促紅細胞生成素對哮喘小鼠肺組織細胞凋亡的影響

金 燦 閆 娜 池永學(xué) 金 政 蘇立明

(延邊大學(xué)附屬醫(yī)院兒科，吉林 延吉 133000)

2014年全球哮喘防治創(chuàng)議〔1〕中對哮喘更新定義，哮喘是一種異質(zhì)性疾病，以慢性氣道炎癥為特點的呼吸系統(tǒng)常見病。當(dāng)前普遍認為哮喘是由多種炎性介質(zhì)和細胞因子等參與的在細胞、分子、基因水平上發(fā)生的疾病。肺組織病理學(xué)改變有嗜酸粒細胞(EOS)浸潤、支氣管管壁痙攣、腫脹、黏液栓形成及氣道重塑等〔2〕。目前雖然出現(xiàn)了許多新型抗哮喘藥物，吸入型糖皮質(zhì)激素仍是控制哮喘發(fā)作和降低反復(fù)發(fā)生風(fēng)險的首選藥物。激素類藥物作用機制研究較多的如地塞米松，它可抑制Th0細胞向Th2細胞分化，使 Th1/Th2比例趨于平衡〔3〕，也有實驗發(fā)現(xiàn)它可通過對抑制Bcl-2的表達而調(diào)節(jié)EOS凋亡。促紅細胞生成素(EPO)是能夠促進紅細胞生成的一種激素樣物質(zhì)，具有抗炎、免疫調(diào)節(jié)、抗凋亡等作用，還能對心、腦等組織起到保護作用〔4，5〕。但EPO對肺臟作用的研究比較少見，尤其是對哮喘的研究。本實驗旨在觀察EPO對遲發(fā)型哮喘模型中兩種細胞因子、肺組織、細胞凋亡的影響及其可能機制。

1 材料與方法

1.1實驗動物 延邊大學(xué)醫(yī)學(xué)院動物中心提供的SPF級昆明小鼠(雌性)40只，6～8周齡，體重(20±2)g。

1.2試劑 雞卵清蛋白(OVA，美國Sigma公司)，液態(tài)氫氧化鋁 (德國Thermo公司)，重組人EPO(沈陽三生制藥有限責(zé)任公司)，地塞米松磷酸鈉注射液(山西晉新雙鶴藥業(yè)有限責(zé)任公司)，白細胞介素(IL)-4及IL-5試劑盒(北京奇松生物科技有限公司)，轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)的三磷酸脫氧鳥苷-生物素刻痕末端標(biāo)記(TUNEL)細胞凋亡原位檢測試劑盒(南京碧波生物科技有限公司)，Bax、Bcl-2和Caspase-3抗體(Santa Cruz Biotechnology公司)。

1.3儀器 空氣壓縮式霧化器PARI (德國百瑞有限公司)，顯微鏡系統(tǒng) BX51 (日本奧林巴斯公司)，酶標(biāo)儀PT-3502G (北京普天新橋技術(shù)有限公司)。

1.4制備哮喘小鼠模型 小鼠40只隨機分為正常對照(A)組、哮喘模型(B)組、EPO低濃度(C)組、EPO高濃度(D)組和地塞米松(E)組，8只/組。B組利用OVA 20 μg+氫氧化鋁2 mg分別于第1、8、15天行腹腔注射，在第22天將小鼠置于封閉玻璃缸中通過空氣壓縮泵霧化吸入3%OVA，30 min/次，1次/d，連續(xù)7 d。A組用生理鹽水取代OVA進行攻擊，頻率、時間同上。C、D、E組于第22天起每次霧化吸入前30 min給藥連續(xù)治療1 w(C組EPO 500 IU/kg、D組EPO 1 000 IU/kg、E組地塞米松1 mg/kg，均腹腔注射)。攻擊結(jié)束1 w后對B、C、D、E組再次給予3%OVA(A組用生理鹽水)做最后1次激發(fā)。

1.5血清IL-4和IL-5測定 各組分別于末次攻擊24 h后，乙醚麻醉處死，摘眼球取血2～3 ml，離心1 200 r/min，取上清，應(yīng)用酶聯(lián)免疫吸附實驗測定血清中IL-4和IL-5水平。具體操作步驟嚴格按照說明書進行。

1.6取肺組織 沿氣管切開，取右肺，用4%多聚甲醛固定24 h以上，脫水，透明，滲透，包埋，切片，蘇木精-伊紅(HE)染色和TUNEL染色備用。

1.7HE染色 將肺組織切片，預(yù)熱，融化，脫蠟，染色，透明，固定，形成切片。

1.8TUNEL細胞凋亡原位檢測 石蠟切片脫蠟、水合，乙醇水合，處理好后浸入磷酸鹽緩沖液(PBS)漂洗，加入蛋白酶K工作液，室溫混合作用30 min。浸置PBS中漂洗，浸入封閉液，室溫下10 min，PBS漂洗，濾紙吸干，加TdT酶反應(yīng)液，于37℃中避光濕潤60 min，熒光膠封片，鏡下觀察，激發(fā)波長450～500 nm，發(fā)射波長515～565 nm。計算5個高倍鏡下(×200)凋亡細胞數(shù)，每百個細胞中的凋亡細胞數(shù)表示凋亡指數(shù)，每組取平均值。

1.9Western印跡法檢測凋亡蛋白 蛋白的提?。簩⒎谓M織置于液氮5 s，敲碎組織，稱重5倍體積細胞裂解液+10 μl苯甲基磺酰氟(PMSF)，組織勻漿，沸水水浴5 min，冰上2 min，4℃13 000 r/min離心10 min，取上清。工作液配制、制標(biāo)準(zhǔn)曲線、Excel計算。制膠、灌膠、上樣。電泳，轉(zhuǎn)膜，封閉，加Bax、Bcl-2和caspase-3一抗，加二抗，顯影、拍照，應(yīng)用Quantity One 蛋白灰度分析軟件完成。

1.10統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS16.0軟件行單因素方差分析、LSD-t檢驗。

2 結(jié) 果

2.1哮喘模型的鑒定 A組體重自然增加，其余4組腹腔注射及霧化吸入后逐漸出現(xiàn)呼吸急促、煩躁、撓鼻子、大小便失禁等癥狀，伴精神差、活動少、進食及飲水減少等；癥狀表現(xiàn)的嚴重程度上看，B組表現(xiàn)最重，持續(xù)時間最長，C、D、E組癥狀明顯減輕。

2.2血清中IL-4和IL-5的水平比較 與A組比，B和C組IL-4和IL-5水平均明顯提高(P<0.05)，D和E組無顯著差異(P>0.05)；與B組比，D和E組IL-4和IL-5水平明顯降低 (P<0.05)，C組無顯著差異(P>0.05)；與E組比，C組IL-4和IL-5水平明顯提高(P<0.05)，見表1。

表1 各組IL-4和IL-5水平比較

與A組比：1)P<0.05；與B組比：2)P<0.05；與E組比：3)P<0.05，下表同

2.3HE染色鏡下肺組織的病理形態(tài)觀察 A組氣管管腔光滑，黏膜上皮完整、無水腫，肺泡間隔正常，偶見EOS浸潤；B組氣管黏膜損傷嚴重，充血、水腫、基底層增厚，肺泡壁及肺泡腔內(nèi)可見大量炎性細胞浸潤，E、D組明顯增多；C組氣管黏膜可見充血、水腫，基底層仍厚，但氣管周圍炎癥細胞浸潤較B組略有減輕；D組氣管黏膜充血、水腫不明顯，基底層略增厚，炎癥細胞明顯減少；E組氣管黏膜接近正常，基底層略增厚，少量炎癥細胞浸潤。見圖1。

2.4TUNEL法原位細胞凋亡檢測 與A組〔(3.98±1.36)%〕比，B、C、D和E組凋亡指數(shù)〔(7.03±1.02)%、(11.68±2.98)%、(17.24±3.05)%、(20.31±3.73)%〕均明顯提高(P<0.05)。與B組比，C、D和E組凋亡指數(shù)均明顯升高(P<0.05)，見圖2。

圖1 各組肺組織HE染色結(jié)果(×200)

2.5各組Bax、Bcl-2、Caspase-3凋亡蛋白表達 與A組比，B、C、D和E組Bax均明顯升高(t=46.94、29.14、26.43、23.50，均P<0.05)；與B組比，C、D、E組Bax明顯降低(t=29.07、51.70、72.77，均P<0.05)。與A組比，B、C、D、E組Bcl-2明顯降低(t=77.79、8.94、16.32、14.35，P<0.05)；與B組比，C、D、E組Bcl-2明顯升高(t=27.34、26.14、4.87，均P<0.05)；與A組比，B、C、D和E組Caspase-3明顯升高(t=35.70、50.50、38.52、13.50，均P<0.05)；與B組比，C、D、E組Caspase-3明顯降低(t=10.25、17.81、22.61，均P<0.05)。與A組比，B、C、D、E組Bax/Bcl-2明顯升高(t=279.43、135.48、171.52、141.23，均P<0.05)；與B組比，C、D、E組Bax/Bcl-2明顯降低 (t=52.32、78.94、41.52，均P<0.05)，見圖3和表2。

組別Bax/β-actinBcl-2/β-actinCaspase-3/β-actinBax/Bcl-2A組0.113±0.0110.876±0.0130.109±0.0750.129±0.012B組0.914±0.0471)0.309±0.0061)1.103±0.0241)2.958±0.0261)C組0.375±0.0231)2)3)0.451±0.0421)2)3)0.403±0.0311)2)3)0.831±0.0361)2)3)D組0.453±0.0151)2)3)0.531±0.0351)2)3)0.611±0.0271)2)3)0.853±0.0231)2)3)E組0.513±0.0111)2)0.733±0.0821)2)0.834±0.0511)2)0.700±0.0371)2)

3 討 論

目前哮喘的診療指南中，糖皮質(zhì)激素仍是控制哮喘急性發(fā)作和降低反復(fù)發(fā)生風(fēng)險的關(guān)鍵藥物。它可抑制炎癥細胞的遷移和活化、細胞因子的生成、炎癥介質(zhì)的釋放、增強平滑肌細胞β2受體的反應(yīng)性等，但需要長期規(guī)律使用，機體會逐漸產(chǎn)生糖皮質(zhì)激素的劑量依賴，誘發(fā)糖尿病等嚴重的不良反應(yīng)。支氣管哮喘遲發(fā)相反應(yīng)(LAR)病理基礎(chǔ)使肺組織中EOS明顯升高、凋亡延遲〔6〕，促凋亡和抗凋亡機制的不平衡是EOS凋亡延遲的根源?？笶OS凋亡延遲已經(jīng)成為哮喘治療的新思路。EPO是一種糖蛋白激素，主要調(diào)節(jié)和維持循環(huán)中紅細胞生理水平。EPO主要由肝臟和腎臟合成分泌，嬰幼兒時期主要由肝臟合成，成年后主要由腎臟合成。它是能有效地為組織供氧的細胞因子。早期主要用于促紅細胞生成而治療貧血。近年來，研究發(fā)現(xiàn)，EPO還具有神經(jīng)保護、抗凋亡、促進血管生成和控制炎癥反應(yīng)等作用，故被認為是一種具有多器官保護功能的因子〔7〕。目前研究凋亡基因的控制與調(diào)節(jié)大致分為3類，第1類是凋亡抑制基因如Bcl-2家族，第2類是凋亡促進基因如Bax，第3類是凋亡效應(yīng)基因Caspase等。有動物實驗證實，EPO可能調(diào)節(jié)Bax/Bcl-2比值對小膠質(zhì)細胞起到抗凋亡的作用〔8〕。重組人(rHu)EPO具備了EPO相似的生物學(xué)活性，現(xiàn)已廣泛用于臨床中。rHuEPO在新生兒尤其是早產(chǎn)兒及其他原因所致的貧血中，可用于升高紅細胞數(shù)量，促進細胞免疫功能，治療貧血，直接減少了輸血比例，改善疾病預(yù)后。動物實驗〔9〕對EPO和地塞米松在慢性哮喘模型中的作用進行比較，EPO可以減輕哮喘的炎癥反應(yīng)。

哮喘發(fā)生的主要免疫機制目前已得到公認：即Th1/Th2亞群細胞數(shù)量上的失衡和細胞功能的紊亂，尤其哮喘中以Th2細胞數(shù)目增多和功能亢進較為多見。哮喘的發(fā)生與過敏原特異性Th2優(yōu)勢應(yīng)答相關(guān)〔10〕，Th2能分泌的細胞因子有IL-4，IL-5，IL-10和巨噬細胞集落刺激因子等，發(fā)揮著體液免疫的功能。許多研究發(fā)現(xiàn)哮喘患者血液中的IL-4顯著升高，IL-4可促進EOS、肥大細胞等細胞的增殖及分化，EOS顯著增多。IL-4是非IL-5依賴機制的重要炎癥因子〔11〕，IL-5是由Th2分泌的細胞因子，與其受體結(jié)合，對EOS的聚集、活化、趨化、增殖等起關(guān)鍵作用。IL-5還為EOS釋放的骨髓細胞提供信號，促進骨髓細胞的終末分化，抑制EOS凋亡，提高EOS生存能力〔12〕。支氣管黏膜內(nèi)EOS的聚集增多是哮喘的一個重要標(biāo)志，激活后的EOS發(fā)生聚集、活化，并釋放一系列的炎癥因子，引起組織的水腫、損傷和氣道高反應(yīng)性等。IL-5是氣道炎癥的關(guān)鍵性調(diào)節(jié)因子，且與哮喘的嚴重度相關(guān)。IL-4與IL-5構(gòu)成了EOS增多的主要兩大機制。

細胞凋亡可促進炎癥的消退和組織更新等。EOS是哮喘氣道炎癥中主要的效應(yīng)細胞〔13〕。本研究可見EPO可促進遲發(fā)型哮喘模型肺組織細胞凋亡，HE染色結(jié)果也佐證了上述結(jié)果。

Bax和Bcl-2是目前研究細胞凋亡較多的基因，這兩對基因是哺乳類動物細胞凋亡的一對主要調(diào)控基因，Bcl-2基因包含多個同源物，其蛋白主要通過凋亡途徑的阻斷，抑制細胞凋亡的信息傳輸系統(tǒng)，延長細胞的存活；而Bax則是促凋亡基因中的一種，產(chǎn)生可拮抗Bcl-2的影響，兩個基因比值的增減更有利于評價細胞凋亡的趨勢。本實驗顯示EPO和地塞米松可下調(diào)Bax/Bcl-2的比值促進細胞凋亡。目前已知的2條凋亡途徑：外源性途徑：腫瘤壞死因子(TNF)受體家族成員參與通過Caspase-8活化，內(nèi)源性途徑即細胞色素C參與Caspase-9活化，最終引起Caspase級聯(lián)反應(yīng)。Caspase-3和Caspase-7是最終激活下游的效應(yīng)因子，引起細胞發(fā)生凋亡。Caspase家族在細胞凋亡中扮演重要角色。本實驗中遲發(fā)型哮喘時肺組織Caspase-3表達增多，EPO和地塞米松可降低Caspase-3表達。Bax、Bcl-2、Caspase-3三種蛋白在遲發(fā)型哮喘模型的肺組織中呈陽性表達；EPO可能通過下調(diào)Bax/Bcl-2的比例，降低Caspase-3的表達促進肺組織細胞凋亡。

綜上，應(yīng)用EPO后哮喘小鼠肺組織病理炎性浸潤明顯減輕，其機制可能是：EPO抑制IL-4、IL-5的表達、下調(diào)Bax/Bcl-2的比例，降低Caspase-3的表達促進EOS凋亡。