利用epiCRISPR載體表達(dá)雙sgRNA實(shí)現(xiàn)高效的HDAC基因編輯

王子實(shí)，李苗苗，王永明

(復(fù)旦大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，上海 200438)

基因編輯技術(shù)(genome editing)是在基因組水平上對(duì)DNA進(jìn)行修飾的遺傳操作技術(shù).目前最常用的基因組編輯技術(shù)是CRISPR(Clustered regularly interspaced short palindromic repeats)/Cas9技術(shù)[1].CRISPR/Cas9系統(tǒng)包括2個(gè)元件，分別是具有核酸內(nèi)切酶活性的Cas9蛋白和向?qū)NA(guide RNA, gRNA).gRNA是將crRNA和tracrRNA融合得到的，其中crRNA負(fù)責(zé)識(shí)別靶序列，tracrRNA負(fù)責(zé)結(jié)合Cas9蛋白[2].當(dāng)gRNA和Cas9蛋白結(jié)合后，gRNA序列就會(huì)將Cas9蛋白引導(dǎo)至和其序列互補(bǔ)的基因組區(qū)域，使得Cas9蛋白和目標(biāo)基因組序列結(jié)合，并切斷基因組DNA產(chǎn)生雙鏈斷裂(double-strand break, DSB)[3].細(xì)胞內(nèi)修復(fù)DNA雙鏈斷裂的2種主要途徑分別是非同源末端連接(nonhomologous end joining, NHEJ)和同源重組(homologous recombination, HDR)[4].前者經(jīng)常引起堿基的缺失或者插入(indel)，后者會(huì)精確地改造基因組序列[5-6].使用CRISPR/Cas9技術(shù)進(jìn)行基因敲除主要是通過NHEJ途徑實(shí)現(xiàn)的，NHEJ引發(fā)的indel會(huì)造成目標(biāo)基因發(fā)生移碼突變，其概率為2/3.純合敲除細(xì)胞系的構(gòu)建要求目標(biāo)基因的所有拷貝都發(fā)生移碼突變.理論上對(duì)于雙倍體細(xì)胞基因組，2個(gè)等位基因都發(fā)生indel引發(fā)的移碼突變的概率是(2/3)2.而如果目標(biāo)基因在基因組中存在多個(gè)拷貝，則編輯后構(gòu)建純合敲除細(xì)胞系的概率就進(jìn)一步降低為(2/3)n(n是基因拷貝數(shù)).所以拷貝數(shù)越多，敲除難度越大.

傳統(tǒng)的基因編輯技術(shù)使用普通的質(zhì)粒表達(dá)Cas9和gRNA，是瞬時(shí)表達(dá)系統(tǒng).質(zhì)粒隨著細(xì)胞的傳代擴(kuò)增而被稀釋，使得Cas9和gRNA在細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)水平下降，進(jìn)而降低了基因編輯的效率.為了克服上述缺點(diǎn)，本實(shí)驗(yàn)室使用附著體載體(episomal vector)表達(dá)Cas9和gRNA，稱為epiCRISPR系統(tǒng)[7].附著體載體可以在真核細(xì)胞中擴(kuò)增[8]，能夠長(zhǎng)期表達(dá)外源基因.epiCRISPR除了表達(dá)Cas9和gRNA，還表達(dá)嘌呤霉素抗性基因，在藥物的篩選下，能夠富集轉(zhuǎn)染成功的細(xì)胞，提高獲得純合敲除細(xì)胞系的效率.同時(shí)附著體載體不整合到基因組中，編輯完成后，撤除篩選藥物，質(zhì)粒會(huì)很快丟失，細(xì)胞不再表達(dá)外源基因.利用epiCRISPR技術(shù)，可以實(shí)現(xiàn)平均80%以上的indel效率.

利用CRISPR/Cas9編輯基因時(shí)，編輯不一定會(huì)造成基因功能喪失.盡管基因編輯可能會(huì)導(dǎo)致多種形式的DNA序列改變，包括堿基置換和indel.但堿基置換可能并不會(huì)造成氨基酸的改變；即使氨基酸發(fā)生了改變，如果不是重要功能域的氨基酸，也不會(huì)使基因功能喪失.indel一般在幾十個(gè)堿基以內(nèi)，如果長(zhǎng)度是3的倍數(shù)，會(huì)造成氨基酸數(shù)量的改變，但不一定會(huì)造成移碼突變.敲除基因的有效方法是在基因編碼區(qū)前端進(jìn)行編輯，當(dāng)indel長(zhǎng)度不是3的倍數(shù)時(shí)，會(huì)造成移碼突變，蛋白的翻譯提前終止，進(jìn)而導(dǎo)致功能喪失.如果在基因上設(shè)計(jì)2個(gè)gRNA，它們中間刪除的長(zhǎng)度不是3的倍數(shù)，會(huì)增加移碼突變的概率[9].設(shè)計(jì)2個(gè)gRNA還有另外一個(gè)優(yōu)點(diǎn)，不同gRNA的活性差異很大，2個(gè)gRNA中的一個(gè)活性高就可以敲除基因，如果2個(gè)活性都高，敲除效率會(huì)更高.

HDAC全稱是組蛋白去乙酰化酶(histone deacetylase)，其主要功能是對(duì)染色質(zhì)中的組蛋白去乙?；?，與DNA復(fù)制、修復(fù)以及染色質(zhì)結(jié)構(gòu)都有密切的關(guān)聯(lián)[10].HDAC在生物體內(nèi)和很多基因的表觀遺傳狀態(tài)有關(guān)[11]，是阿爾茨海默癥等神經(jīng)退行性疾病[12]以及黑色素瘤[13]，乳腺癌[14]等多種癌癥的潛在治療位點(diǎn)[15].HDAC家族包含11個(gè)基因，分別在不同的代謝過程中負(fù)責(zé)組蛋白的去乙?；?，是一個(gè)作用廣泛、功能多樣的基因家族.因此，構(gòu)建HDAC純合敲除細(xì)胞系對(duì)于研究HDAC基因家族的功能是十分必要的.在本研究中，我們通過敲除HDAC家族基因探討附著體載體表達(dá)雙gRNA系統(tǒng)的有效性.一方面可以快速構(gòu)建HDAC基因家族純合敲除細(xì)胞系，為將來研究HDAC家族基因功能鋪墊良好的基礎(chǔ).另一方面，本實(shí)驗(yàn)還可以從技術(shù)層面對(duì)結(jié)合使用epiCRISPR技術(shù)和雙gRNA技術(shù)的基因敲除效果進(jìn)行驗(yàn)證.

1 材料和方法

1.1 材料

本文中使用的細(xì)胞系為神經(jīng)膠質(zhì)瘤母細(xì)胞癌細(xì)胞系SK-N-BE(2)和HeLa細(xì)胞.轉(zhuǎn)化用的大腸桿菌E.coliDH5α來源于TIANGEN.所有實(shí)驗(yàn)用到的限制性內(nèi)切酶均來源于NEB.PCR引物合成以及DNA測(cè)序由Genewiz蘇州分公司完成.Western blot使用抗體來自Abcam，Santa-Cruz以及CST.

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)

神經(jīng)膠質(zhì)瘤母細(xì)胞癌細(xì)胞系SK-N-BE(2)，培養(yǎng)基使用MEM(Gibco)+10% F12(Gibco)+10% FBS(Gibco)，培養(yǎng)條件37℃，5% CO2.HeLa細(xì)胞系，培養(yǎng)基使用DMEM(Gibco)+10% FBS(Gibco)，培養(yǎng)條件37℃，5% CO2.2種細(xì)胞均使用Thermo Nunclon系列一次性細(xì)胞培養(yǎng)皿進(jìn)行培養(yǎng).

1.2.2 CRISPR/Cas9系統(tǒng)gRNA以及基因編輯檢測(cè)PCR引物的設(shè)計(jì)

質(zhì)粒構(gòu)建過程中使用的所有內(nèi)切酶以及連接酶均來源于NEB.使用http:∥crispr.mit.edu： 8079/?網(wǎng)址提供的gRNA設(shè)計(jì)工具，在目標(biāo)基因的外顯子區(qū)域設(shè)計(jì)臨近的2段gRNA作為實(shí)驗(yàn)使用的gRNA.并且在gRNA目標(biāo)區(qū)域附近設(shè)計(jì)PCR引物，用以在PCR后使用T7E1(NEB)酶切檢測(cè)編輯效率.表1(見第414頁(yè))展示了實(shí)驗(yàn)中使用的gRNA以及相應(yīng)的PCR連接引物以及檢測(cè)引物.引物名稱中數(shù)字代表gRNA間距.

1.2.3 轉(zhuǎn)染試劑與細(xì)胞轉(zhuǎn)染

轉(zhuǎn)染試劑： 轉(zhuǎn)染試劑使用Lipofectamine?2000(Invitrogen).

轉(zhuǎn)染流程： 細(xì)胞鋪板，當(dāng)細(xì)胞覆蓋培養(yǎng)皿底部60%～70%時(shí)進(jìn)行轉(zhuǎn)染.對(duì)于常見的6孔板培養(yǎng)的細(xì)胞轉(zhuǎn)染而言： 樣品1，使用150mL Opti-MEM(Gibco)與5μL Lipo 2000(Invitrogen)充分混合.樣品2： 150mL Opti-MEM(Gibco)與2000ng待轉(zhuǎn)染質(zhì)粒充分混合，樣品1，樣品2在各自室溫靜置5min后充分混合到一起，再次室溫靜置20min.之后將混合樣品均勻滴加至細(xì)胞培養(yǎng)皿內(nèi)部.輕微搖晃培養(yǎng)皿使轉(zhuǎn)染試劑與培養(yǎng)基混勻.轉(zhuǎn)染17～20h后，更換新鮮的培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)，并使用相應(yīng)的藥物對(duì)細(xì)胞進(jìn)行篩選.

1.2.4 單克隆細(xì)胞分選與培養(yǎng)

開始轉(zhuǎn)染為第0天.在使用藥物篩選10天后，使用細(xì)胞計(jì)數(shù)法對(duì)編輯后的細(xì)胞進(jìn)行稀釋分選，確保96孔板(Thermo)平均每孔中有一個(gè)細(xì)胞.在第15天觀察每孔中實(shí)際細(xì)胞數(shù)量和細(xì)胞存活情況，確認(rèn)真正的單克隆數(shù)量.第20天后將生長(zhǎng)正常的單克隆進(jìn)行傳代，能夠存活到2次傳代以上的單克隆可以認(rèn)為是一個(gè)穩(wěn)定的單克隆.

表1 HDAC基因家族純合敲除細(xì)胞建立過程中使用的gRNA以及PCR引物

1.2.5 單克隆細(xì)胞編輯效果測(cè)序鑒定

根據(jù)基因組上的序列，在目標(biāo)基因的編輯位點(diǎn)附近根據(jù)巢式PCR原則設(shè)計(jì)檢測(cè)PCR引物.并使用Genome Quick Extraction(Epicentre)試劑回收第20天單克隆細(xì)胞基因組.使用設(shè)計(jì)好的PCR引物對(duì)提取的單克隆基因組進(jìn)行PCR，得到編輯后的目標(biāo)基因序列(500～700bp長(zhǎng)度)的PCR產(chǎn)物.再通過的pGEM-T Easy T(ProMega)載體連接系統(tǒng)將PCR產(chǎn)物連接到T載體上.使用TIANGEN產(chǎn)E.coliDH5α將連接產(chǎn)物進(jìn)行轉(zhuǎn)化擴(kuò)增，并通過T載體測(cè)序結(jié)果確認(rèn)單克隆的編輯情況.測(cè)序結(jié)果使用Vector NTI軟件進(jìn)行序列比對(duì).

1.2.6 Western blot

使用SDS-PAGE檢測(cè)基因敲除前后HDAC基因家族的蛋白表達(dá)水平.電泳完成后使用轉(zhuǎn)膜儀(BioRad)進(jìn)行轉(zhuǎn)膜.之后使用封閉液(1×TBS+0.5% Tween)進(jìn)行封閉，封閉完成后加入一抗(表2)，再加入二抗進(jìn)行雜交(表2)，最后使用顯色液(Tanon)進(jìn)行顯色.

表2 HDAC基因家族蛋白分子量及Western blot中使用的抗體

2 結(jié)果與分析

2.1 含有雙gRNA的epiCRISPR質(zhì)粒的設(shè)計(jì)與構(gòu)建

本實(shí)驗(yàn)中使用的CRISPR-Cas9質(zhì)粒是自行設(shè)計(jì)的epiCRISPR質(zhì)粒，其基本結(jié)構(gòu)如圖1所示.其中，hU6啟動(dòng)子起始gRNA的轉(zhuǎn)錄；EFS啟動(dòng)子起始Cas9、嘌呤霉素抗性基因(puro)和綠色熒光蛋白基因(GFP)的轉(zhuǎn)錄，這3個(gè)基因位于同一個(gè)閱讀框內(nèi)，由2A片段隔開.EBNA1是基因組黏附元件，可以將質(zhì)粒黏附于基因組上，使得質(zhì)粒伴隨著基因組的復(fù)制而復(fù)制，提高質(zhì)粒的表達(dá)效率[8].

圖1 含有雙gRNA的epiCRISPR系統(tǒng)Fig.1 The epiCRISPR system contains two gRNAs(a) 含有雙gRNA的CRISPR系統(tǒng)的構(gòu)建；(b) 雙gRNA插入測(cè)序確認(rèn).

我們發(fā)明了在一個(gè)epiCRISPR質(zhì)粒上連接2個(gè)gRNA的方法.質(zhì)粒上有2個(gè)BspQ1酶切位點(diǎn)，位于hU6和tracrRNA之間.如圖1所示，在這個(gè)地方插入crRNA1-tracr-hU6-crRNA2序列，就可以表達(dá)2個(gè)完整的gRNA.為了實(shí)現(xiàn)這個(gè)目的，我們?cè)O(shè)計(jì)了一個(gè)中間載體，含有tracr-hU6序列.再設(shè)計(jì)一對(duì)與tracr-hU6序列匹配的引物，分別含有crRNA1和crRNA2，同時(shí)都含有BspQ1酶切位點(diǎn).經(jīng)過PCR擴(kuò)增就得到了crRNA1-tracr-hU6-crRNA2序列，酶切后就可以連接到epiCRISPR質(zhì)粒上了.

為了進(jìn)一步提高epiCRISPR質(zhì)粒系統(tǒng)的基因敲除效率，我們對(duì)原有的epiCRISPR系統(tǒng)進(jìn)行了改造.目的是在epiCRISPR質(zhì)粒上同時(shí)表達(dá)2個(gè)gRNA，進(jìn)一步提高系統(tǒng)的基因編輯能力.由于Cas9蛋白本身沒有使CRISPR序列成熟的核酸酶功能，必需借助RNAseⅢ的幫助才能切割串聯(lián)的CRISPR序列(等效于串聯(lián)的gRNA+tracr序列)，使串聯(lián)的CRISPR成熟，形成可以和Cas9蛋白結(jié)合的gRNA序列[3].所以不能簡(jiǎn)單地通過前后串聯(lián)2個(gè)gRNA來實(shí)現(xiàn)不同的gRNA表達(dá).對(duì)于外源的CRISPR/Cas9系統(tǒng)而言，為了形成不同的gRNA，必須使用不同的外源啟動(dòng)子單獨(dú)起始表達(dá)不同的gRNA.因此我們?cè)谠術(shù)RNA插入位置插入了gRNA1+hU6啟動(dòng)子+gRNA2的片段，形成了2個(gè)hU6啟動(dòng)子分別負(fù)責(zé)gRNA1和gRNA2的轉(zhuǎn)錄.這樣我們?cè)谝粋€(gè)質(zhì)粒上就實(shí)現(xiàn)了2種gRNA的同時(shí)表達(dá)(圖1).

我們?cè)O(shè)計(jì)的gRNA有如下特點(diǎn)： (1) 2個(gè)gRNA之間的堿基數(shù)量不是3的倍數(shù)(表1)，如果中間的部分被切掉后，準(zhǔn)確地連接在一起能夠形成移碼突變；(2) 2個(gè)gRNA距離很近，都在一個(gè)外顯子上，用一對(duì)引物就可以檢測(cè)編輯的結(jié)果.

為了證明epiCRISPR系統(tǒng)結(jié)合雙gRNA確實(shí)能夠增加基因編輯的效率，我們?cè)O(shè)計(jì)了一組對(duì)照實(shí)驗(yàn).分別使用含有EBNA1元件和雙gRNA的質(zhì)粒1以及含有同樣雙gRNA但是不含有EBNA1元件的質(zhì)粒2(圖2(a))同時(shí)轉(zhuǎn)染HeLa細(xì)胞，按照1.2節(jié)中步驟分別取轉(zhuǎn)染后第5天和第10天樣品進(jìn)行編輯效率檢測(cè).檢測(cè)結(jié)果如圖2(b)所示.可以看出在第5天的時(shí)候，質(zhì)粒1和質(zhì)粒2的編輯效率沒有明顯區(qū)別(lane 2和4).但是經(jīng)過藥物篩選后的第10天，含有EBNA1的質(zhì)粒1由于質(zhì)粒本身能夠隨著細(xì)胞基因組復(fù)制，因此分裂后的細(xì)胞依然繼承了抗性，因此隨著篩選時(shí)間的增加，編輯效率也隨之增加(lane 3).而不含有EBNA1元件的質(zhì)粒2轉(zhuǎn)染的細(xì)胞由于質(zhì)粒丟失，細(xì)胞會(huì)逐漸被抗性藥物殺死(圖2(c)).雖然第10天的編輯效率才59%(圖2(b)lane 3)，但是事實(shí)上，由于我們的系統(tǒng)使用的是雙gRNA，根據(jù)之前的文獻(xiàn)[9]研究結(jié)果，使用臨近的雙gRNA對(duì)目標(biāo)基因組進(jìn)行編輯的時(shí)候，有較高的概率會(huì)恰好將2個(gè)gRNA中間的片段完全去除，也就是說使用臨近的雙gRNA編輯的結(jié)果中有很多完全相同的編輯，這些相同的結(jié)果會(huì)被T7檢測(cè)誤判為未編輯.也就是說第10天的編輯結(jié)果要遠(yuǎn)大于59%.

圖2 EBNA1元件增強(qiáng)基因編輯效率Fig.2 EBNA1 enhances gene editing efficiency(a) 質(zhì)粒1和質(zhì)粒2結(jié)構(gòu)示意圖；(b) 基因編輯效率檢測(cè).1. DNA ladder 1000；2. 質(zhì)粒1第5天；3. 質(zhì)粒1第10天；4. 質(zhì)粒2第5天；5. 陰性對(duì)照，野生型基因編輯效率檢測(cè)；(c) 抗性篩選第10天細(xì)胞拍照，不含有EBNA1元件的細(xì)胞由于質(zhì)粒丟失已經(jīng)完全被抗性藥物殺死(bar=500μm).

2.2 HDAC1純合敲除細(xì)胞系的構(gòu)建

HDAC1作為HDAC基因家族的成員之一，在真核生物基因表達(dá)的調(diào)控中起重要作用.HDAC1蛋白是組蛋白乙?；瘡?fù)合體的成分之一[16].并且，HDAC1能夠增強(qiáng)肺上皮細(xì)胞對(duì)于A型流感病毒的抵抗[17].HDAC1和肺癌的發(fā)生發(fā)展存在重要的關(guān)聯(lián)[18]，HDAC1的敲除對(duì)于食道癌的治療也有積極的意義[19].因此，我們嘗試使用結(jié)合了雙gRNA設(shè)計(jì)的epiCRISPR系統(tǒng)建立HDAC1純合敲除細(xì)胞系.

根據(jù)圖3(a)所示流程，我們將質(zhì)粒轉(zhuǎn)染到了神經(jīng)膠質(zhì)瘤母細(xì)胞癌細(xì)胞系SK-N-BE(2)中.轉(zhuǎn)染20h后加入puromycin進(jìn)行篩選，篩選后第10天進(jìn)行單克隆分選，之后培養(yǎng)至第20天，選擇能夠穩(wěn)定傳代的細(xì)胞系進(jìn)行測(cè)序和Western blot分析.

從實(shí)驗(yàn)結(jié)果(圖3(c)，(d))中可以看出，使用含有雙gRNA的epiCRISPR系統(tǒng)敲除HDAC1基因，在得到的7個(gè)單克隆中，有3個(gè)是純合敲除的單克隆(Clone 5，6，7).測(cè)序結(jié)果為野生型的Clone1，2，4在對(duì)應(yīng)的Western blot泳道中存在明顯的HDAC1蛋白條帶.測(cè)序結(jié)果為純合敲除的Clone 5和6在對(duì)應(yīng)泳道中沒有HDAC1蛋白的條帶.而另一個(gè)測(cè)序結(jié)果為純合敲除的Clone 7則表現(xiàn)為部分敲除，可能是因?yàn)镃lone 7的敲除并不完全，HDAC1仍然有部分表達(dá)(圖3).純合敲除的細(xì)胞生長(zhǎng)極其緩慢，說明這個(gè)基因?qū)?xì)胞生長(zhǎng)很重要.一部分克隆在培養(yǎng)中死掉，推測(cè)也是純合敲除造成的結(jié)果.

圖3 HDAC1純合敲除細(xì)胞系的建立Fig.3 The screening of HDAC1 homozygous knockout(a) HDAC基因家族純合敲除細(xì)胞系篩選流程示意圖；(b) HDAC1雙gRNA設(shè)計(jì)以及檢測(cè)引物位置；(c) 單克隆測(cè)序結(jié)果展示；(d) 單克隆Western blot檢測(cè).紅色框標(biāo)明純合敲除，藍(lán)色框標(biāo)是雜合敲除.

2.3 HDAC2純合敲除細(xì)胞系的構(gòu)建

與HDAC1類似，HDAC2是組蛋白乙?；瘡?fù)合體的另一個(gè)主要成分[16].HDAC2對(duì)很多癌癥的耐藥性都具有重要的影響，如對(duì)卵巢癌[20]和結(jié)腸癌[21]對(duì)化療藥物的敏感性都具有重要作用.

和HDAC1一樣，按照?qǐng)D3(a)的流程進(jìn)行單克隆篩選，測(cè)序之后進(jìn)行Western blot驗(yàn)證(圖4，見第418頁(yè)).實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，和HDAC1類似，使用含有雙gRNA的epiCRISPR系統(tǒng)進(jìn)行HDAC2純合敲除，篩選的效率也比較高，10個(gè)單克隆中得到了2個(gè)純合敲除細(xì)胞系(Clone 8,10)，這2個(gè)細(xì)胞系對(duì)應(yīng)的Western blot結(jié)果沒有HDAC2蛋白條帶，說明這2個(gè)單克隆做到了HDAC2基因的完全敲除.另外還得到了2個(gè)雜合敲除細(xì)胞系(Clone 7,9).相對(duì)于野生型細(xì)胞系，雜合敲除的細(xì)胞系中HDAC2蛋白表達(dá)量存在明顯的下降(圖4(d)).純合敲除的細(xì)胞也是生長(zhǎng)極其緩慢.

2.4 HDAC3純合敲除細(xì)胞系的構(gòu)建

和HDAC1與HDAC2不同，HDAC3并不是組蛋白乙?；瘡?fù)合體的主要組成部分，HDAC3主要在各種炎癥因子相關(guān)的生物反應(yīng)中起作用.HDAC3在風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎相關(guān)的炎癥反應(yīng)中調(diào)節(jié)炎癥基因的表達(dá)[22].HDAC3在吸煙引發(fā)的胰腺癌中也具有誘導(dǎo)和促進(jìn)胰腺癌細(xì)胞增殖的作用[23].同時(shí)HDAC3也是一些發(fā)育過程的必要基因，例如，HDAC3是造血干細(xì)胞前體細(xì)胞DNA復(fù)制的必要調(diào)節(jié)基因[24].

但是按照?qǐng)D3(a)流程，我們無(wú)法得到一個(gè)穩(wěn)定傳代的HDAC3純合敲除SK-N-BE(2)細(xì)胞系(圖5，見第418頁(yè)).存活單克隆的測(cè)序結(jié)果全部為野生型.之后，為了驗(yàn)證這個(gè)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，我們使用HeLa細(xì)胞按照?qǐng)D3(a)流程進(jìn)行同樣的HDAC3基因敲除實(shí)驗(yàn)，也無(wú)法得一個(gè)HDAC3純合敲除HeLa細(xì)胞系(數(shù)據(jù)未展示).考慮到HDAC3在生物體內(nèi)以調(diào)控炎癥相關(guān)基因并調(diào)節(jié)一些發(fā)育過程中重要前體細(xì)胞的增殖[24]，并且有文獻(xiàn)顯示使用Cre重組酶條件敲除HDAC3會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞分裂S期異常以及DNA損傷修復(fù)異常，進(jìn)而導(dǎo)致細(xì)胞死亡[25].而使用類似技術(shù)在小鼠神經(jīng)系統(tǒng)中敲除HDAC3的結(jié)果顯示絕大部分小鼠在出生后24h內(nèi)死亡[26].基于以上結(jié)果，我們認(rèn)為HDAC3是一個(gè)純合敲除致死基因，或者嚴(yán)格地說，至少對(duì)于SK-N-BE(2)細(xì)胞和HeLa細(xì)胞而言，HDAC3是一個(gè)純合敲除致死基因.

圖4 HDAC2純合敲除細(xì)胞系的建立Fig.4 The screening of HDAC2 homozygous knockout(a) HDAC2雙gRNA設(shè)計(jì)以及檢測(cè)引物位置；(b) 單克隆測(cè)序結(jié)果展示；(c) 單克隆Western blot檢測(cè).紅色框標(biāo)明是純合敲除，藍(lán)色框標(biāo)明是雜合敲除.

圖5 HDAC3純合敲除細(xì)胞系的建立Fig.5 The screening of HDAC3 homozygous knockout(a) HDAC3雙gRNA設(shè)計(jì)以及檢測(cè)引物位置；(b) 純合敲除單克隆測(cè)序結(jié)果舉例.

2.5 HDAC6純合敲除細(xì)胞系的構(gòu)建

和HDAC1，HDAC2不同，HDAC6也不是組蛋白乙?；瘡?fù)合體的組成部分，它主要在細(xì)胞防御與病毒介導(dǎo)方面起作用[27].HDAC6的過量表達(dá)往往會(huì)促進(jìn)癌細(xì)胞的增殖，并增強(qiáng)癌細(xì)胞對(duì)于化療藥物的抵抗，這種作用在惡性膠質(zhì)瘤[28]和肺腺體癌[29]中都有過相關(guān)報(bào)道.

和HDAC1類似，我們同樣按照?qǐng)D3(a)的流程對(duì)HDAC6基因進(jìn)行純合敲除單克隆篩選，測(cè)序之后也進(jìn)行Western blot驗(yàn)證(圖6).實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，使用含有雙gRNA的epiCRISPR系統(tǒng)進(jìn)行HDAC6純合敲除，在一輪篩選中得到的5個(gè)單克隆中，有2個(gè)是純合敲除細(xì)胞單克隆.這依然是一個(gè)非常高的比例.

圖6 HDAC6純合敲除細(xì)胞系的建立Fig.6 The screening of HDAC6 homozygous knockout(a) HDAC6雙gRNA設(shè)計(jì)以及檢測(cè)引物位置；(b) 單克隆測(cè)序結(jié)果展示；(c) 單克隆Western blot檢測(cè).紅色框標(biāo)明是純合敲除，藍(lán)色框標(biāo)明的是雜合敲除.

3 討 論

本實(shí)驗(yàn)利用epiCRISPR表達(dá)雙gRNA的技術(shù)，在SK-N-BE(2)細(xì)胞系中對(duì)HDAC基因家族進(jìn)行敲除，目的是高效的得到HDAC基因家族純合敲除細(xì)胞系.有報(bào)道表明，如果2個(gè)gRNA的位置毗鄰的話，則有較大的概率會(huì)使得DNA在斷裂處發(fā)生平末端連接而不是indel[30]，導(dǎo)致2個(gè)gRNA之間的片段丟失，造成移碼突變.并且由于2個(gè)臨近的gRNA往往設(shè)計(jì)在同一個(gè)外顯子上，即使沒有片段丟失，2個(gè)gRNA造成閱讀框發(fā)生錯(cuò)位突變的概率也遠(yuǎn)大于單獨(dú)一個(gè)gRNA.

HDAC基因家族作為表觀遺傳學(xué)中重要的調(diào)節(jié)基因，通過對(duì)組蛋白乙?；降恼{(diào)節(jié)影響多種基因的表達(dá)，進(jìn)而參與多種細(xì)胞功能，如細(xì)胞增殖，細(xì)胞凋亡等，這使得HDAC基因家族成為多種疾病的潛在治療靶點(diǎn).因此，快速有效的建立HDAC基因家族純合敲除細(xì)胞系，是進(jìn)一步研究HDAC基因家族的生物學(xué)功能的必要基礎(chǔ).

最終的實(shí)驗(yàn)結(jié)果中，HDAC1，HDAC2和HDAC6都得到了符合預(yù)期的純合敲除細(xì)胞系，并且純合敲除的比例高達(dá)40%.這個(gè)比例和單獨(dú)的epiCRISPR實(shí)驗(yàn)[8]以及雙gRNA敲除實(shí)驗(yàn)[9]相比，有了明顯的提高，說明epiCRISPR和雙gRNA敲除這兩種技術(shù)的結(jié)合可以有效地提高獲得純合敲除單克隆的概率.

值得指出的是，我們目前采取的流程是先得到一個(gè)穩(wěn)定遺傳的細(xì)胞系再進(jìn)行測(cè)序確認(rèn).在實(shí)際的操作中，我們發(fā)現(xiàn)很多單克隆在生長(zhǎng)和傳代的過程中逐漸死亡.這部分死亡的單克隆并沒有在統(tǒng)計(jì)結(jié)果中體現(xiàn).推測(cè)這一中途死亡的單克隆里面有較大部分是純合子，而雜合子和野生型的單克隆并不容易死亡.這就導(dǎo)致了我們目前的統(tǒng)計(jì)結(jié)果中，純合子的比例要低于實(shí)際編輯結(jié)果.因此，如果不考慮HDAC3，目前使用帶有雙gRNA的epiCRISPR質(zhì)粒得到的單克隆中，有接近40%的比例是純合敲除.

與家族中其他基因不同，實(shí)驗(yàn)中HDAC3依然沒有得到穩(wěn)定遺傳的細(xì)胞系.雖然有部分HDAC3純合敲除細(xì)胞系在進(jìn)行單克隆分選的時(shí)候能夠存活，但是無(wú)一例外的，這些細(xì)胞系都沒有辦法穩(wěn)定傳代，形成可用的單克隆.因此，我們認(rèn)為，至少對(duì)于SK-N-BE(2)細(xì)胞系和HeLa細(xì)胞系而言，HDAC3是一個(gè)純合致死基因.

在本研究中，我對(duì)HDAC家族基因進(jìn)行了敲除實(shí)驗(yàn)，高效快速地得到了HDAC家族基因的純合敲除細(xì)胞系.考慮到CRISPR系統(tǒng)本身的廣泛應(yīng)用性，這種將epiCRISPR系統(tǒng)和雙gRNA技術(shù)結(jié)合起來的方法也能夠適用于其他基因的敲除，可以用于快速構(gòu)建多種基因的純合敲除細(xì)胞系，極大地?cái)U(kuò)展了本實(shí)驗(yàn)技術(shù)的應(yīng)用范圍.