全隔離三維介電泳微粒分選芯片的設(shè)計(jì)及驗(yàn)證

冀秀敏,潘 暕,周 嘉

(復(fù)旦大學(xué) 專用集成電路與系統(tǒng)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,上海 200433)

片上實(shí)驗(yàn)室(Lab-on-chip, LOC)旨在開發(fā)一個(gè)集成有多種功能的平臺(tái).該平臺(tái)主要應(yīng)用于化學(xué)或生物的分析,其中微?；蚣?xì)胞的分選是基本功能之一.目前已經(jīng)有多種技術(shù)被應(yīng)用于微粒分選中.傳統(tǒng)的微粒/細(xì)胞分選技術(shù),如熒光激活細(xì)胞分選(Fluorescence-activated Cell Sorting, FACS)[1]和磁激活細(xì)胞分選(Magnetic-activated Cell Sorting, MACS)[2],具有高的分選效率,但同時(shí)也需要昂貴的設(shè)備、專業(yè)的操作人員以及特殊處理的樣本,因此不符合便攜式與實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)的要求.微流體分選技術(shù)所需樣本量少,操作簡(jiǎn)單,因此得到了廣泛的關(guān)注.介電泳(Dielectrophoresis, DEP)具有主動(dòng)、無創(chuàng)傷、無標(biāo)記分選的優(yōu)勢(shì),它依據(jù)微粒的物理特性,如形狀與尺寸,流體與微粒的電場(chǎng)特性以及外加非均勻電場(chǎng)的強(qiáng)度與頻率等都可以實(shí)現(xiàn)分選[3],因而得到廣泛的研究和關(guān)注.除了可極化的微粒,介電泳技術(shù)還可以用于聚苯乙烯微粒[4]、細(xì)胞[5]、脫氧核糖核酸(Deoxyribonucleic Acid, DNA)[6]、蛋白質(zhì)[7]、細(xì)菌[8]等物質(zhì)的操控.目前介電泳芯片已經(jīng)成功應(yīng)用于微?；蚣?xì)胞的分選[9]、吸附[10]、分離[11]、富集[12]及運(yùn)輸[13]等.

介電泳芯片由電極和微流道組成,由于非均勻電場(chǎng)主要由電極的結(jié)構(gòu)、位置決定,因此電極設(shè)計(jì)對(duì)于實(shí)現(xiàn)微粒的分選至關(guān)重要.在過去的十幾年中,介電泳電極經(jīng)歷了從二維結(jié)構(gòu)到三維結(jié)構(gòu)的變遷.二維電極,如平面電極[14],通常位于微流道的底部,在微流道的高度方向上形成垂直的非均勻電場(chǎng).由于電場(chǎng)隨著與電極表面的距離的增加呈指數(shù)性衰減,在遠(yuǎn)離電極表面的區(qū)域的微粒將可能不會(huì)受到介電泳力的作用,形成驅(qū)動(dòng)“死區(qū)”,因此平面電極的介電泳芯片限制了微流道的高度尺寸,通量較小.為解決微粒驅(qū)動(dòng)“死區(qū)”的問題,三維電極漸漸成為研究熱點(diǎn),如雙平面電極[15]、碳化的環(huán)氧基紫外負(fù)性光刻膠電極[16]、電鍍的金屬電極[17]、重?fù)诫s的硅電極[18]、銀漿摻雜的聚二甲基硅氧烷(Polydimethylsiloxane, PDMS)電極[19]等.三維電極與微流道的高度相同,在微流道的每個(gè)高度形成相同的非均勻電場(chǎng)的分布,對(duì)于實(shí)現(xiàn)高通量的微粒分選提供了可能性.然而,目前所報(bào)道的三維電極通常位于微流道內(nèi)部或者側(cè)壁,與流體直接接觸.因此,流體對(duì)電極的玷污以及電極表面強(qiáng)電場(chǎng)對(duì)生物樣本活性的損傷是不可避免的[20-21].

本文提出與集成電路(Integrated Circuit, IC)工藝兼容的三維電極的介電泳芯片模型,芯片中的電極與流體完全隔離.在COMSOL軟件中建立該模型,模擬了介電泳芯片在外加交變電場(chǎng)時(shí)的微粒分選效果,并在實(shí)驗(yàn)中驗(yàn)證了芯片在外加交變電場(chǎng)時(shí)微粒分選功能.

1 模型與原理

1.1 芯片模型

介電泳芯片由微流道和三維電極陣列組成,電極結(jié)構(gòu)及微流道的尺寸如圖1所示.微流道結(jié)構(gòu)中包括1個(gè)微粒入口Inlet 2, 1個(gè)緩沖液入口Inlet 1,以及2個(gè)出口Outlet 1/Outlet 2.微流道側(cè)壁附近排列有30個(gè)銅電極,電極與微流道之間通過30μm的硅間隙完全隔離,避免了流體對(duì)電極的污染.

圖1 介電泳芯片模型Fig.1 DEP chip model

緩沖液從Inlet 1中注入,推動(dòng)微粒沿著靠近電極的微流道一側(cè)運(yùn)動(dòng).未加電場(chǎng)時(shí),微粒溶液從Outlet 2中流出.當(dāng)外加直流電場(chǎng)或者交變電場(chǎng)時(shí),大粒子在負(fù)介電泳力的作用下從Outlet 1中流出,小粒子則仍從Outlet 2中流出,因此本文主要關(guān)注的是大粒子在負(fù)介電泳力作用下的運(yùn)動(dòng)情況.在之后的仿真以及實(shí)驗(yàn)中,我們選取直徑為10μm的微粒作為研究對(duì)象.

1.2 理論背景

微粒所受的介電泳力的大小和性質(zhì)與多種參數(shù)有關(guān).對(duì)于半徑為r球型的微粒,微粒所受的介電泳力為：

(1)

其中：εm是緩沖液的介電常數(shù)；是外加電場(chǎng)電平有效值平方的梯度；Erms是外加電場(chǎng)電平E的有效值,是克勞修斯莫索夫(Clausius-Mossotti, CM)因子,其中ω=2πf,f是外加電場(chǎng)的頻率.CM因子是微粒和緩沖液的復(fù)介電常數(shù)的函數(shù),CM因子的表達(dá)式為：

(2)

其中復(fù)介電常數(shù)ε*=ε-iσ/ω，ε為介電常數(shù),σ是電導(dǎo)率.

2 模型仿真

介電泳的微粒分選是多種物理場(chǎng)共同作用的結(jié)果,如流體力學(xué)、電場(chǎng)等.在COMSOL仿真軟件中建立芯片模型,并利用其中的多物理場(chǎng)模型對(duì)芯片的微粒分選性能進(jìn)行了有限元仿真.在COMSOL仿真軟件中,我們使用的多物理場(chǎng)有層流模塊(Laminar Flow),電流模型(Electric Currents)以及粒子追蹤模塊(Particle Tracing).在芯片電極上施加交變電場(chǎng)信號(hào),模擬了交流介電泳(Alternating Current Dielectrophoresis, AC-DEP)對(duì)10μm微粒的分選性能.

交變電場(chǎng)常被應(yīng)用于介電泳芯片中非均勻電場(chǎng)的產(chǎn)生.表1為AC-DEP對(duì)10μm微粒分選的仿真結(jié)果.由表1(見第464頁)可知,微粒所受介電泳力大小,不僅與流體電導(dǎo)率、流速、電場(chǎng)強(qiáng)度平方梯度有關(guān),還與交變電場(chǎng)的頻率有關(guān).在AC-DEP中,臨界分選電壓僅在十伏量級(jí),最大電場(chǎng)平方梯度在1015V2/m3以上.當(dāng)微粒與緩沖液的流速均為1μL/min,流體電導(dǎo)率為18μS/cm時(shí),微粒的臨界分選電壓為15V.

介電泳力隨交變電場(chǎng)頻率的變化稱為頻率特性,主要由CM因子體現(xiàn).當(dāng)CM因子的實(shí)數(shù)部為負(fù)數(shù)時(shí),表示微粒受到負(fù)介電泳力作用；若CM因子的實(shí)數(shù)部為正數(shù),則微粒受到正介電泳力作用.圖2為0～3MHz范圍內(nèi)CM因子實(shí)數(shù)部的變化曲線.在0～3MHz范圍內(nèi)CM因子的實(shí)數(shù)部始終為負(fù)數(shù),因此10μm微粒受到負(fù)介電泳力的作用.

表1 AC-DEP仿真結(jié)果

圖3為當(dāng)微粒與緩沖液的流速均為1μL/min,流體電導(dǎo)率為18μS/cm,外加電平有效值為20Vrms的不同頻率的交變電場(chǎng)時(shí),10μm微粒在負(fù)介電泳力的作用下的運(yùn)動(dòng)軌跡.圖中橫縱坐標(biāo)分別代表模型的長(zhǎng)度和寬度.入口和出口分別位于X>2000μm和X<-2000μm的位置處.出口Outlet 1/Outlet 2以及入口Inlet 1/Inlet 2分別標(biāo)識(shí)于坐標(biāo)軸上.由圖3可知,當(dāng)頻率小于100kHz時(shí),微粒的運(yùn)動(dòng)軌跡重疊,說明當(dāng)外加交變電場(chǎng)的頻率小于100kHz時(shí),10μm微粒所受介電泳作用相同；當(dāng)頻率大于100kHz時(shí),隨頻率的增加,微粒的運(yùn)動(dòng)軌跡向Outlet 2靠近,即微粒所受負(fù)介電泳作用降低.且只有當(dāng)頻率小于2MHz時(shí),全部的10μm微粒從Outlet 1中流出.因此,本芯片中的有效微粒分選頻率應(yīng)該位于0.1～2MHz之間.

圖2 電場(chǎng)頻率對(duì)CM因子的影響Fig.2 Effect of electric field frequency on CM factor

圖3 10μm微粒在不同頻率的交變電場(chǎng)作用下的運(yùn)動(dòng)軌跡率Fig.3 10μm particle trajectories varying with frequency under AC

3 實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證

圖4 制備完成的介電泳芯片F(xiàn)ig.4 The fabricated DEP chip

利用集成電路工藝制備完成了硅襯底的介電泳芯片.具體的工藝流程為： 通過光刻和深槽刻蝕在硅襯底上刻蝕出三維電極槽.之后,在電極槽中淀積銅金屬薄膜,其功能等效于三維電極的立體結(jié)構(gòu).再次光刻以及刻蝕出與電極槽相同深度的微流道.最后將硅襯底結(jié)構(gòu)與聚二甲基硅氧烷(Polydimethylsiloxane, PDMS)鍵合,完成芯片的制備.介電泳芯片與定制的印刷電路板(Printed Circuit Board, PCB)封裝,可用于測(cè)試的介電泳芯片如圖4所示.介電泳芯片中包含30個(gè)電極,相鄰電極為一組,形成兩級(jí)加電模式.

3.1 樣本處理

實(shí)驗(yàn)中選取飛世爾公司9.9μm的聚苯乙烯微粒(G1000, Thermo Scientific., USA)為研究對(duì)象.并由去離子水和抗膠凝助劑(Tween 20, Aesar., China)調(diào)制出電導(dǎo)率為18μS/cm的緩沖液.將聚苯乙烯微粒原液加入緩沖液中構(gòu)成微粒溶液.在測(cè)試之前,緩沖液和微粒溶液都需要在超聲儀中超聲5min,以保證緩沖液和微粒溶液中的各相混合均勻.

3.2 測(cè)試系統(tǒng)

將制備完成的芯片置于顯微鏡(307-143003, ERNST LEITZ WETZLAR GMBH., Germany)的載物臺(tái)上,并通過安裝于顯微鏡上的數(shù)字電荷耦合器件(Charge Coupled Device, CCD)攝像機(jī)監(jiān)測(cè)微粒的運(yùn)動(dòng).微粒溶液和緩沖液由注射泵(KDS 210P/KDS Legato 200, KD Scientific., USA)注入微流道入口.函數(shù)信號(hào)發(fā)生器(DG4162, RIGOL., China)用于在芯片上施加交變電場(chǎng),電壓放大器(2340, TEGAM., USA)可以放大交變電場(chǎng)的電壓值.至此,介電泳微粒分選的測(cè)試系統(tǒng)搭建完成.

3.3 測(cè)試結(jié)果

圖5為當(dāng)微粒與緩沖液的流速均為1μL/min,流體電導(dǎo)率為18μS/cm時(shí),100kHz的不同電平的交變電壓下的9.9μm微粒運(yùn)動(dòng)軌跡.零電平時(shí),微粒從Outlet 2中流出；隨著電平的增加,微粒的運(yùn)動(dòng)軌跡向Outlet 1偏移；當(dāng)電平有效值為20Vrms時(shí),大部分的9.9μm微粒從Outlet 1中流出,此時(shí)微粒的分選效率為72.6%.

圖5 9.9μm聚苯乙烯微粒在流體流速為1μL/min,流體電導(dǎo)率為18μS/cm,不同電平有效值的100kHz的交變電場(chǎng)下的運(yùn)動(dòng)軌跡Fig.5 9.9μm green fluorescent particle trajectories varying with AC voltage, when velocity of particle solution and buffer solution is 1μL/min, buffer solution conductivity is 18μS/cm, the frequency is 100kHz

與仿真結(jié)果相比,測(cè)試中的微粒分選電壓上升,產(chǎn)生該問題的主要原因是COMSOL軟件中的芯片模型為簡(jiǎn)化模型,而實(shí)驗(yàn)中的硅襯底則具有一定的摻雜濃度,介電常數(shù)降低,同時(shí)制備的三維電極中存在缺陷.綜上所述,實(shí)驗(yàn)中的微粒分選電壓要大于仿真中的電壓值.

4 結(jié) 語

本文提出了集成有與流體完全隔離的三維電極的介電泳芯片模型.首先在COMSOL仿真軟件中對(duì)芯片外加交變電場(chǎng)時(shí)的10μm微粒的分選性能進(jìn)行了仿真研究.之后利用集成電路工藝完成了芯片的制備,并將其用于微粒的實(shí)際分選測(cè)試中.當(dāng)外加100kHz, 20Vrms的交變電場(chǎng)時(shí),72.6%的9.9μm微粒從Outlet 1中流出,完成分選.