氯喹通過Akt/PI3K和PKC信號通路促進GLUT4轉(zhuǎn)運

宋冠軍 趙平 周琦

【摘要】目的 尋找能有效治療糖尿病的新藥物。方法 在熒光蛋白IRAP-mOrange穩(wěn)定表達的L6細胞內(nèi)，使用激光共聚焦顯微鏡監(jiān)測氯喹作用下GLUT4（葡萄糖轉(zhuǎn)位蛋白4）的轉(zhuǎn)位和細胞內(nèi)Ca2+水平的變化。結(jié)果 氯喹對L6細胞GLUT4轉(zhuǎn)位有顯著的促進作用。G?6983（PKC的抑制劑）和Wortmannin（PI3K的抑制劑）能夠抑制氯喹誘導的GLUT4轉(zhuǎn)位上膜。同時，Wortmannin能夠降低氯喹刺激的L6細胞內(nèi)Ca2+的增加，然而G?6983則對氯喹引起的L6細胞內(nèi)Ca2+的增加沒有影響。結(jié)論 氯喹通過Akt/PI3K和PKC通路增強L6細胞內(nèi)GLUT4轉(zhuǎn)運。同時，它誘導的胞內(nèi)Ca2+的增加能促進GLUT4與細胞質(zhì)膜的融合。氯喹可能具備開發(fā)成一種新的降血糖藥物的潛力。

【關(guān)鍵詞】氯喹；L6細胞；葡萄糖轉(zhuǎn)位蛋白4；激光共聚焦顯微鏡

【中圖分類號】R587.1 【文獻標識碼】B 【文章編號】ISSN.2095-6681.2018.15..02

二型糖尿病是一種非胰島素依賴性的糖尿病?，F(xiàn)在90%以上的糖尿病都是二型糖尿病[1]。對于二型糖尿病的治療，注射胰島素并不能很好的控制病情，甚至可能使病情加重，因此，尋找能從根本上治療二型糖尿病的藥物就更為重要。

許多味道苦的物質(zhì)都體現(xiàn)了其較好的抗糖作用[2]。例如苦瓜[3]，小檗堿[4]，這些苦物質(zhì)通常都可以用來清熱降火。作為苦物質(zhì)的代表——氯喹，最初是用來治療瘧疾的藥物。隨著研究的深入，它的許多其他的作用也不斷被科學家們發(fā)現(xiàn)。早在1991年時，就有科學家指出，氯喹可以增加胰島素的作用來促進葡萄糖的攝取，但其具體的作用機制目前仍不清楚。

GLUT4是在骨骼肌葡萄糖代謝中一個非常重要的葡萄糖轉(zhuǎn)運體[5]，在本研究中，我們主要以GLUT4作為藥物研究的一個靶點，研究氯喹對L6細胞內(nèi)GLUT4轉(zhuǎn)位的影響并嘗試進一步研究它的作用機理。

1 材料與方法

1.1 實驗對象

穩(wěn)定表達轉(zhuǎn)染了紅色熒光蛋白IRAP-mOrange的L6細胞：IRAP-mOrange-L6。

1.2 抗體及阻斷劑

Wortmannin（Sigma），G?6983（EMD Millipore），F(xiàn)luo-4 AM（Camarillo，CA，USA）。

1.3 細胞生理溶液

PSS生理鹽溶液（含2mM的Ca2+）（mM）：135 NaCl，5 KCl，1 MgCl2，2 CaCl2，10 HEPES，10 glucose，用NaOH調(diào)PH=7.4。

1.4 實驗方法

1.4.1 利用激光共聚焦顯微鏡監(jiān)測L6細胞GLUT4轉(zhuǎn)位

之前有研究證明，受胰島素調(diào)節(jié)的氨基肽酶IRAP和GLUT4蛋白存在高度共定位關(guān)系，同時，許多實驗已證明IRAP能夠作為一種報告分子反映GLUT4的轉(zhuǎn)運狀況。借助這一機理，通過L6細胞質(zhì)膜上IRAP-mOrange熒光強度的動態(tài)變化，我們能夠間接地檢測GLUT4蛋白轉(zhuǎn)位的變化，首先，我們將IRAP-mOrange-L6細胞接種在無菌蓋玻片上，放回于培養(yǎng)箱中過夜培養(yǎng)使其貼壁。然后用不含血清的α-MEM培養(yǎng)液饑餓細胞2 h，再用配好的PSS溶液清洗。之后，將細胞放在激光掃描共聚焦顯微鏡下，加入1 mM氯喹，在555 nm激發(fā)波長下觀測IRAP-mOrang熒光的變化。加藥后，每5分鐘拍一張照片共拍5個循環(huán)，一直拍照記錄到加藥后的30 min。記錄數(shù)據(jù)并利用Origin軟件進行分析。

1.4.2 利用激光共聚焦顯微鏡監(jiān)測L6細胞內(nèi)的Ca2+水平

饑餓細胞之前的步驟同檢測IRAP相同。用PSS溶液洗掉沒有血清的α-MEM培養(yǎng)液后。利用2 mM的Fluo-4 AM在室溫下避光孵育L6細胞20 min，將細胞內(nèi)鈣離子標記上綠色熒光，接下來用溫浴后的PSS溶液將Fluo-4 AM洗去，在激光共聚焦顯微鏡下，在488 nm激發(fā)波長下觀察L6細胞中綠色熒光強度的變化。記錄數(shù)據(jù)并分析，繪制折線圖反映細胞中Fluo-4的熒光強度變化。

2 結(jié) 果

2.1 氯喹促進GLUT4的轉(zhuǎn)運上膜

我們通過檢測L6細胞中IRAP紅色熒光蛋白（IRAP-mOrange）來反映GLUT4在細胞膜上的定位。隨著氯喹的加入，可以觀察到L6細胞膜上的紅色熒光越來越明顯（圖2.1A）。數(shù)據(jù)分析發(fā)現(xiàn)加入1mM的氯喹后L6細胞膜上的熒光強度與加藥前相比顯著升高（圖2.1B）。

（A）通過confocal觀察在L6細胞中穩(wěn)定表達的IRAP紅色熒光蛋白，隨著氯喹的加入，IRAP在細胞膜上的熒光強度明顯的增強。圖中比例尺=50 μm。（B）對L6細胞膜上的IRAP-mOrange熒光強度進行統(tǒng)計，發(fā)現(xiàn)在加入1mM的氯喹后的30 min內(nèi)，L6細胞膜上的IRAP-mOrange熒光強度保持顯著的增強。

2.2 氯喹可以通過Akt/PI3K信號通路來增強GLUT4的轉(zhuǎn)運

我們利用Akt/PI3K阻斷劑wortmannin（100 nM）作用細胞30 min，我們發(fā)現(xiàn)wortmannin對氯喹引起的Ca2+的增加起到了一定的抑制作用（圖2.2下），但具體的作用機制還有待我們進一步實驗和探討。另外，wortmannin抑制了L6細胞中氯喹刺激的IRAP熒光強度的增加（圖2.2上）。這證明氯喹確實可以通過Akt通路來刺激GLUT4的轉(zhuǎn)運，進而促進葡萄糖的吸收。

wortmannin抑制了GLUT4到細胞膜的轉(zhuǎn)運（上）。同時，wortmannin也明顯的降低了氯喹刺激的Ca2+的升高（下）。***：P<0.001。該實驗證明Akt/PI3K確實參與了氯喹刺激的GLUT4的轉(zhuǎn)運。

2.3 氯喹可以通過PKC信號通路來增強GLUT4的轉(zhuǎn)運

接下來，我們用PKC的抑制劑G?6983（10 ?M）作用L6細胞30 min后，加入1mM氯喹之后用激光共聚焦顯微鏡監(jiān)測L6細胞中IRAP-mOrange的熒光強度。結(jié)果表明G?6983顯著抑制了氯喹引起的GLUT4的轉(zhuǎn)位（圖2.3上）；同時，G?6983對氯喹引起的Ca2+的增加沒有影響（圖2.3下）。這個實驗證明PKC參與了氯喹誘導的GLUT4的轉(zhuǎn)運。

與正常細胞相比，G?6983明顯的抑制了GLUT4到細胞膜的轉(zhuǎn)運（上）；然而卻沒有減少氯喹刺激的L6細胞內(nèi)Ca2+的增加（下）。***：P<0.001。

3 討 論

有報道稱氯喹可以增強胰島素抵抗病人中葡萄糖的攝取[6]。然而，對于氯喹抗糖機制以及其相對應(yīng)的機制仍不清楚。本課題就針對氯喹在治療二型糖尿病方面的潛在作用機制進行了研究。

實驗中，我們發(fā)現(xiàn)氯喹可以促進GLUT4的轉(zhuǎn)運上膜，為了進一步研究其作用機制。我們分別用wortmannin和G?6983處理L6細胞，發(fā)現(xiàn)wortmannin能抑制氯喹引起的GLUT4轉(zhuǎn)運的增加和胞內(nèi)Ca2+的增加，而G?6983顯著抑制了氯喹引起的GLUT4的轉(zhuǎn)位，但對氯喹引起的Ca2+的增加沒影響。證明氯喹是通過Akt/PI3K和PKC信號通路增強L6細胞內(nèi)GLUT4轉(zhuǎn)運。同時，氯喹能通過Akt/PI3K信號通路促進胞內(nèi)Ca2+的增加，結(jié)合之前報道，氯喹誘導的胞內(nèi)Ca2+的增加能促進L6細胞內(nèi)GLUT4與細胞質(zhì)膜的融合[7]。這些結(jié)果說明氯喹可能開發(fā)為一種新的潛在的降血糖藥物。當然，我們的研究也存在著不足。我們目前缺乏氯喹在動物實驗上的數(shù)據(jù)。未來我們將通過獲得不同類型的二型糖尿病小鼠，直接觀測藥物對其血糖以及生命活動的影響，從而進一步確認氯喹的可靠性與安全性。

參考文獻

[1] Reimann M，Bonifacio E，Solimena M，et al.An update on preventive and regenerative therapies in diabetes mellitus[J].Pharmacol Ther，2009，121：317-331.

[2] Turner N，Li JY，Gosby A，et al.Berberine and its more biologically available derivative，dihydroberberine，inhibit mitochondrial respiratory complex I：a mechanism for the action of berberine to activate AMP-activated protein kinase and improve insulin action[J].Diabetes，2008，57（5）：1414-1418.

[3] Tan MJ，Ye JM，Turner N，et al.Antidiabetic activities of triterpenoids isolated from bitter melon associated with activation of the AMPK pathway[J].Chem Biol，2008，15（3）：263-273.

[4] Cheng Z，Pang T，Gu M，et al.Berberine-stimulated glucose uptake in L6 myotubes involves both AMPK and p38 MAPK.Biochim Biophys Acta，2006，1760：1682-1689.

[5] Shih CC，Lin CH，Lin WL，et al.Momordica charantia extract on insulin resistance and the skeletal muscle GLUT4 protein in fructose-fed rats[J].J Ethnopharmacol，2009，123（1）：82-90.

[6] Powrie JK，Smith GD，Shojaee-Moradie F，et al.Mode of action of chloroquine in patients with non-insulin-dependent diabetes mellitus[J].Am J Physiol，1991，260（6 Pt 1）：E897-904.

[7] Zhou Q，Yang X，Xiong M，et al.Chloroquine Increases Glucose Uptake via Enhancing GLUT4 Translocation and Fusion with the Plasma Membrane in L6 Cells.Cell Physiol Biochem，2016，38：2030-2040.

本文編輯：王雨辰