)在制備好的軟瓊脂6孔板中10 d，計數(shù)含50個細(xì)胞以上的克隆數(shù)，計算細(xì)胞集落形成率。

1.7Transwell小室法檢測細(xì)胞侵襲能力 收集轉(zhuǎn)染TrkB-siRNA的T24細(xì)胞和陰性對照細(xì)胞(轉(zhuǎn)染NT-siRNA)，加入無血清培養(yǎng)基制成細(xì)胞懸液，接種于鋪有Matrigel基質(zhì)膠的Transwell小室上室，并加入rhBDNF；下室加入含20% FBS的RPMI1640培養(yǎng)基，培養(yǎng)24 h，棉簽擦去上室未穿膜細(xì)胞，甲醇固定再予結(jié)晶紫染色，鏡下隨機5個視野(×100)拍照并計數(shù)穿過膜的細(xì)胞數(shù)。

1.8Western印跡檢測蛋白表達(dá) 用RIPA裂解液裂解細(xì)胞蛋白，二喹啉甲酸(BCA)蛋白定量試劑盒測定蛋白濃度，經(jīng)十二烷硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)后，低溫恒壓電轉(zhuǎn)至聚偏氟乙烯(PVDF)膜上，5%脫脂奶粉封閉2 h，一抗4℃孵育過夜，加入山羊抗兔辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記的二抗，室溫下孵育1 h，電化學(xué)發(fā)光法(ECL)化學(xué)發(fā)光，與內(nèi)參β-actin比較，Image J軟件進(jìn)行定量分析。

1.9統(tǒng)計學(xué)處理 用SPSS19.0軟件進(jìn)行t檢驗或單因素方差分析。

2 結(jié) 果

2.1靶向沉默TrkB基因siRNA序列的篩選 TrkB-siRNA轉(zhuǎn)染T24細(xì)胞以敲低TrkB的表達(dá)，并通過Western印跡檢測敲低效率，選擇敲低效率最高的TrkB-siRNA3(圖1)進(jìn)行下一步實驗。

圖1 膀胱癌細(xì)胞株T24轉(zhuǎn)染NT-siRNA或siRNA-TrkB 48 h后Western印跡

2.2siRNA靶向沉默TrkB基因?qū)Π螂装┘?xì)胞株T24抗失巢凋亡能力的影響 沉默TrkB基因的T24細(xì)胞經(jīng)懸浮培養(yǎng)后大量凋亡，多個視野可見晚期凋亡細(xì)胞，核染色質(zhì)發(fā)橙紅色熒光，呈固縮或串珠狀，有時核碎裂散布于胞質(zhì)中，只有極少量正?；罴?xì)胞可見。而陰性處理組T24細(xì)胞經(jīng)懸浮培養(yǎng)后亦有細(xì)胞凋亡情況，但多個視野下可見許多正?；罴?xì)胞，核染色質(zhì)著綠色并呈正常結(jié)構(gòu)(圖2)。表明siRNA靶向沉默TrkB基因后膀胱癌T24細(xì)胞的抗失巢凋亡能力明顯下降。

圖2 NT-SiRNA T24懸浮培養(yǎng)72 h AO/EB雙染色熒光顯微鏡觀察(×400)

2.3siRNA靶向沉默TrkB基因?qū)Π螂装┘?xì)胞株T24增殖、克隆形成、遷移及侵襲能力的影響 與陰性處理組相比，靶向沉默TrkB基因后T24細(xì)胞的增殖、克隆形成、遷移及侵襲能力明顯降低，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(均P<0.05)，見圖3～6，表1。

與NT-siRNA組比較：1)P<0.05；同表1，表2圖3 沉默TrkB對膀胱癌T24細(xì)胞增殖能力的影響

組別細(xì)胞增殖率(×100%,n=10)克隆形成率(%,n=6)遷移力(劃痕愈合比,n=6)侵襲力(細(xì)胞個數(shù)/HP,n=6)NT-siRNA組5.54±0.3546.70±4.550.36±0.02101.00±11.20TrkB-siRNA組3.21±0.311)24.50±3.041)0.22±0.031)32.38±3.291)

圖4 沉默TrkB對膀胱癌T24細(xì)胞克隆形成能力的影響(×200)

圖5 沉默TrkB對膀胱癌T24細(xì)胞遷移能力的影響(×200)

圖6 沉默TrkB對膀胱癌T24細(xì)胞侵襲能力的影響(×200)

2.4siRNA靶向沉默TrkB基因?qū)Π螂装┘?xì)胞株T24磷脂酰肌醇3激酶(PI3K)-蛋白激酶B(Akt)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路活性及上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)相關(guān)蛋白的影響 與NT-siRNA組相比，靶向沉默TrkB基因后，T24細(xì)胞E-鈣黏蛋白(cadherin)的表達(dá)水平明顯提高，而N-cadherin、波形蛋白(Vimentin)表達(dá)水平明顯下降，p-Akt及EMT 相關(guān)核蛋白扭曲蛋白(Twist)、Snail、Slug表達(dá)水平顯著下降，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(均P<0.05)，見表2，圖7。

表2 siRNA靶向沉默TrkB基因?qū)Π螂装┘?xì)胞株T24 PI3K-Akt信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路活性及EMT相關(guān)蛋白的影響

圖7 沉默TrkB對T24細(xì)胞PI3K-Akt信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路及EMT相關(guān)蛋白的影響

3 討 論

膀胱癌是泌尿生殖系統(tǒng)最常見的腫瘤之一，因其具有起源多中心性，易復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移等生物學(xué)特性，經(jīng)治療后仍有30%的患者后期發(fā)生腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移，成為威脅患者生命的最重要因素〔4〕。

TrkB與其配體BDNF結(jié)合可激活多個重要信號傳導(dǎo)通路，包括PI3K-Akt途徑、絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)途徑和磷脂酶C途徑，這些信號通路與細(xì)胞凋亡、增殖和浸潤轉(zhuǎn)移關(guān)系密切〔5，6〕。特別是近來研究發(fā)現(xiàn)TrkB在多種腫瘤中高表達(dá)，提示TrkB可能作為一種原癌基因在腫瘤的發(fā)生和轉(zhuǎn)移過程中發(fā)揮重要作用〔1～3〕。本研究結(jié)果提示TrkB基因可明顯影響膀胱癌T24細(xì)胞的增殖及轉(zhuǎn)移侵襲能力。為進(jìn)一步了解TrkB影響膀胱癌T24細(xì)胞轉(zhuǎn)移侵襲能力的可能分子機制，本研究發(fā)現(xiàn)靶向沉默膀胱癌T24細(xì)胞的TrkB基因后，不僅其PI3K-Akt信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的活性下降，而且EMT受抑制，使得細(xì)胞的增殖及轉(zhuǎn)移侵襲能力明顯下降。據(jù)研究〔7，8〕，BDNF特異性與TrkB的胞外區(qū)結(jié)合后可誘導(dǎo)胞內(nèi)酪氨酸殘基磷酸化，啟動BDNF-TrkB信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，其下游的PI3K-Akt信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路隨之被激活，被磷酸化激活的Akt在下調(diào)促凋亡蛋白Bad、Bim表達(dá)的同時，上調(diào)抗凋亡蛋白Bcl-2 的表達(dá)，導(dǎo)致失巢凋亡抵抗的發(fā)生，賦予腫瘤細(xì)胞遷移到其他部位再次生長的能力。因此TrkB可激活PI3K-Akt信號通路使腫瘤細(xì)胞獲得失巢凋亡抵抗特性，從而發(fā)生轉(zhuǎn)移。EMT是大多數(shù)上皮性腫瘤發(fā)生侵襲轉(zhuǎn)移的一個極其重要的初始步驟〔9〕。研究表明〔10〕，TrkB可經(jīng)PI3K/Akt信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路激活下游EMT相關(guān)核蛋白，如Twist、Snail、Slug和ZEB1，后者與核內(nèi)E-cadherin 轉(zhuǎn)錄啟動子結(jié)合，從而下調(diào)其轉(zhuǎn)錄表達(dá)，導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞間黏附能力下降；而間充質(zhì)標(biāo)志物如N-cadherin、Vimentin表達(dá)上調(diào)，促使cadherin轉(zhuǎn)換現(xiàn)象的發(fā)生，使得腫瘤細(xì)胞的遷移能力明顯提高。這可能是上皮腫瘤發(fā)生侵襲和轉(zhuǎn)移的細(xì)胞分子生物學(xué)基礎(chǔ)。

綜上，siRNA靶向沉默TrkB基因可通過下調(diào)膀胱癌T24細(xì)胞PI3K-Akt信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的活性進(jìn)而抑制EMT，從而降低其增殖及轉(zhuǎn)移侵襲能力。本研究為膀胱癌的治療策略提供了新的依據(jù)。